Echtzeit-Auswertung der absoluten, zytosolischen, freien ca²⁺ und der entsprechenden Kontraktilität in isolierten, druckbeaufschlagten Lymphgefäßen

Neun bis 13 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von einem kommerziellen Verkäufer gekauft. Nach ihrer Ankunft wurden alle Ratten in der Einrichtung der University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Division of Lab Animal Medicine (DLAM) untergebracht und unter einer Standard-Labordiät gehalten und 12 Stunden lang einem Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C ausgesetzt. Alle Verfahren wurden gemäß dem genehmigten Tierverwendungsprotokoll #4127 vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der UAMS durchgeführt. 1. Dissektion und Kanülierung mesenterialer LVs HINWEIS: Es ist wichtig, die Perfusionskammer vor der Isolierung der mesenterialen LVs einzurichten, um sicherzustellen, dass es keine Unterbrechung des Flusses oder ein Leck gibt, das das Experiment stören würde. Vorbereitung des PerfusionsbadesKaufen Sie Mikropipetten aus Borosilikatglas (1,2 mm Außendurchmesser, 0,68 mm Innendurchmesser und mit einem Außendurchmesser von 75-100 μm) von einem kommerziellen Händler. Schneiden und polieren Sie Mikropipetten (auch Kanülen genannt) auf eine Länge von ca. 1-2 cm für den Einbau in die isolierte Gefäßperfusionskammer. Verbinden Sie jede montierte Glaskanüle in der Perfusionskammer des Gefäßes mit unabhängigen Druckmessumformern, die in einer Linie mit unabhängigen Schwerkraft-Druckreglern mit Polyethylenschläuchen angeordnet sind.HINWEIS: Dies ermöglicht eine unabhängige Manipulation des Zu- und Abflussdrucks je nach Studiendesign. Abbildung 1 zeigt dieses Setup im Detail. Füllen Sie die Perfusionskammer (5 mL), die Glasmikropipetten und den unabhängigen Schwerkraft-Druckregler zusammen mit dem Polyethylenschlauch mit physiologischer Salzlösung (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO3; 1,17 mM NaH2PO4; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO4; 5,5 mM C6H12O6 (Glukose); 0,026 mMC 10H16N2O8 (EDTA) und 1,6 mM CaCl2) ohne Luftblasen. Klemmen Sie dann den Druck so ein, dass die Kanülen nicht unter Druck stehen.HINWEIS: Der pH-Wert dieser Lösung beträgt ~7,5. Im Perfusionsbad wird ein pH-Wert von 7,4 aufrechterhalten, wobei die CO2 -Blase verwendet wird, um auf das Bikarbonat-Puffersystem innerhalb des PSS zu wirken, wie in Schritt 1.3.7 beschrieben. EDTA wird hier verwendet, um überschüssigeCa2+ -Ionen zu chelatisieren. Vorbereitung der KnotenBinden Sie doppelte Überhandknoten unter dem Mikroskop mit geflochtenem Seidennahtfaden (Größe 8-0). Die wichtigsten Schritte sind in Abbildung 2 dargestellt.Trennen Sie ein einzelnes Filament. Verwenden Sie zwei Dumont #5 Pinzetten mit mikrostumpfen Spitzen und machen Sie mit einer Pinzette eine doppelte Schlaufe um die Spitze der anderen Pinzette. Fassen Sie mit der Schlaufenzange das lose Ende der Naht und ziehen Sie sie durch beide Schlaufen, wobei Sie darauf achten, dass der Knoten nicht vollständig zugezogen wird und eine kleine Öffnung bleibt. Verwenden Sie eine Vanna-Federschere, um überschüssiges Nahtmaterial von beiden Seiten zu schneiden. Verwenden Sie diese Knoten später, um den LV auf den Kanülen zu befestigen.HINWEIS: Verwenden Sie nicht die gleiche Pinzette, mit der Sie präparieren oder kanülieren werden, da die Gefahr besteht, dass die Pinzettenspitzen beim Knotenbinden beschädigt werden. Isolierung und Kanülierung mesenterialer LVsTiere durch Verabreichung eines 5%igen Isoflurans mit einer Überdosierung von 1,5 l/min O2 tief betäuben und durch Enthauptung exsanguinieren. Isolieren Sie ganze