Her bruker vi HD-MEA for å fordype oss i beregningsdynamikken til store nevronale ensembler, spesielt i hippocampus, olfaktoriske pærekretser og menneskelige nevronnettverk. Registrering av spatiotemporal aktivitet, kombinert med beregningsverktøy, gir innsikt i nevronal ensemblekompleksitet. Metoden forbedrer forståelsen av hjernens funksjoner, potensielt identifiserer biomarkører og behandlinger for nevrologiske lidelser.
Store nevrale nettverk og deres komplekse distribuerte mikrokretser er avgjørende for å generere oppfatning, kognisjon og atferd som kommer fra mønstre av spatiotemporal nevronaktivitet. Disse dynamiske mønstrene som kommer fra funksjonelle grupper av sammenkoblede nevronale ensembler, letter presise beregninger for behandling og koding av multiskala nevral informasjon, og driver dermed høyere hjernefunksjoner. For å undersøke beregningsprinsippene for nevral dynamikk som ligger til grunn for denne kompleksiteten og undersøke multiskala virkningen av biologiske prosesser i helse og sykdom, har storskala samtidige opptak blitt medvirkende. Her brukes en mikroelektrode med høy tetthet (HD-MEA) for å studere to modaliteter av nevral dynamikk – hippocampus og olfaktoriske pærekretser fra ex-vivo musehjerneskiver og nevrale nettverk fra in vitro-cellekulturer av humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs). HD-MEA-plattformen, med 4096 mikroelektroder, muliggjør ikke-invasive, etikettfrie opptak på flere steder av ekstracellulære avfyringsmønstre fra tusenvis av nevronale ensembler samtidig med høy spatiotemporal oppløsning. Denne tilnærmingen tillater karakterisering av flere elektrofysiologiske nettverksomfattende funksjoner, inkludert enkelt-/multi-enhet spiking aktivitetsmønstre og lokale feltpotensialsvingninger. For å granske disse flerdimensjonale nevrale dataene har vi utviklet flere beregningsverktøy som omfatter maskinlæringsalgoritmer, automatisk hendelsesdeteksjon og klassifisering, grafteori og andre avanserte analyser. Ved å supplere disse beregningsmessige pipelinene med denne plattformen, tilbyr vi en metodikk for å studere den store, multiskala og multimodale dynamikken fra cellesamlinger til nettverk. Dette kan potensielt fremme vår forståelse av komplekse hjernefunksjoner og kognitive prosesser i helse og sykdom. Forpliktelse til åpen vitenskap og innsikt i storskala beregningsorientert nevral dynamikk kan forbedre hjerneinspirert modellering, nevromorf databehandling og nevrale læringsalgoritmer. Videre kan forståelse av de underliggende mekanismene for svekkede storskala nevrale beregninger og deres sammenkoblede mikrokretsdynamikk føre til identifisering av spesifikke biomarkører, og bane vei for mer nøyaktige diagnostiske verktøy og målrettede terapier for nevrologiske lidelser.
Nevrale ensembler, ofte kalt cellesamlinger, er sentrale i nevral koding, og letter intrikate beregninger for behandling av multiskala nevral informasjon 1,2,3. Disse ensemblene underbygger dannelsen av ekspansive nevrale nettverk og deres nyanserte mikrokretser4. Slike nettverk og deres oscillerende mønstre driver avanserte hjernefunksjoner, inkludert oppfatning og kognisjon. Mens omfattende forskning har utforsket spesifikke nevrontyper og synaptiske veier, er en dypere forståelse av hvordan nevroner samarbeider danner cellesammensetninger og påvirker spatiotemporal informasjonsbehandling på tvers av kretser og nettverk fortsatt unnvikende5.
Akutte, ex vivo hjerneskiver er sentrale elektrofysiologiske verktøy for å studere intakte nevrale kretser, og tilbyr en kontrollert innstilling for å undersøke oscillatoriske aktivitetsmønstre av nevral funksjon, synaptisk overføring og tilkobling, med implikasjoner i farmakologisk testing og sykdomsmodellering 6,7,8. Denne studieprotokollen fremhever to viktige hjernekretser – hippocampus-cortical (HC) involvert i lærings- og minneprosesser 9,10, og olfaktorisk pære (OB) ansvarlig for luktdiskriminering 11,12,13. I disse to regionene genereres nye funksjonelle nevroner kontinuerlig av voksen neurogenese gjennom livet i pattedyrhjerner14. Begge kretsene demonstrerer flerdimensjonale dynamiske nevrale aktivitetsmønstre og iboende plastisitet som deltar i omkobling av det eksisterende nevrale nettverket og letter alternative informasjonsbehandlingsstrategier når det er nødvendig15,16.
