Создание, поддержание и идентификация стерильных моделей данио-рерио от личинок до ювенильных стадий

Микробиота (т. е. археи, бактерии, эукария и вирусы) играет решающую роль в поддержании здоровья хозяина и способствует развитию различных заболеваний, влияя на физиологические и патологические процессы посредством симбиотических взаимодействий в кишечном барьере, эпителиальной поверхности и функциях муцина у людей ^1,2,3. Состав микробиоты на разных этапах жизни, от младенчества до юности, взрослого возраста и старения, а также ее присутствие в различных местах, таких как ноздри, полость рта, кожа и кишечник, динамически формируется различными средами обитания и средами^{обитания 4}. Кишечная микробиота организмов участвует в усвоении питательных веществ, иммунном ответе, инвазии патогенов, метаболической регуляции и т. д^{. 5,6}. Исследования на пациентах показали, что нарушения микробиоты кишечника связаны с ожирением человека, нарушениями сна, депрессией, воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Паркинсона, Альцгеймера), старением и различными видами рака ^7,8,9. Кроме того, интерактивные пути между микробиотой кишечника и хозяевами включают воспалительные факторы, нейротрансмиттеры, метаболиты, кишечный барьер и окислительный стресс, как наблюдалось в предыдущих исследованиях с использованием моделей мышей и рыб^10,11.

В последнее время было изучено несколько подходов или методов лечения, связанных с бактериями, включая потенциальные пробиотики и трансплантацию фекальной микробиоты (ТФМ), для этих расстройств на клинических и животных моделях. Эти исследования основаны на открытиях, связанных с осью микробиота-кишечник-мозг/печень/почки, продуктами, полученными из микробиоты, и измененной активностью рецепторов^12,13. Однако развитие, различные функции и механизмы системы микробиота-хозяин до сих пор не до конца изучены и идентифицированы из-за сложности микробного сообщества и проблемы создания мощных моделей заболеваний, подобных человеческим.

Для решения этих проблем в середине^19-го века были срочно предложены модели на животных, не содержащие микробов, и в основном они были разработаны в течение^20-го века. Последующие усовершенствования, в том числе модели, обработанные антибиотиками и гнотобиотические модели, наряду с достижениями в технологиях обнаружения и наблюдения за микроорганизмами, еще больше усовершенствовали эти модели 14,15,16. Животные GF, созданные путем стирания своего собственного фона и избегания микробов окружающей среды, предлагают прекрасную стратегию для изучения взаимодействия между микроорганизмами и^{их хозяевами}. Применяя животные модели и усовершенствованные протоколы, исследователи успешно воспроизвели аналогичные микробные составы, обнаруженные у пациентов, у мышей и рыб GF. Кроме того, другие животные модели ГФ, такие как собаки, куры и свиньи, предоставляют различные варианты в качестве объектов исследования 18,19,20,21. Этот подход позволил исследовать потенциальное терапевтическое воздействие комменсальных микробиомов на различные заболевания, включая иммунотерапию рака у людей ^16,18. Модели GF дают более точное представление о характеристиках и механизмах специфической бактериальной колонизации, миграции, размножения и взаимодействия внутри хозяев. Это дает важную новую информацию о возникновении и развитии заболеваний^, связанных с микробиотой^22,23. История создания и применения рыбок данио-рерио в микробных исследованиях развивалась от отчетов Ролза и др. в 2004 году и Бейтса и др. в 2006 году до протокола Меланкона и др. в 2017 году 16,24,25. Тем не менее, осуществимость взрослых или размножающихся моделей GF все еще является длительным процессом, сопровождающимся переменной продолжительностью жизни, показателями успеха и проблемами со здоровьем.

Среди различных животных моделей данио (Danio rerio) выделяется как важнейший инструмент как для фундаментальных, так и для биомедицинских исследований из-за ее выгодного сходства с человеческими органами и геномикой, короткого цикла развития, высокой плодовитости и прозрачных эмбрионов^19,26. Рыбки данио, служащие надежными моделями заболеваний человека, предлагают визуальное представление физиологических и патологических процессов in vivo, давая представление о привлекательных особенностях взаимодействия хозяина и микроба. Примечательно, что рыбки данио демонстрируют различные клеточные линии, что позволяет визуализировать физиологию кишечника, микробную динамику, гонады и репродуктивное развитие, созревание иммунной системы хозяина, поведение и метаболизм²⁷. Эмбрионы данио-рерио развиваются в защитных хорионах до вылупления, становясь личинками через 3 дня после оплодотворения (dpf). Они активно охотятся за пищей при 5 dpf и достигают половой зрелости примерно через 3 месяца после оплодотворения (mpf)²⁸. Первая успешная бесмикробная (GF) рыбка данио, о которой сообщили Rawls et ^al.24, показала, что личинки, которых кормили автоклавным кормом после поглощения желтка, демонстрировали некроз тканей при 8 dpf и полную гибель при 20 dpf. Это указывало на влияние диеты или важность учета экзогенных питательных веществ в экспериментах с участием долгосрочных (>7 dpf) рыб^{GF 29}. Последующие исследования улучшили протокол генерации рыб GF, используя стерильную пищу и методы, усовершенствованные на различных моделях рыб¹⁶.

