격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca²⁺ 및 해당 수축성의 실시간 평가

9주에서 13주 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐는 상업 판매상에서 구입했습니다. 도착 후, 모든 쥐는 표준 실험실 식단에 따라 UAMS(University of Arkansas for Medical Sciences) DLAM(Division of Lab Animal Medicine) 시설에 수용 및 관리되었으며 25 °C에서 12시간의 빛:어둠 주기에 노출되었습니다. 모든 절차는 UAMS의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 사용 프로토콜 #4127에 따라 수행되었습니다. 1. 장간막 LV의 절개 및 캐뉼레이션 참고: 장간막 LV를 분리하기 전에 관류 챔버를 설정하여 실험을 방해할 수 있는 흐름 중단이나 누출이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 관류 목욕 준비상용 공급업체에서 붕규산 유리 마이크로피펫(외경 1.2mm, 내경 0.68mm, 외부 팁 직경 75-100μm로 당김)을 구입하십시오. 마이크로피펫(일명 캐뉼라)을 약 1-2cm 길이로 자르고 연마하여 격리된 용기 관류 챔버에 장착합니다. 용기 관류 챔버에 장착된 각 유리 캐뉼라를 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 독립적인 중력 공급 압력 조절기에 따라 위치한 독립적인 압력 변환기에 연결합니다.참고: 이를 통해 연구 설계에 따라 유입 및 유출 압력을 독립적으로 조작할 수 있습니다. 그림 1 은 이 설정을 자세히 보여줍니다. 생리염 용액(PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO3; 1.17 mMNaH2PO4; 4.7 mM KCl; 1.17 mM MgSO4; 5.5 mM C6H12O6 (포도당); 0.026 mM C10H16N2O8 (EDTA); 및 1.6 mM CaCl2) 기포가 없습니다. 그런 다음 캐뉼라에 압력이 가해지지 않도록 압력을 고정하십시오.참고: 이 용액의 pH는 ~7.5입니다. 단계 1.3.7에 설명된 대로 PSS 내의 중탄산염 완충 시스템에 작용하기 위해 CO2 버블링을 사용하여 관류 수조에서 7.4의 pH를 유지합니다. EDTA는 여기에서 과도한 Ca2+ 이온을 킬레이트화하는 데 사용됩니다. 매듭의 준비꼰 실크 봉합사(크기 8-0)를 사용하여 현미경 아래에서 이중 오버핸드 매듭을 묶습니다. 주요 단계는 그림 2에 나와 있습니다.단일 필라멘트를 분리합니다. 끝이 미세무딘 Dumont #5 겸자 두 개를 사용하고 한 겸자를 사용하여 다른 겸자의 끝 부분을 이중 고리로 만듭니다. 고리가 있는 집게를 사용하여 봉합사의 느슨한 끝을 잡고 매듭을 완전히 닫히고 작은 구멍을 남기지 않도록 두 고리를 통해 당깁니다. Vanna 스프링 가위를 사용하여 양쪽에서 과도한 봉합사를 자릅니다. 나중에 이 매듭을 사용하여 LV를 캐뉼라에 고정합니다.알림: 매듭을 묶는 동안 겸자 팁이 손상될 위험이 더 높기 때문에 절개하거나 캐뉼레이션할 동일한 겸자를 사용하지 마십시오. 장간막 LV의 분리 및 캐뉼레이션1.5 L/min O2 과다 복용과 함께 5% 이소플루란을 투여하여 동물을 깊이 마취하고 참수로 출혈시킵니다. 먼저 복벽의 정중선을 따라 세로로 절단하고 장간막을 외부로 만든 다음 유문 괄약근 바로 아래의 연결부와 맹장 위의 ~2-3cm의 연결부와 직장과의 연결을 잘라내어 장간막 LV를 해부를 위해 전체 장간막을 분리합니다. 200mL의 얼음처럼 차가운 PSS로 절개된 장간막 전체를 세척한 다음 얼음처럼 차가운 PSS가 들어 있는 실리콘 라이닝(8-10mm) 페트리 접시(100mm)로 옮겨 핀으로 고정합니다. 실체현미경을 사용하여 주변 지방 및 결합 조직에서 2차 장간막 LV를 절제하고 Dumont #5 Inox 미세 겸자 및 Vanna 스프링 가위를 절개합니다. 