توليد وصيانة وتحديد نماذج الزرد الخالية من الجراثيم من اليرقات إلى مراحل الأحداث

تلعب الجراثيم (أي العتائق والبكتيريا وحقيقيات النوى والفيروسات) أدوارا حاسمة في الحفاظ على صحة المضيف والمساهمة في تطور الأمراض المختلفة من خلال التأثير على العمليات الفسيولوجية والمرضية من خلال التفاعلات التكافلية داخل الحاجز المعوي والسطح الظهاري ووظائف الميوسين لدى الأفراد^1،2،3. يتشكل تكوين الجراثيم عبر مراحل الحياة المختلفة ، من الطفولة إلى الأحداث ، والبلوغ ، والشيخوخة ، بالإضافة إلى وجودها في مواقع مختلفة مثل مواقع الفم والفم والجلد والأمعاء ، بشكل ديناميكي من خلال الموائل والبيئات المتنوعة⁴. تشارك الجراثيم المعوية في الكائنات الحية في امتصاص العناصر الغذائية ، والاستجابة المناعية ، وغزو مسببات الأمراض ، وتنظيم التمثيل الغذائي ، وما إلى ذلك ^5,6. أظهرت الدراسات التي أجريت على المرضى أن الاضطرابات في ميكروبات الأمعاء مرتبطة بالسمنة البشرية واضطرابات النوم والاكتئاب ومرض التهاب الأمعاء (IBD) والأمراض التنكسية العصبية (باركنسون والزهايمر) والشيخوخة وأنواع السرطان^{المختلفة 7،8،9}. علاوة على ذلك ، تتضمن المسارات التفاعلية بين ميكروبيوتا الأمعاء والمضيفين عوامل التهابية ، وناقلات عصبية ، ومستقلبات ، وحاجز معوي ، وإجهاد تأكسدي ، كما لوحظ في الأبحاث السابقة باستخدام نماذج الفئران والأسماك^10،11.

في الآونة الأخيرة ، تم استكشاف العديد من الأساليب أو العلاجات المتعلقة بالبكتيريا ، بما في ذلك البروبيوتيك المحتمل وزرع الجراثيم البرازية (FMT) ، لهذه الاضطرابات في النماذج السريرية والحيوانية. تستند هذه الاستكشافات إلى الاكتشافات المتعلقة بمحور الجراثيم والأمعاء والدماغ / الكبد / الكلى ، والمنتجات المشتقة من الميكروبات ، ونشاط المستقبلات المتغير^12،13. ومع ذلك ، فإن تطوير ووظائف وآليات مختلفة لنظام مضيف الميكروبات لا يزال غير مفهوم ومحدد بشكل كامل بسبب تعقيد المجتمع الميكروبي والتحدي المتمثل في توليد نماذج أمراض قوية تشبه الإنسان.

لمعالجة هذه القضايا ، تم اقتراح نماذج حيوانية خالية من الجراثيم (GF) على وجه السرعة في^{منتصف القرن} 19 وتم تطويرها بشكل أساسي^{خلال القرن} 20. التحسينات اللاحقة ، بما في ذلك النماذج المعالجة بالمضادات الحيوية و gnotobiotic ، جنبا إلى جنب مع التطورات في تقنيات الكشف عن الميكروبات ومراقبتها ، زادت من إتقان هذه النماذج^14،15،16. تقدم GF ، التي تم إنشاؤها عن طريق محو خلفيتها الخاصة وتجنب الميكروبات البيئية ، استراتيجية ممتازة لاستكشاف التفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة ومضيفيها¹⁷. من خلال تطبيق النماذج الحيوانية والبروتوكولات المكررة ، نجح الباحثون في تكرار التركيبات الميكروبية المماثلة الموجودة في المرضى في الفئران والأسماك GF. بالإضافة إلى ذلك ، توفر النماذج الحيوانية الأخرى GF ، مثل والدجاج والخنازير ، خيارات متنوعة كمواضيع بحثية^{18،19،20،21}. وقد مكن هذا النهج من إجراء تحقيقات في الآثار العلاجية المحتملة للميكروبات المتعايشة على أمراض مختلفة ، بما في ذلك العلاج المناعي للسرطان لدى البشر^16،18. تقدم نماذج GF رؤى أكثر دقة حول خصائص وآليات الاستعمار البكتيري المحدد والهجرة والتكاثر والتفاعل داخل المضيفين. يوفر هذا رؤى جديدة حاسمة حول حدوث وتطور الأمراض المرتبطة بالميكروبات^22,23. تطور تاريخ إنشاء وتطبيق أسماك الزرد GF في الأبحاث الميكروبية من تقارير Rawls et al. في عام 2004 و Bates et al. في عام 2006 إلى بروتوكول Melancon et al. في عام 2017^16،24،25. ومع ذلك ، لا تزال جدوى نماذج GF البالغة أو المتكاثرة عملية طويلة ، مصحوبة بطول العمر المتغير ومعدلات النجاح والتحديات الصحية.