Тем не менее, большинство исследований на моделях рыбок данио-рерио были сосредоточены на ранних стадиях жизни, включая бактериальную инфекцию при 5 dpf в течение 24-48 часов, с образцами, собранными до 7 dpf по завершении экспериментов 25,30,31. Широко признано, что микробиота организмов, включая людей и рыбок данио, колонизируется в начале жизни и формируется во время роста и развития. Состав остается стабильным на взрослых стадиях, при этом роль микробиоты в организме хозяина имеет решающее значение на протяжении всей жизни, особенно при старении, нейродегенеративном, метаболическом ожирении и кишечных заболеваниях³. Таким образом, взгляды животных с более длительной выживаемостью могут дать представление о механизмах роли микробов в развитии и функциях органов хозяина, учитывая незрелую иммунную и репродуктивную системы личинок рыб в раннем возрасте. В то время как штаммы бактерий в кишечнике рыбок данио были выделены и идентифицированы в предыдущих исследованиях, что дает возможность заражать животные модели GF для выбора пробиотиков или исследования бактериальных функций в организме хозяина^19,25, создание и применение моделей рыб GF в основном ограничивалось ранними стадиями жизни. Это ограничение, связанное со сложным производственным процессом, высокими затратами на содержание и связанными с этим проблемами с питанием и иммунитетом, препятствует исследовательским усилиям, направленным на изучение последствий микробиоты для развития и хронических эффектов микробиоты в организме хозяина.

Выживаемость, поведение, рост, созревание и общее состояние здоровья рыб, особенно в стерильных моделях (GF), значительно зависят от практики кормления, охватывающей потребление и поглощение питательных веществ в течение открытого периода от ранних личинок до молоди^32,33. Однако одной из проблем в рыбоводстве ГФ является нехватка подходящих стерильных рационов, что ограничивает эффективность питательной поддержки для поддержания роста и выживания личинок. Решение этой проблемы имеет решающее значение для восстановления жизни рыб GF, учитывая их защитные механизмы развития и слабые способности к пищеварению из-за отсутствия кишечного микробиома. С точки зрения питания, живая артемия (Artemia sp.) является наиболее подходящей диетой для личинок с открытым ртом и молодью рыб. Было замечено, что рыбы, которых кормили живыми солеными креветками, демонстрируют более высокие показатели роста и выживаемости по сравнению с рыбами, которых кормили вареным яичным желтком или другими натуральными и^{синтетическими} приманками. В то время как ранние модели рыб GF могут выживать при поддержке желтком, а модели личинок GF могут поддерживаться стерильным питанием, создание долгосрочных моделей от личинок до молодых особей и достижение половой зрелости остается сложной задачей. Кроме того, хлопья или порошки ограничены неравномерным питательным составом и могут повлиять на качество воды. Напротив, живая артемия имеет такие преимущества, как выживание как в соленой, так и в пресной воде, небольшой размер, подходящий для личинок и взрослых особей, простота пакетирования и более^{высокое качество} вылупления. Основываясь на предыдущих методах 16,24,30, мы упростили сложный процесс лечения и решили проблему диеты, установив легко инкубируемую живую артемию в качестве стерильного корма в течение более длительного времени, чем рыбы в раннем возрасте.

В этом исследовании представлен оптимизированный протокол, охватывающий (1) поколение, (2) поддержание, (3) идентификацию стерильности и (4) поддержание и кормление для обеспечения роста стерильных рыбок данио (GF) от эмбрионов до личинок и молодых стадий. Результаты дают предварительные данные о вылуплении, выживаемости, росте и стерильности рыбок данио-рерио GF, а также основные показатели GF Artemia sp. в качестве стерильного корма. Подробные этапы создания моделей и приготовления стерильных живых кормов обеспечивают важную техническую поддержку для построения и применения долгосрочных моделей рыб GF, а также GF Artemia sp. в исследованиях взаимодействия микробиоты с хозяином. В протоколе рассматриваются бактериальная изоляция, идентификация и инфекция на моделях рыб GF, описываются методы бактериального флуоресцентного мечения и наблюдение за их колонизацией в кишечнике рыб под микроскопом. Рыбы ГФ, гнотобиотические рыбы с бактериальной инфекцией или перенесенные модели микробиоты человека будут подвергаться различным детекциям, чтобы выяснить их функции и влияние на иммунитет хозяина, пищеварение, поведение, транскриптомную регуляцию и метаболические аспекты. В долгосрочной перспективе этот протокол может быть распространен на различные виды рыб дикого типа, такие как морская медака, и, возможно, на другие выбранные трансгенные линии данио-рерио, связанные с конкретными тканями или заболеваниями.