Mesenterien für die Dissektion mesenterialer LVs, indem Sie zuerst einen Längsschnitt entlang der Mittellinie der Bauchwand machen, das Mesenterium nach außen stellen und dann die Verbindung knapp unter dem Pylorusschließmuskel und ~2-3 cm über dem Blinddarm sowie die Verbindung zum Rektum abschneiden. Waschen Sie die präparierten ganzen Mesenterien in 200 ml eiskaltem PSS und geben Sie sie dann in eine mit Silikon ausgekleidete (8-10 mm) Petrischale (100 mm), die eiskaltes PSS enthält. Präparieren Sie mesenteriale LVs zweiter Ordnung aus dem umgebenden Fett und Bindegewebe mit einem Stereomikroskop, dissektionieren Sie eine Dumont #5 Inox-Feinzange und eine Vanna-Federschere. Um die Enden der LVs nach der Entfernung aus dem Gewebe zu identifizieren, lassen Sie ein kleines Stück Fett am proximalen Ende der LV. Übertragen Sie die präparierten LVs in die Perfusionskammer des Gefäßes, um sie mit Glaskanülen zu kanülieren. Verwenden Sie zwei vorgeschärfte Dumont #5 Inox-Feinpinzetten mit gerader Spitze (0,05 x 0,01 mm), um LVs mit dem distalen Ende der LV auf der P1-Kanüle (Zufluss) und dem proximalen Ende des Gefäßes auf der P2-Kanüle (Ausfluss) zu kanülieren, um die Richtung des Lymphflusses nachzuahmen.HINWEIS: Die Kanülen P1 und P2 sind identisch und unterscheiden sich nur darin, an welchem Ende des LV angeschlossen wird. Es ist wichtig, eine Pinzette zu verwenden, die perfekt an der Spitze und ohne Beschädigung trifft, um das Greifen der dünnen Gefäßwand zu erleichtern.Schieben Sie einen einzelnen vorgebundenen Knoten auf jede Glaskanüle, um das Gefäß später auf den Kanülen zu befestigen. Verwenden Sie das kleine Stück Fett, um die LV-Richtung zu orientieren, und kanülieren Sie zuerst das distale Ende auf P1. Schieben Sie den Knoten an der Kanüle hinunter und ziehen Sie ihn fest, um die LV zu sichern. Achten Sie darauf, dass Sie die Kanülenspitze nicht zu fest anziehen und brechen. Beaufschlagen Sie die LV in der Perfusionskammer auf 4-5 mm Hg.HINWEIS: Für unsere Zwecke stellen wir den Druck von P1 und P2 auf gleich ein. Abhängig von den Versuchsbedingungen kann der Druck jedoch an jeder Kanüle angepasst werden, um eine Scherspannung oder einen Rückfluss zu induzieren. Die Schritte 1.3.6.1 bis 1.3.6.4 sind zu wiederholen, um das proximale Ende des LV auf P2 zu kanülieren. Legen Sie den sprudelnden Stein mit 7 % Kohlendioxid (CO2)/93 % Sauerstoff (O2) in die Badekammer, um den physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Schließen Sie die Kammer an den Temperaturregler an und stellen Sie sie auf 37 °C ein, damit sich die LVs ausgleichen und stabile, spontane Kontraktionen entwickeln können (ca. 30 Minuten).HINWEIS: Abbildung 1 zeigt dieses Setup im Detail. 2. Messung der absoluten Konzentrationen von [Ca2+]i in LV Fura-2AM-Färbung von kanülierten LVsNachdem sich spontane Kontraktionen entwickelt haben (aus Schritt 1.3.8), inkubieren Sie LVs mit Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2AM; 2 μM oder 10 μL/5 mL) und Pluronsäure (PA; 0,02 % W/V oder 5 μl/5 mL 20 % PA) für 30 min im Dunkeln.HINWEIS: Nach der Zugabe von Fura-2AM müssen alle verbleibenden Schritte im Dunkeln durchgeführt werden. Nach 30 min wird die Lösung in der Perfusionskammer 3x ausgetauscht, indem das gesamte Badvolumen mit einem Unterdruckvakuum entleert und durch temperaturangepasstes (37 °C) reagenzienfreies PSS ersetzt wird.HINWEIS: Dies sollte schnell erfolgen, um die Zeit, in der das LV in der Luft schwebt, zu minimieren. Verwenden Sie beide Hände, z. B. die rechte Hand zum Vakuumieren und die linke Hand zum Ersetzen des neuen reagenzienfreien PSS. Nach dem Waschen die LVs 15 Minuten