조직에서 제거된 LVs의 끝부분을 식별하는 데 도움이 되도록 LV의 근위 끝에 작은 지방 조각을 남겨 두십시오. 유리 캐뉼라에서 캐뉼레이션을 위해 절개된 LV를 용기 관류 챔버로 옮깁니다. 림프 흐름의 방향을 모방하기 위해 P1 캐뉼라(유입)에 있는 LV의 말단 말단(유입)과 P2 캐뉼라(유출)에 있는 혈관의 근위 끝과 함께 LV를 캐뉼레이트하기 위해 두 개의 미리 연마된 Dumont #5 Inox Fine Forceps, 직선 팁(0.05 x 0.01mm)을 사용합니다.알림: P1 및 P2 캐뉼러는 동일하며 LV의 끝이 연결되는 방식만 다릅니다. 얇은 혈관 벽을 쉽게 잡을 수 있도록 팁에서 완벽하게 만나고 손상 없이 집게를 사용하는 것이 중요합니다.미리 묶인 단일 매듭을 각 유리 캐뉼라에 밀어 넣어 나중에 용기를 캐뉼라에 고정합니다. LV 방향을 잡는 데 도움이 되는 작은 지방 조각을 사용하여 먼저 말단 끝을 P1에 캐뉼레이션합니다. 매듭을 캐뉼라 아래로 밀어 넣고 조여 LV를 고정합니다. 캐뉼라 팁을 과도하게 조이거나 부러뜨리지 않도록 하십시오. 관류 챔버에서 LV를 4-5mm Hg로 가압합니다.알림: 우리의 목적을 위해 P1 및 P2 압력을 동일하게 설정합니다. 그러나 실험 조건에 따라 각 캐뉼라에서 압력을 조정하여 전단 응력 또는 역류를 유도할 수 있습니다. 1.3.6.1-1.3.6.4 단계를 반복하여 LV의 근위 끝을 P2에 캐뉼레이팅합니다. 이산화탄소(CO2) 7%/산소(O2) 7%가 함유된 버블링스톤을 욕실에 넣어 생리적 pH를 유지합니다. 챔버를 온도 조절기에 연결하고 LV의 경우 37oC로 설정하여 안정적이고 자발적인 수축을 평형화하고 발달시킵니다(약 30분).참고: 그림 1 은 이 설정을 자세히 보여줍니다. 2. LVs에서 [Ca2+]i 의 절대 농도 측정 캐뉼레이션 LV의 Fura-2AM 염색자발적인 수축이 발생한 후(단계 1.3.8에서) LV를 Fura-2-acetoxymethyl ester(Fura-2AM, 2 μM 또는 10 μL/5 mL) 및 pluronic acid(PA; 0.02% W/V 또는 5 μL/5 mL of 20% PA)로 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.알림: Fura-2AM을 추가한 후 나머지 모든 단계는 어둠 속에서 수행해야 합니다. 30분 후, 음압 진공으로 전체 수조 부피를 비우고 온도 일치(37 oC) 시약이 없는 PSS로 교체하여 관류 챔버의 용액을 3번 교체합니다.알림: LV가 공중에 떠 있는 시간을 최소화하려면 이 작업을 신속하게 수행해야 합니다. 예를 들어, 오른손은 진공용으로, 왼손은 시약이 없는 새로운 PSS를 교체할 때 양손을 사용합니다. 세척 후 LV를 어두운 곳에서 15분 동안 배양하여 과도한 지시약을 제거하고 탈에스테르화를 허용합니다. Ca 포획2+ Fluorescence and Vessel Diameter (형광 및 용기 직경)챔버를 LED 광원, 20x S Fluor 대물렌즈, 세포 프레이밍 어댑터, 15Hz에서 프레임별 형광 캡처가 가능한 고속 CMOS 비디오 카메라 시스템이 장착된 도립 형광 현미경 스테이지로 옮깁니다.참고: 이 워크플로우 설정의 개략도는 그림 3에 나와 있습니다. Ca2+ 신호는 최소 15fps의 CCD 카메라를 사용하여 캡처할 수 있습니다. 이미징 소프트웨어가 장착된 컴퓨터에 현미경을 연결하여 형광 및 가장자리 감지를 기록합니다.참고: 참조된 소프트웨어는 동시 압력 기록도 가능하게 합니다. 그러나 여기에는 포함되지 않습니다. LED 광원과 형광등 시스템 인터페이스를 켭니다.참고: 여기에 설명된 소프트웨어 지침은 참조된 소프트웨어에 대한 것이지만 다른 소프트웨어를 사용하여 이 데이터를 얻을 수 있습니다. 소프트웨어(IonWizard)를 엽니다. 파일 탭에서 새로 만들기를 선택합니다. Collect(수집) 탭에서 Experiment(실험)를 선택합니다. 원하는 실험 템플릿을 로드하고 OK를 클릭합니다.참고: 측정할 매개변수가 있는 실험 템플릿을 설정해야 합니다. 템플릿 설정에 대한 지침은 소프트웨어 설명서29에서 찾을 수 있습니다. 