Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Il microbiota (cioè Archaea, Batteri, Eucarya e virus) svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute dell’ospite e contribuisce allo sviluppo di varie malattie influenzando i processi fisiologici e patologici attraverso interazioni simbiotiche all’interno della barriera intestinale, della superficie epiteliale e delle funzioni della mucina negli individui ^1,2,3. La composizione del microbiota nelle diverse fasi della vita, dall’infanzia alla giovinezza, all’età adulta e all’invecchiamento, nonché la sua presenza in vari luoghi come narici, siti orali, cutanei e intestinali, è modellata dinamicamente da diversi habitat e ambienti⁴. Il microbiota intestinale negli organismi è coinvolto nell’assorbimento dei nutrienti, nella risposta immunitaria, nell’invasione dei patogeni, nella regolazione metabolica, ecc. ^5,6. Studi su pazienti hanno dimostrato che le interruzioni del microbiota intestinale sono correlate all’obesità umana, ai disturbi del sonno, alla depressione, alle malattie infiammatorie intestinali (IBD), alle malattie neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer), all’invecchiamento e a vari tipi di cancro ^7,8,9. Inoltre, i percorsi interattivi tra il microbiota intestinale e gli ospiti coinvolgono fattori infiammatori, neurotrasmettitori, metaboliti, barriera intestinale e stress ossidativo, come osservato in precedenti ricerche utilizzando modelli di topi e pesci^10,11.

Recentemente, sono stati esplorati diversi approcci o terapie correlate ai batteri, inclusi potenziali probiotici e trapianto di microbiota fecale (FMT), per questi disturbi in modelli clinici e animali. Queste esplorazioni si basano su scoperte relative all’asse microbiota-intestino-cervello/fegato/rene, ai prodotti derivati dal microbiota e all’alterazione dell’attività dei recettori^12,13. Tuttavia, lo sviluppo, le varie funzioni e i meccanismi del sistema microbiota-ospite sono ancora incompleti e identificati a causa della complessità della comunità microbica e della sfida di generare potenti modelli di malattia simili a quelli umani.

Per affrontare questi problemi, a metà del^{XIX secolo furono} proposti con urgenza modelli animali privi di germi (GF) e sviluppati principalmente nel corso del XX^secolo. I successivi perfezionamenti, compresi i modelli trattati con antibiotici e gnotobiotici, insieme ai progressi nelle tecnologie di rilevamento e osservazione microbica, hanno ulteriormente perfezionato questi modelli 14,15,16. Gli animali GF, creati cancellando il proprio background ed evitando i microbi ambientali, offrono un’eccellente strategia per esplorare le interazioni tra i microrganismi e i loro ospiti¹⁷. Attraverso l’applicazione di modelli animali e protocolli raffinati, i ricercatori hanno replicato con successo composizioni microbiche simili trovate nei pazienti nei topi e nei pesci GF. Inoltre, altri modelli animali GF, come cani, polli e maiali, forniscono diverse opzioni come soggetti di ricerca 18,19,20,21. Questo approccio ha permesso di studiare i potenziali effetti terapeutici dei microbiomi commensali su varie malattie, tra cui l’immunoterapia del cancro nell’uomo^16,18. I modelli GF offrono informazioni più accurate sulle caratteristiche e sui meccanismi di specifica colonizzazione, migrazione, moltiplicazione e interazione batterica all’interno degli ospiti. Ciò fornisce nuove informazioni cruciali sull’insorgenza e lo sviluppo di malattie correlate al microbiota^22,23. La storia della creazione e dell’applicazione del pesce zebra GF nella ricerca microbica si è evoluta dai rapporti di Rawls et al. nel 2004 e Bates et al. nel 2006 al protocollo di Melancon et al. nel 2017 16,24,25. Tuttavia, la fattibilità di modelli GF adulti o riproduttori è ancora un processo prolungato, accompagnato da longevità, tassi di successo e problemi di salute variabili.

Tra i vari modelli animali, il pesce zebra (Danio rerio) si distingue come uno strumento fondamentale sia per la ricerca di base che per quella biomedica grazie alla sua vantaggiosa somiglianza con gli organi umani e la genomica, il breve ciclo di sviluppo, l’elevata fecondità e gli embrioni trasparenti^19,26. I pesci zebra, che fungono da modelli affidabili di malattie umane, offrono una rappresentazione visiva dei processi fisiologici e patologici in vivo, fornendo informazioni sulle caratteristiche interessanti delle interazioni ospite-microbo. In particolare, il pesce zebra mostra linee cellulari distinte, consentendo l’imaging della fisiologia intestinale, della dinamica microbica, delle gonadi e dello sviluppo riproduttivo, della maturazione del sistema immunitario dell’ospite, del comportamento e del metabolismo²⁷. Gli embrioni di pesce zebra si sviluppano all’interno di corioni protettivi fino alla schiusa, diventando larve a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf). Cercano attivamente cibo a 5 dpf e raggiungono la maturità sessuale circa 3 mesi dopo la fecondazione (mpf)²⁸. Il primo pesce zebra privo di germi (GF) di successo, riportato da Rawls et ^al.24, ha mostrato che le larve alimentate con mangime autoclavato dopo l’assorbimento del tuorlo mostravano necrosi tissutale da 8 dpf e morte totale a 20 dpf. Ciò ha indicato gli effetti della dieta o l’importanza di considerare l’apporto di nutrienti esogeni negli esperimenti che coinvolgono pesci GF a lungo termine (>7 dpf)²⁹. Studi successivi hanno migliorato il protocollo di generazione dei pesci GF, impiegando cibo sterile e metodi perfezionati in diversi modelli di pesce¹⁶.