lang im Dunkeln inkubieren, um den überschüssigen Indikator zu entfernen und eine Entesterung zu ermöglichen. Erfassen von Ca2+ Fluoreszenz und GefäßdurchmesserÜbertragen Sie die Kammer auf den inversen Fluoreszenzmikroskoptisch, der mit einer LED-Lichtquelle, einem 20x S Fluor-Objektiv, einem Cell-Framing-Adapter und einem schnellen CMOS-Videokamerasystem ausgestattet ist, das eine Bild-für-Bild-Fluoreszenzerfassung bei 15 Hz ermöglicht.HINWEIS: Ein Schema dieser Workflow-Einrichtung ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Ca2+ -Signal kann mit einer CCD-Kamera mit mindestens 15 fps erfasst werden. Schließen Sie das Mikroskop an den Computer an, der mit einer Bildgebungssoftware ausgestattet ist, um Fluoreszenz und Kantenerkennung aufzuzeichnen.HINWEIS: Die referenzierte Software ermöglicht auch die gleichzeitige Druckaufzeichnung; Das ist hier jedoch nicht enthalten. Schalten Sie die LED-Lichtquelle und die Schnittstelle des Leuchtstoffsystems ein.HINWEIS: Die hier beschriebenen Softwareanweisungen gelten für die referenzierte Software, aber es kann auch andere Software verwendet werden, um diese Daten zu erhalten. Offene Software (IonWizard). Wählen Sie auf der Registerkarte Datei die Option Neu aus. Wählen Sie auf der Registerkarte “Sammeln ” die Option “Experimentieren” aus. Laden Sie die gewünschte experimentelle Vorlage, und klicken Sie auf OK.HINWEIS: Sie müssen eine experimentelle Vorlage mit den zu messenden Parametern einrichten. Eine Anleitung zur Einrichtung von Vorlagen finden Sie im Software-Handbuch29. Passen Sie die Kurven auf dem Bildschirm so an , dass Gefäßdurchmesser, Zähler (340-Signal), Nenner (380-Signal) und Verhältnis in absteigender Reihenfolge angezeigt werden. Passen Sie die Skalierung der Y-Achse nach Bedarf an, um die Kurven besser visualisieren zu können.Wählen Sie unter Ablaufverfolgungen die Option Benutzerlimits bearbeiten aus. Stellen Sie sicher, dass die Option Automatische Grenzwerte deaktiviert ist. Wählen Sie den Parameter aus, den Sie anpassen möchten, geben Sie die Minimal- und Maximalwerte für die Achse ein, und wählen Sie dann OK aus. Um das Experiment zu starten, klicken Sie auf START (unten auf dem Bildschirm). Um den LV-Durchmesser gleichzeitig zu messen, verwenden Sie die in das Bildgebungssystem integrierte Kantenerkennungssoftware, die kontraktile Spuren von LVs bei 3 Hz erzeugt. Verwenden Sie diese Messungen, um die in Abschnitt 3 beschriebenen und in Abbildung 4 gezeigten Kontraktions- und Rhythmizitätsparameter zu analysieren.Achten Sie darauf, die Beleuchtung so anzupassen, dass die LV-Wand als dunkle Linien erscheint. Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) aus, die frei von Fett und Ablagerungen ist. Nachdem der Test gestartet wurde, verschieben Sie diesen ROI nicht. Stellen Sie sicher, dass der Schwellenwert so eingestellt ist, dass die Behälterwandkante während des gesamten Kontraktionszyklus erkannt wird. Schalten Sie für Fluoreszenzmessungen die Photomultiplier-Röhre (PMT) ein. Stimulieren Sie Fura-2, einen ratiometrischen Indikator, durch Abwechseln von 340 und 380 nm Wellenlängen in 50 ms Belichtung mit LED-Beleuchtungen und erfassen Sie die Emissionsspektren bei 510 nm bei 15 Hz über das gesamte Bildgebungsfeld.HINWEIS: Es ist wichtig, alle optischen Parameter (Anregungseinstellungen, Emissionsfilter, Objektiv und dichroitische Spiegel) für eine ganze Reihe von Experimenten gleich zu halten, um reproduzierbare Ca2+ -Messungen zu erhalten. Messen Sie das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, indem Sie zuerst die Fluoreszenz 340 und 380 mit dem LV in der Mitte des Sichtfeldes (Signal) erhalten und dann mit den Tischmanipulatoren das Sichtfeld ohne Gefäß an den Rand des Bades verschieben (wobei darauf zu achten ist, dass der mit Silikon ausgekleidete Rand vermieden wird und/oder indem Sie Schmutz aus dem Bad entfernen), um den Hintergrund einzufangen.HINWEIS: Es ist wichtig, jedes Mal zum ursprünglichen Abschnitt des Schiffes zurückzukehren, um Ca2+ Messungen durchzuführen. Tauschen Sie die Badlösung durch temperaturangepasstes, reagenzienfreies PSS aus, um den Überschussindikator im Bad zu entfernen. Es können mehrere Badwechsel erforderlich sein, um überschüssiges Fura-2 zu entfernen, also wiederholen Sie diesen Austausch, bis das Signal-Hintergrund-Verhältnis etwa 10:1 beträgt. Aufzeichnung des Fura-2-Fluoreszenzsignals und spontaner Kontraktionen zu Studienbeginn für etwa 30 Minuten, gefolgt von einer kumulativen Konzentrationsreaktion von Nifedipin (NIF; 0,1-100 nM), einem spannungsabhängigen Ca-v-1.x-Antagonisten. Erhalten Sie Hintergrundmessungen für jede Arzneimittelkonzentration. Am Ende jedes Experiments werden LVs mit temperaturangepasstem Ca2+-freiem PSS gewaschen, um das minimale Fura-2-Fluoreszenzsignal (Rmin) und den maximalen Durchmesser der LVs in Abwesenheit von Ca2+ zu erhalten. Achten Sie darauf, den Hintergrund zu messen.HINWEIS: Das Ca2+-freie PSS hat die gleiche Zusammensetzung wie PSS, jedoch ohne CaCl2, und EDTA wird durch 1 mM EGTA (C14H24N2O10) (pH ~7,5) ersetzt. Tauschen Sie die Badlösung durch temperaturangepasstes PSS aus, das 10 mMCa2+ und Ionomycin (10 μM IONO), ein Ca2+ -Ionophor, enthält, um das maximale Fura-2-Fluoreszenzsignal (Rmax) und den minimalen Durchmesser der LVs unter Bedingungen der Sättigung von Ca2+ zu erhalten. Achten Sie darauf, den Hintergrund zu messen. Die Formel zur Messung des absoluten [Ca2+]iVerwenden Sie Rmin und Rmax , um das Verhältnis von 340 und 380 nm Wellenlängen zu kalibrieren und die absolute zytosolische freie Ca2+ -Konzentration ([Ca2+]i) zu berechnen. Berechnen Sie die absolute zytosolische freie Ca2+ -Konzentration ([Ca2+]i) mit Hilfe von Gleichung (1)26:(1)Dabei ist Kd = 225 nM (Dissoziationskonstante für Fura-2)26, R = 340/380 Verhältnis, Rmin = 340/380 Verhältnis in Abwesenheit von Ca2+, Rmax = 340/380 Verhältnis bei Sättigung Ca2+ Bedingungen, Sfrei = 380 Signal in Abwesenheit von Ca2+, Sgebunden = 380 Signal bei Sättigung Ca2+ BedingungenHINWEIS: Alle Fluoreszenzsignale wurden um Hintergrundfluoreszenz korrigiert. Abbildung 5 ist ein Beispiel für eine Ca2+ -Ablaufverfolgung, in der detailliert beschrieben wird, welche Parameter aufgezeichnet werden. Definieren Sie den Ausgangswert von Ca2+ als den niedrigsten ruhendenCa-2+ -Anstieg vor demCa-2+ -Spike und den Ca2 +-Spitzenwert als den höchstenCa-2+ -Peak, der während desCa-2+ -Spikes erreicht wurde. Die Amplitude ist die Differenz zwischen Peak und Baseline Ca2+. Exportieren Sie alle Parameter direkt aus der Imaging-Software, mit Ausnahme der Häufigkeit von Ca2+ Spikes, die offline als Anzahl der Ca2+ Spikes/s berechnet werden soll. Im Folgenden finden Sie die wichtigsten Schritte innerhalb der referenzierten Software, um diese Parameter zu erhalten.HINWEIS: Ganze Traces können in eine .txt Datei exportiert werden und alle Parameter können in der Software Ihrer Wahl analysiert oder berechnet werden. Markieren Sie fürR min den Abschnitt der Zähler-Ablaufverfolgung, der dem Hintergrund während der Ca2+-freien PSS entspricht. Es öffnet sich ein Dialogfeld, in dem die Werte für diesen Teil der Ablaufverfolgung angegeben werden. Wählen Sie unter Vorgänge die Option Konstanten aus. Wählen Sie Calcium-Numerischer Hintergrund und geben Sie die Hintergrundnummern für den Zähler und Nenner aus dem vorherigen Schritt ein. Klicken Sie auf OK. Markieren Sie den Abschnitt der Verhältnis-Verfolgung, der dem niedrigsten Verhältnis während der Ca2+-freien PSS entspricht. Das ist Rmin. Notieren Sie sich auch den Nennerwert für diesen Abschnitt. das istS frei. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.4 bis 2.3.7 für Rmax und Sgebunden an den Abschnitt der Ablaufverfolgung, der dem hohen Ca2+ -freien PSS und dem höchsten Verhältnis entspricht. Wählen Sie unter Vorgänge die Option Konstanten aus. Wählen Sie Calcium-Calcium-Kalibrierung und geben Sie die in Gleichung 1 aufgeführten Werte ein. Klicken Sie auf OK. Passen Sie eine der Ablaufverfolgungen auf dem Bildschirm an, wie in Schritt 2.2.8 beschrieben, so dass Sie Calcium-Numeric subtrahiertes Calcium sehen können. Führen Sie eine monotone transiente Analyse durch, um die verbleibenden Parameter zu ermitteln. Eine Anleitung dazu finden Sie im Software-Handbuch30. Alternativ können Sie unter Exportieren die Option Aktuelle Ablaufverfolgung auswählen. Wählen Sie den Speicherort aus, an den Sie die .txt Datei exportieren möchten, und klicken Sie auf OK.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie auf den einzelnen Trace klicken, den Sie exportieren möchten. Sie können die gesamte Ablaufverfolgung oder ausgewählte Abschnitte der Ablaufverfolgung exportieren. 3. Messung der LV-Kontraktilität und Rhythmizität Die in das Bildgebungssystem integrierte Kantenerkennungssoftware generiert kontraktile Kurven für LV-Durchmessermessungen, wie oben beschrieben. Verwenden Sie diese Messungen, um kontraktile und rhythmische Parameter zu analysieren. Abbildung 4 ist ein Beispiel für eine kontraktile Spur, die detailliert beschreibt, welche kontraktilen Parameter aufgezeichnet werden sollen. Exportieren Sie alle Parameter direkt aus der Bildgebungssoftware mit der Funktion Monotone Transient Analysis auf der Durchmesserkurve30, mit Ausnahme der Häufigkeit der Kontraktionen, der berechneten Strömung und des Intervalls, die offline berechnet werden sollen.HINWEIS: Ganze Kurven können in eine .txt Datei exportiert werden, und alle Parameter können in der Software Ihrer Wahl mit den folgenden Gleichungen analysiert oder berechnet werden. EDD-, ESD-, Amplituden-, Frequenz- und berechnete DurchflussmessungenMessen Sie den maximalen und minimalen Durchmesser (enddiastolischer Durchmesser [EDD] bzw. endsystolischer Durchmesser [ESD]), den die LVs während ihrer rhythmischen und spontanen Kontraktionen erreichen können. Berechnen Sie die Amplitude der Kontraktionen (AMP) als Differenz zwischen EDD und ESD. Berechnen Sie die Häufigkeit als Anzahl der Kontraktionen pro Messperiode (in s). Berechnen Sie den berechneten Durchfluss pro μm mit Hilfe von Gleichung (2):Berechneter Durchfluss = π/4(EDD2- ESD2)F (2)Dabei ist EDD2 = Querschnittsfläche des Gefäßes im entspannten Zustand, ESD2 = Maß für die Querschnittsfläche des Schiffes während der Verengung, F = Häufigkeit der Kontraktionen/n Rhythmizität: Kontraktions- und Entspannungszeit:Andere Maße für die LV-Rhythmizität sind die Kontraktionszeit und die Entspannungszeit. Definieren Sie die Kontraktionszeit als die Zeit, die das LV benötigt, um bei jeder Kontraktion ESD zu erreichen. Definieren Sie die Relaxationszeit als die Zeit, die der LV benötigt, um den EDD für jede Relaxation zu erreichen, was einen Gesamthinweis auf die Rhythmizität gibt, die mit absolutem [Ca2+]i innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens korreliert. Berechnen Sie die Intervallzeit (ΔT) aus Gleichung (3).Δt = t2 (ESD2)-t1 (ESD1) (3)