화면의 트레이스를 조정하여 Vessel Diameter, Numerator (340 신호), Denominator (380 신호) 및 Ratio 를 내림차순으로 확인합니다. 필요에 따라 y축 배율을 조정하여 추적을 시각화하는 데 도움이 됩니다.Traces(추적)에서 Edit User Limits(사용자 제한 편집)를 선택합니다. Automatic Limits(자동 제한)가 선택 취소되어 있는지 확인합니다. 조정할 매개변수를 선택하고 축의 최소값과 최대값을 입력한 다음 확인을 선택합니다. 실험을 시작하려면 화면 하단의 시작 을 클릭합니다. LV 직경을 동시에 측정하려면 이미징 시스템에 통합된 가장자리 감지 소프트웨어를 사용하여 3Hz에서 LV의 수축 흔적을 생성합니다. 이 측정값을 사용하여 섹션 3에 설명되어 있고 그림 4에 표시된 수축 및 리듬 매개변수를 분석합니다.LV 벽이 어두운 선으로 보이도록 조명을 조정하십시오. 지방과 이물질이 없는 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 실험이 시작된 후에는 이 ROI를 이동하지 마십시오. 전체 수축 주기 동안 선박 벽 가장자리가 감지되도록 임계값이 설정되어 있는지 확인하십시오. 형광 측정을 위해 광전자 증배관(PMT)을 켭니다. LED 조명기를 사용하여 50ms 노출에서 340nm 및 380nm 파장을 번갈아 가며 비율계량 지표인 Fura-2를 자극하고 전체 이미징 필드에 걸쳐 15Hz에서 510nm의 방출 스펙트럼을 캡처합니다.참고: 재현 가능한 Ca2+ 측정값을 얻기 위해 전체 실험 시리즈에서 모든 광학 매개변수(excitation settings, emission filter, objective lens 및 dichroic mirrors)를 동일하게 유지하는 것이 중요합니다. 먼저 시야(신호) 중앙에서 LV로 340 및 380 형광을 얻은 다음 스테이지 매니퓰레이터를 사용하여 시야를 용기 없이 수조 가장자리로 이동하여(실리콘 라이닝 가장자리를 피하거나 수조에서 이물질을 제거하여) 배경을 캡처합니다.알림: Ca2+ 측정을 위해 매번 용기의 원래 부분으로 다시 이동하는 것이 중요합니다. 수조 용액을 온도에 맞는 시약이 없는 PSS로 교체하여 수조의 초과 지시약을 제거합니다. 과도한 Fura-2를 제거하기 위해 여러 번의 bath 교환이 필요할 수 있으므로 신호 대 배경 비율이 약 10:1이 될 때까지 이 교환을 반복합니다. 약 30분 동안 기준선 Fura-2 형광 신호와 자발적 수축을 기록한 후 전압 종속 Cav1.x 길항제인 니페디핀(NIF, 0.1-100nM)의 누적 농도 반응을 기록합니다. 각 약물 농도에 대한 배경 측정값을 얻습니다. 각 실험이 끝나면 온도에 맞는 Ca2+가 없는 PSS로 LV를 세척하여 Ca2+가 없는 경우 LV의 최소 Fura-2 형광 신호(Rmin) 및 최대 직경을 얻습니다. 배경을 측정해야 합니다.참고: Ca2+-free PSS는 PSS와 조성은 동일하지만 CaCl2 가 없으며 EDTA는 1mM EGTA (C14H24N2O10) (pH ~ 7.5)로 대체됩니다. 10mMCa2+ 및 ionomycin(10μM IONO),Ca2+ ionophore를 포함하는 온도 일치 PSS와 수조 용액을 교환하여 최대 Fura-2 형광 신호(Rmax) 및 Ca2+ 포화 조건에서 LV의 최소 직경을 얻습니다. 배경을 측정해야 합니다. 절대 [Ca2+]i를 측정하는 공식Rmin 및 Rmax 를 사용하여 340 및 380 nm 파장의 비율을 보정하고 절대 세포질이 없는 Ca2+ 농도([Ca2+]i)를 계산합니다. 방정식 (1)26을 사용하여 절대 세포질 유리 Ca2+ 농도([Ca2+]i)를 계산합니다.(1)여기서 Kd = 225 nM (Fura-2에 대한 해리 상수) 26, R = 340/380 비율, Ra2+가없는 경우R min = 340/380 비율, 포화 Ca2 + 조건에서의 Rmax = 340/380 비율, Ca2+가없는 경우 Sfree = 380 신호, Sbound = 포화 Ca2 + 조건이있는 380 신호알림: 모든 형광 신호는 배경 형광에 대해 보정되었습니다. 그림 5는 기록되는 매개변수를 자세히 설명하는 Ca2+ 추적의 예입니다. 