Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen
Summary
Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.
Abstract
Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) sind ein bemerkenswertes Werkzeug zur Untersuchung des zentralen Nervensystems (ZNS). Innovative Kapside, wie z. B. AAV. PHP.eB, zeigen eine ausgedehnte Transduktion des ZNS durch intravenöse Injektion bei Mäusen. Um eine vergleichbare Transduktion zu erreichen, ist ein 100-fach höherer Titer (mindestens 1 x 1011 Genomkopien/Maus) im Vergleich zur direkten Injektion in das ZNS-Parenchym erforderlich. In unserer Gruppe ist die AAV-Produktion, einschließlich AAV. PHP.eB setzt auf adhärente HEK293T Zellen und die dreifache Transfektionsmethode. Das Erreichen hoher AAV-Ausbeuten mit adhärenten Zellen erfordert einen arbeits- und materialintensiven Prozess. Diese Einschränkung veranlasste die Entwicklung eines Protokolls für suspensionsbasierte Zellkulturen in konischen Röhrchen. AAVs, die in adhärenten Zellen erzeugt wurden, wurden mit der Suspensionsherstellungsmethode verglichen. Kulturen in Suspension mit Transfektionsreagenzien Polyethylenimin oder TransIt wurden verglichen. AAV-Vektoren wurden durch Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt, gefolgt von Pufferaustausch und Konzentration mit einem Zentrifugalfilter. Mit der adhärenten Methode erreichten wir insgesamt durchschnittlich 2,6 x 1012 Genomkopien (GC), während die Suspensionsmethode und Polyethylenimin insgesamt 7,7 x 1012 GC und TransIt insgesamt 2,4 x 1013 GC ergaben. Es gibt keinen Unterschied in der In-vivo-Transduktionseffizienz zwischen Vektoren, die mit Adhärent hergestellt wurden, im Vergleich zum Suspensionszellensystem. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein auf Suspensionszellen HEK293-Zellen basierendes AAV-Produktionsprotokoll eingeführt wird, das zu einem geringeren Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion führt und gleichzeitig eine 3- bis 9-mal höhere Ausbeute mit Komponenten erzielt, die von kommerziellen Anbietern für Forschungszwecke erhältlich sind.
Introduction
Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wurde 1965 entdeckt und seitdem in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt1. AAVs wurden in der neurowissenschaftlichen Forschung eingesetzt, um Gen- und neuronale Funktionen zu untersuchen, Neuroschaltkreise zu kartieren oder Tiermodelle für Krankheitenherzustellen 2. Traditionell geschieht dies durch Injektion direkt an der interessierenden Stelle, da die meisten natürlichen Serotypen die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden oder dafür eine hohe Dosis benötigen 1,2,3.
Mit der Entdeckung von AAV. PHP.B4 und Kapside der nächsten Generation wie AAV. PHP.eB5 und AAV. CAP-B106 ist es möglich, das Zentralnervensystem (ZNS) mit einer einfachen systemischen Injektion anzugreifen. Die räumliche Kartierung zeigt die Zellen, auf die AAV abzielt. PHP.eB auf zellulärer Ebene 6,7. In Kombination mit spezifischen Promotoren/Enhancern bieten diese Kapside Neurowissenschaftlern umfangreiche Möglichkeiten, Gene und Gehirnfunktionen durch nicht-invasive AAV-Verabreichung zu untersuchen 4,8.
Während für AAV eine niedrigere Dosis erforderlich ist. PHP.eB (typischerweise 1 bis 5 x 1011 Genomkopien (GC)/Maus) im Vergleich zu AAV9 (4 x 1012 GC/Maus)7, es muss noch mehr Vektor hergestellt werden als bei Direktinjektionsstrategien (typischerweise 1 x 109 GC/μl Injektion). Die meisten natürlichen Serotypen können mit dem klassischen adhärenten Zellkultursystem in Kombination mit der Iodixanol-Aufreinigung hergestellt werden 9,10,11,12. Für AAV. PHP.eB Dies beinhaltet einen arbeitsintensiven Prozess zum Kultivieren und Transfizieren von Zellen, um genügend Vektoren für ein Experiment zu erhalten8. Daher wurde die Herstellung von AAV in Suspensionszellkultur in konischen Röhrchen entwickelt. Konische Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von bis zu 300 ml sind kompakt und sparen sowohl Platz im Inkubator als auch Kunststoff. Suspensionszellen sind in großen Mengen viel einfacher zu kultivieren und zu handhaben als adhärente Zellen auf 15-cm-Platten. Die Transfektionskomponenten des Protokolls bleiben gleich. Daher können Plasmide, die zuvor mit dem adhärenten System verwendet wurden, problemlos in diesem Protokoll verwendet werden, basierend auf der Produktion in Suspensionszellen. Das Protokoll wurde erfolgreich auf andere Forscher im Labor übertragen und erfolgreich für verschiedene Kapside und Konstrukte verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die systemische Verabreichung von AAV ist ein wirksames Werkzeug für den Gentransfer in das ZNS; Die Herstellung von AAV ist jedoch ein teurer und mühsamer Prozess. Durch die Verwendung von Suspensionszellen werden Arbeitsaufwand und Kunststoffe im Vergleich zur adhärenten Kultur von HEK293T auf 15 cm2 Platten reduziert. Darüber hinaus sind die hier implementierten konischen Röhrchen einfach zu handhaben und maximieren die Nutzung des Laborraums. Das Protokoll wurde von zwei Forschern erstellt und anschli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Forschungsfonds der Königlich Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (KNAW) und einen Zuschuss von Start2Cure (0-TI-01) unterstützt. Wir danken Leisha Kopp für ihren Input und ihre Beratung bei der Erstellung des Protokolls. Die Figuren wurden mit Biorender erstellt.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
Referências
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