Tuttavia, la maggior parte della ricerca sui modelli di pesce zebra GF si è concentrata sulle prime fasi di vita, che coinvolgono l’infezione batterica a 5 dpf per 24-48 ore, con campioni raccolti prima di 7 dpf alla conclusione degli esperimenti 25,30,31. È ampiamente riconosciuto che il microbiota negli organismi, compresi gli esseri umani e il pesce zebra, è colonizzato all’inizio della vita e modellato durante la crescita e lo sviluppo. La composizione rimane stabile negli stadi adulti, con i ruoli del microbiota nell’ospite cruciali per tutta la vita, specialmente negli aspetti dell’invecchiamento, dell’obesità neurodegenerativa e metabolica e delle malattie intestinali³. Pertanto, le prospettive degli animali GF con sopravvivenza più lunga possono fornire informazioni sui meccanismi dei ruoli microbici nello sviluppo e nelle funzioni degli organi ospiti, considerando i sistemi immunitari e riproduttivi immaturi delle larve di pesce nei primi anni di vita. Mentre i ceppi batterici nell’intestino del pesce zebra sono stati isolati e identificati in studi precedenti, offrendo il potenziale per infettare i modelli animali GF per selezionare probiotici o ricercare funzioni batteriche nell’ospite^19,25, la generazione e l’applicazione di modelli di pesce GF sono state principalmente limitate alle prime fasi della vita. Questa limitazione, attribuita al complesso processo di produzione, agli elevati costi di manutenzione e ai problemi associati al cibo e all’immunità, ostacola gli sforzi di ricerca volti a studiare gli effetti dello sviluppo e cronici del microbiota nell’ospite.

Il tasso di sopravvivenza, il comportamento, la crescita, la maturazione e la salute generale dei pesci, specialmente nei modelli privi di germi (GF), sono significativamente influenzati dalle pratiche alimentari, che comprendono l’assunzione e l’assorbimento del nutrimento durante il periodo di apertura della bocca dalle prime larve ai giovani^32,33. Tuttavia, una delle sfide nell’allevamento di pesci GF è la scarsità di diete sterili adeguate, che limita l’efficacia del supporto nutrizionale per sostenere la crescita e la sopravvivenza delle larve. Risolvere questo problema è fondamentale per ripristinare la vita dei pesci GF, considerando i loro meccanismi di difesa dello sviluppo e le deboli capacità di digestione dovute all’assenza di un microbioma intestinale. In termini di cibo, i gamberetti in salamoia vivi (Artemia sp.) emergono come la dieta più adatta per le larve a bocca aperta e per i pesci giovani. È stato osservato che i pesci nutriti con artemia salina vivi mostrano tassi di crescita e sopravvivenza più elevati rispetto a quelli alimentati con tuorlo d’uovo cotto o altre esche naturali e sintetiche³⁴. Mentre i modelli di vita precoce dei pesci GF possono sopravvivere con il supporto del tuorlo e i modelli di larve GF possono essere mantenuti con l’alimentazione sterile, la generazione di modelli a lungo termine dalle larve ai giovani e il raggiungimento della maturità sessuale rimane una sfida. Inoltre, il cibo in scaglie o in polvere è limitato da una composizione nutrizionale ineguale e può influire sulla qualità dell’acqua. Al contrario, l’artemia viva presenta vantaggi come la sopravvivenza sia in acqua salata che in acqua dolce, dimensioni ridotte adatte alle larve agli adulti, facilità di dosaggio e maggiore qualità di schiusa³⁵. Basandoci sui metodi precedenti 16,24,30, abbiamo semplificato il complesso processo di trattamento e affrontato la sfida della dieta stabilendo Artemia sp. GF viva facilmente incubata come alimento sterile per periodi più lunghi rispetto ai pesci GF all’inizio della vita.

Questo studio presenta un protocollo ottimizzato che copre (1) generazione, (2) mantenimento, (3) identificazione del tasso di sterilità e (4) mantenimento e alimentazione per garantire la crescita di zebrafish privo di germi (GF) dagli embrioni alle larve e agli stadi giovanili. I risultati offrono prove preliminari sulla schiusa, la sopravvivenza, la crescita e la sterilità del pesce zebra GF, insieme agli indici essenziali per GF Artemia sp. come alimento sterile. Le fasi dettagliate nella generazione del modello e nella preparazione di alimenti vivi sterili forniscono un supporto tecnico cruciale per la costruzione e l’applicazione di modelli di pesce GF a lungo termine, nonché GF Artemia sp. nella ricerca sull’interazione microbiota-ospite. Il protocollo affronta l’isolamento, l’identificazione e l’infezione batterica su modelli di pesci GF, delineando metodi per l’etichettatura della fluorescenza batterica e osservando la loro colonizzazione nell’intestino dei pesci al microscopio. I pesci GF, i pesci gnotobiotici con infezione batterica o i modelli di microbiota umano trasferiti saranno sottoposti a vari rilevamenti per chiarire le loro funzioni ed effetti sull’immunità dell’ospite, sulla digestione, sul comportamento, sulla regolazione trascrittomica e sugli aspetti metabolici. A lungo termine, questo protocollo può essere esteso a diverse specie ittiche selvatiche, come il medaka marino, e potenzialmente ad altre linee di pesce zebra transgenico selezionate correlate a tessuti o malattie specifici.