기준선 Ca2 +를 Ca2 + 스파이크 이전의 가장 낮은 휴식 Ca2 +로 정의하고 피크 Ca2 +를 Ca2 + 스파이크 동안 달성 된 가장 높은 Ca2 +로 정의합니다. 진폭은 피크와 기준선 Ca2+의 차이입니다. Ca2+ 스파이크의 수로 오프라인에서 계산되는 Ca2+ 스파이크의 빈도를 제외한 모든 매개변수를 이미징 소프트웨어에서 직접 내보냅니다. 다음은 이러한 매개변수를 얻기 위한 참조된 소프트웨어 내의 주요 단계입니다.알림: 전체 트레이스를 .txt 파일로 내보낼 수 있으며 선택한 소프트웨어에서 모든 매개변수를 분석하거나 계산할 수 있습니다. Rmin의 경우 Ca2+-free PSS 중 배경에 해당하는 Numerator 추적 섹션을 강조 표시합니다. 대화 상자가 열리고 추적의 이 부분에 대한 값이 제공됩니다. Operations(작업)에서 Constants(상수)를 선택합니다. Calcium-Numeric background를 선택하고 이전 단계의 Numerator 및 Denominator에 대한 배경 번호를 입력합니다. 확인을 클릭합니다. Ca2+-free PSS 동안 가장 낮은 비율에 해당하는 비율 추적 섹션을 강조 표시합니다. 이것은 Rmin입니다. 또한 이 섹션의 Denominator 값을 기록해 둡니다. 이것은 S무료입니다. 높은 Ca2+ 자유 PSS 및 가장 높은 비율에 해당하는 추적 섹션과 함께 Rmax 및 Sbound에 대해 2.3.4-2.3.7 단계를 반복합니다. Operations(작업)에서 Constants(상수)를 선택합니다. Calcium-Calcium Calibration을 선택하고 방정식 1에 나열된 값을 입력합니다. 확인을 클릭합니다. 2.2.8단계에 설명된 대로 화면의 추적 중 하나를 조정하여 Calcium-Numeric에서 Calcium을 뺀 것을 볼 수 있습니다. Monotonic Transient Analysis를 수행하여 나머지 파라미터를 획득합니다. 이에 대한 지침은 소프트웨어 설명서30에서 찾을 수 있습니다. 또는 내보내기에서 현재 추적을 선택합니다. .txt 파일을 내보낼 위치를 선택하고 확인을 클릭합니다.참고: 내보내려는 개별 추적을 클릭해야 합니다. 전체 추적 또는 추적의 선택한 섹션을 내보낼 수 있습니다. 3. LV 수축성 및 리듬성 측정 이미징 시스템에 통합된 가장자리 감지 소프트웨어는 위에서 설명한 대로 LV 직경 측정을 위한 수축 추적을 생성합니다. 이러한 측정값을 사용하여 수축 및 리듬 매개변수를 분석할 수 있습니다. 그림 4 는 기록할 수축 매개변수를 자세히 설명하는 수축 추적의 예입니다. Diameter trace30에서 Monotonic Transient Analysis 기능을 사용하여 이미징 소프트웨어에서 직접 수축 빈도, 계산된 흐름 및 간격을 제외한 모든 매개변수를 내보냅니다.알림: 전체 트레이스를 .txt 파일로 내보낼 수 있으며 아래 방정식을 사용하여 선택한 소프트웨어에서 모든 매개변수를 분석하거나 계산할 수 있습니다. EDD, ESD, 진폭, 주파수 및 계산된 유량 측정LV가 리드미컬하고 자발적인 수축 중에 도달할 수 있는 최대 및 최소 직경(각각 이완기 말단경[EDD] 및 말수축기 지름[ESD])을 측정합니다. AMP(amplitude of contractions)를 EDD와 ESD의 차이로 계산합니다. 측정 기간당 수축 횟수(단위: s)로 빈도를 계산합니다. 방정식 (2)를 사용하여 μm당 계산된 유량을 계산합니다.계산된 유량 = π/4(EDD2- ESD2)F (2)여기서 EDD2 = 이완 상태에서의 용기 단면적, ESD2 = 수축 중 용기 단면적 측정, F = 수축 빈도/초 리듬: 수축 및 이완 시간:LV 리듬의 다른 측정은 수축 시간과 이완 시간입니다. 수축 시간을 LV가 각 수축할 때마다 ESD에 도달하는 데 걸리는 시간으로 정의합니다. 이완 시간을 LV가 각 이완에 대해 EDD에 도달하는 데 걸리는 시간으로 정의하며, 이는 특정 시간 프레임 내에서 절대 [Ca2+]i 와 상관 관계가 있는 리듬의 전반적인 표시를 제공합니다. 방정식 (3)에서 구간 시간(ΔT)을 계산합니다.Δt = t2 (ESD2)-t1 (ESD1) (3)