基于大肠杆菌的互补测定研究热休克蛋白的伴侣功能 70
Summary
该方案证明了热休克蛋白70（Hsp70）的伴侣活性。 大肠杆菌 dnaK756 细胞可作为测定的模型，因为它们含有天然的、功能受损的 Hsp70，使其容易受到热应激的影响。功能性 Hsp70 的异源引入挽救了细胞的生长缺陷。
Abstract
热休克蛋白 70 （Hsp70） 是一种保守的蛋白质，可促进细胞内其他蛋白质的折叠，使其成为分子伴侣。虽然 Hsp70 对于在正常条件下生长的大 肠杆菌 细胞不是必需的，但这种伴侣对于在高温下生长是必不可少的。由于 Hsp70 是高度保守的，因此研究来自不同物种的 Hsp70 基因伴侣功能的一种方法是在大肠杆菌菌株中异源表达它们，这些 菌 株要么缺乏 Hsp70，要么表达功能受损的天然 Hsp70。 大肠杆菌 dnaK756 细胞不能支持噬菌体 DNA。此外，它们的天然 Hsp70 （DnaK） 表现出升高的 ATP 酶活性，同时表现出对 GrpE（Hsp70 核苷酸交换因子）的亲和力降低。因此， 大肠杆菌 dnaK756 细胞在 30 °C 至 37 °C 的温度范围内充分生长，但它们在高温 （>40 °C） 下死亡。出于这个原因，这些细胞可作为研究 Hsp70 伴侣活性的模型。在这里，我们描述了应用这些细胞进行互补测定的详细方案，从而能够研究 Hsp70 的纤维素 伴侣功能。
Introduction
热休克蛋白通过促进蛋白质折叠、防止蛋白质聚集和逆转蛋白质错误折叠，发挥着分子伴侣的重要作用 1,2。热休克蛋白 70 （Hsp70） 是最突出的分子伴侣之一，在蛋白质稳态中起着核心作用 3,4。DnaK 是大肠杆菌 Hsp70 同源物5。
已经开发了各种生物物理、生化和基于细胞的测定法来探索 Hsp70 的伴侣活性并筛选靶向该伴侣的抑制剂 6,7,8。Hsp70 是一种高度保守的蛋白质。出于这个原因，据报道，几种真核生物的 Hsp70，例如恶性疟原虫（疟疾的主要病原体）可替代大肠杆菌中的 DnaK 功能 6,9。通过这种方式，开发了一种基于大肠杆菌的互补测定法，涉及大肠杆菌中Hsp70s的异源表达，以探索其细胞保护功能。通常，该测定涉及利用缺乏 DnaK 或表达功能受损的天然 DnaK 的大肠杆菌细胞。虽然DnaK在正常条件下对大肠杆菌的生长不是必需的，但当细胞在高温或其他形式的压力等压力条件下生长时，它变得至关重要10,11。
使用互补测定法研究 Hsp70 功能的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌 dnaK103 （BB2393 [C600 dnaK103（Am） thr：：Tn10]） 和大肠杆菌 dnaK756。大肠杆菌 dnaK103 细胞产生无功能的截短 DnaK，因此，细胞在 30 °C 下充分生长，而菌株对冷和热应激敏感12,13。同样，大肠杆菌 dnaK756/BB2362 （dnaK756 recA：：TcR Pdm1,1） 菌株不会在 40 °C以上生长 14,15。大肠杆菌 dnaK756 菌株表达突变的天然 DnaK （DnaK756），其特征是在 32、455 和 468 位点有三种甘氨酸到天冬氨酸的取代，导致蛋白稳态结果受损。因此，该菌株对噬菌体λ DNA14具有抗性。此外，大肠杆菌 dnaK756 表现出升高的 ATP 酶活性，而其对核苷酸交换因子 GrpE 的亲和力降低16。大肠杆菌DnaK突变菌株可作为通过互补方法研究Hsp70伴侣活性的理想模型。由于 DnaK 仅在压力条件下是必需的，因此互补测定通常在高温下进行（图 1）。使用大肠杆菌进行这项研究的一些优点包括其表征良好的基因组、快速生长以及培养和维护的低成本17。
在本文中，我们详细描述了一种涉及使用大肠杆菌 dnaK756 细胞来研究 Hsp70 功能的方案。我们在测定中使用的 Hsp70 是野生型 DnaK 及其嵌合衍生物 KPf（由 DnaK 的 ATP 酶结构域与恶性疟原虫 Hsp70-1 6,18 的 C 端底物结合结构域融合组成）。KPf-V436F 被异源表达为阴性对照，因为该突变基本上阻止其结合底物，从而消除其伴侣活性9。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方案证明了 大肠杆菌 dnaK756细胞在探索异源表达的 Hsp70 的伴侣功能方面的效用。该测定可用于筛选 纤维素中靶向 Hsp70 功能的抑制剂。然而，该方法的一个局限性是，在大 肠杆菌 中不能替代 DnaK 的 Hsp70 与该测定不兼容。一些非天然 Hsp70 缺乏翻译后修饰21 可能是它们在 大肠杆菌 系统中缺乏功能的原因。基于酵母的互补测定22可以?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国际遗传工程和生物技术中心（ICGEB）资助号HDI/CRP/012，文达大学研究理事会，资助I595，科学与创新部（DSI）和南非国家研究基金会（NRF）的资助（资助号，75464和92598）授予AS。
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
Referências
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