من بين النماذج الحيوانية المختلفة ، تبرز أسماك الزرد (Danio rerio) كأداة حاسمة لكل من البحوث الأساسية والطبية الحيوية نظرا لتشابهها المفيد مع الأعضاء البشرية وعلم الجينوم ، ودورة النمو القصيرة ، والخصوبة العالية ، والأجنة الشفافة^19,26. يقدم الزرد ، الذي يعمل كنماذج موثوقة للأمراض البشرية ، تمثيلا مرئيا للعمليات الفسيولوجية والمرضية في الجسم الحي ، مما يوفر نظرة ثاقبة للسمات الجذابة للتفاعلات بين المضيف والميكروب. والجدير بالذكر أن أسماك الزرد تظهر سلالات خلايا متميزة ، مما يسمح بتصوير فسيولوجيا الأمعاء ، والديناميات الميكروبية ، والغدد التناسلية والتطور التناسلي ، ونضج الجهاز المناعي المضيف ، والسلوك ، والتمثيل الغذائي²⁷. تتطور أجنة الزرد داخل الحبال الواقية حتى الفقس ، وتصبح يرقات في 3 أيام بعد الإخصاب (dpf). يبحثون بنشاط عن الطعام عند 5 dpf ويصلون إلى مرحلة النضج الجنسي بعد حوالي 3 أشهر من الإخصاب (mpf) ²⁸. أظهر أول سمكة زرد ناجحة خالية من الجراثيم (GF) ، أبلغ عنها Rawls et ^al.24 ، أن اليرقات التي تتغذى على الأعلاف المعقمة بعد امتصاص صفار البيض أظهرت نخرا في الأنسجة من 8 dpf والموت الكلي عند 20 dpf. وقد أشار ذلك إلى آثار النظام الغذائي أو أهمية النظر في إمدادات المغذيات الخارجية في التجارب التي تنطوي على أسماك GF طويلة الأجل (>7 dpf)²⁹. حسنت الدراسات اللاحقة بروتوكول توليد أسماك GF ، باستخدام الطعام المعقم والأساليب المتقنة في نماذج الأسماك المختلفة¹⁶.

ومع ذلك ، فقد ركزت معظم الأبحاث حول نماذج الزرد GF على مراحل الحياة المبكرة ، والتي تنطوي على العدوى البكتيرية عند 5 dpf لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة ، مع العينات التي تم جمعها قبل 7 dpf في ختام التجارب^25،30،31. من المعترف به على نطاق واسع أن الكائنات الحية الدقيقة في الكائنات الحية ، بما في ذلك البشر وأسماك الزرد ، يتم استعمارها في بداية الحياة وتتشكل أثناء النمو والتطور. يظل التكوين مستقرا في مراحل البلوغ ، حيث تكون أدوار الجراثيم في المضيف حاسمة طوال الحياة ، خاصة في الشيخوخة ، والتنكس العصبي ، والسمنة المرتبطة بالتمثيل الغذائي ، وجوانب الأمراض المعوية³. وبالتالي ، فإن وجهات النظر من GF ذات البقاء على قيد الحياة لفترة أطول يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لآليات الأدوار الميكروبية في تطوير الأعضاء المضيفة ووظائفها ، مع الأخذ في الاعتبار الجهاز المناعي والتناسلي غير الناضج ليرقات الأسماك في الحياة المبكرة. في حين تم عزل السلالات البكتيرية في أمعاء الزرد وتحديدها في الدراسات السابقة ، مما يوفر إمكانية إصابة النماذج الحيوانية GF لاختيار البروبيوتيك أو وظائف البكتيريا البحثية في المضيف^19,25 ، فقد اقتصر توليد وتطبيق نماذج أسماك GF في المقام الأول على مراحل الحياة المبكرة. هذا القيد ، الذي يعزى إلى عملية الإنتاج المعقدة ، وارتفاع تكاليف الصيانة ، والقضايا المرتبطة بالغذاء والمناعة ، يعيق الجهود البحثية الرامية إلى التحقيق في الآثار التنموية والمزمنة للميكروبات في المضيف.

يتأثر معدل البقاء على قيد الحياة والسلوك والنمو والنضج والصحة العامة للأسماك ، خاصة في النماذج الخالية من الجراثيم (GF) ، بشكل كبير بممارسات التغذية ، بما في ذلك تناول التغذية والامتصاص خلال فترة فتح الفم من اليرقات المبكرة إلى الأحداث^32،33. ومع ذلك ، فإن أحد التحديات في تربية الأسماك GF هو ندرة النظم الغذائية المعقمة المناسبة ، مما يحد من فعالية الدعم الغذائي للحفاظ على نمو اليرقات وبقائها. يعد حل هذه المشكلة أمرا بالغ الأهمية لاستعادة حياة أسماك GF ، مع الأخذ في الاعتبار آليات الدفاع التنموية وضعف قدرات الهضم بسبب عدم وجود ميكروبيوم معوي. من حيث الغذاء ، يظهر الجمبري الملحي الحي (Artemia sp.) باعتباره النظام الغذائي الأنسب لليرقات المفتوحة الفم للأسماك اليافعة. وقد لوحظ أن الأسماك التي تتغذى على الجمبري الملحي الحي تظهر معدلات نمو وبقاء أعلى مقارنة بتلك التي تتغذى على صفار البيض المطبوخ أو الطعوم الطبيعية والاصطناعية^{الأخرى 34}. في حين أن نماذج الحياة المبكرة لأسماك GF يمكن أن تعيش مع دعم صفار البيض ويمكن الحفاظ على نماذج يرقات GF بالتغذية المعقمة ، فإن توليد نماذج طويلة الأجل من اليرقات إلى الأحداث والوصول إلى مرحلة النضج الجنسي لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن رقائق الطعام أو المسحوق محدودة بسبب التركيب الغذائي غير المتكافئ ويمكن أن تؤثر على جودة المياه. في المقابل ، يتمتع الأرتيميا الحية بمزايا مثل البقاء على قيد الحياة في كل من المياه المالحة والعذبة ، وصغر الحجم المناسب لليرقات للبالغين ، وسهولة التجميع ، وجودة الفقس الأعلى³⁵. بناء على الطرق السابقة^16،24،30 ، قمنا بتبسيط عملية العلاج المعقدة ومعالجتنا لتحدي النظام الغذائي من خلال إنشاء GF Live Artemia sp. بسهولة كغذاء معقم لفترات أطول من أسماك GF المبكرة.

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا محسنا يغطي (1) التوليد ، (2) الصيانة ، (3) تحديد معدل التعقيم ، و (4) الصيانة والتغذية لضمان نمو أسماك الزرد الخالية من الجراثيم (GF) من الأجنة إلى اليرقات ومراحل الأحداث. تقدم النتائج أدلة أولية على فقس وبقاء ونمو وعقم أسماك الزرد GF ، إلى جانب المؤشرات الأساسية ل GF Artemia sp. كغذاء معقم. توفر الخطوات التفصيلية في توليد النماذج وإعداد الأغذية الحية المعقمة دعما تقنيا حاسما لبناء وتطبيق نماذج أسماك GF طويلة الأجل ، بالإضافة إلى GF Artemia sp. في أبحاث التفاعل بين الميكروبات والمضيف. يتناول البروتوكول عزل البكتيريا وتحديدها والعدوى على نماذج أسماك GF ، ويحدد طرق وضع العلامات الفلورية البكتيرية ومراقبة استعمارها في أمعاء الأسماك تحت المجهر. ستخضع أسماك GF أو أسماك gnotobiotic المصابة بعدوى بكتيرية أو نماذج الجراثيم البشرية المنقولة لاكتشافات مختلفة لتوضيح وظائفها وتأثيراتها على مناعة المضيف والهضم والسلوك وتنظيم النسخ والجوانب الأيضية. على المدى الطويل ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل أنواعا مختلفة من الأسماك البرية ، مثل الميداكا البحرية ، وربما ليشمل سلالات الزرد المعدلة وراثيا المختارة الأخرى المرتبطة بأنسجة أو أمراض معينة.