Akutte, ex-vivo hjerneskivemodeller er uunnværlige for å dykke inn i hjernens funksjonalitet og forstå sykdomsmekanismer på mikrokretsnivå. Imidlertid tilbyr in vitro-cellekulturer avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs) nevronale nettverk en lovende vei for translasjonsforskning, som sømløst forbinder funn fra dyreforsøk til potensiell human klinisk behandling17,18. Disse menneskesentriske in vitro-analysene fungerer som en pålitelig plattform for å vurdere farmakologisk toksisitet, muliggjøre presis legemiddelscreening og fremme forskning på innovative cellebaserte terapeutiske strategier19,20. Ved å anerkjenne den sentrale rollen til iPSC nevronmodellen, har vi dedikert den tredje modulen i denne protokollstudien for å grundig undersøke de funksjonelle egenskapene til dets avledede nettverk og for å finjustere de tilknyttede cellekulturprotokollene.
Disse elektrogene nevrale modulene har blitt ofte studert ved hjelp av teknikker som kalsium (Ca2+ bildebehandling), patch-klemmeopptak og mikroelektroderader med lav tetthet (LD-MEA). Mens Ca2+ bildebehandling tilbyr kartlegging av enkeltcelleaktivitet, er det en cellemerkingsbasert metode hindret av sin lave temporale oppløsning og utfordringer i langsiktige opptak. LD-MEA mangler romlig presisjon, mens patch-clamp, som er en invasiv enkeltstedsteknikk og arbeidskrevende, ofte gir en lav suksessrate 21,22,23. For å møte disse utfordringene og effektivt undersøke nettverksomfattende aktivitet, har storskala samtidige nevrale opptak dukket opp som en sentral tilnærming for å forstå beregningsprinsippene for nevrale dynamikker som ligger til grunn for hjernens kompleksitet og deres implikasjoner i helse og sykdom24,25.
I denne JoVE-protokollen demonstrerer vi en storskala nevral opptaksmetode basert på MEA (HD-MEA) med høy tetthet for å fange opp spatiotemporal nevronaktivitet på tvers av ulike hjernemodaliteter, inkludert hippocampus- og olfaktoriske pærekretser fra ex vivo akutte skiver i musehjernen (figur 1A-C) og in vitro humane iPSC-avledede nevronnettverk (figur 1D-E), tidligere rapportert av vår gruppe og andre kolleger26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, bygget på CMOS-teknologi (complementary-metal-oxide-semiconductor), kan skryte av brikkekretser og forsterkning, noe som tillater opptak på under millisekunder over en 7mm 2-arraystørrelse36. Denne ikke-invasive tilnærmingen fanger opp multi-site, etikettfrie ekstracellulære avfyringsmønstre fra tusenvis av nevronale ensembler samtidig ved bruk av 4096 mikroelektroder ved høy spatiotemporal oppløsning, og avslører den intrikate dynamikken til lokale feltpotensialer (LFP) og multiunit spiking activity (MUA) 26,29.
Gitt de enorme dataene som genereres av denne metodikken, er et sofistikert analytisk rammeverk avgjørende, men utgjør utfordringer37. Vi har utviklet beregningsverktøy som omfatter automatisk hendelsesdeteksjon, klassifisering, grafteori, maskinlæring og andre avanserte teknikker (figur 1F) 26,29,38,39. Ved å integrere HD-MEA med disse analyseverktøyene, er en helhetlig tilnærming utviklet for å undersøke den intrikate dynamikken fra individuelle cellesammensetninger til bredere nevrale nettverk på tvers av ulike nevrale modaliteter. Denne kombinerte tilnærmingen utdyper vår forståelse av beregningsdynamikken i normale hjernefunksjoner og gir innsikt i anomalier som er tilstede under patologiske forhold28. Videre kan innsikt fra denne tilnærmingen drive fremskritt innen hjerneinspirert modellering, nevromorf databehandling og nevrale læringsalgoritmer. Til syvende og sist holder denne metoden løfte om å avdekke kjernemekanismene bak nevrale nettverksforstyrrelser, potensielt identifisere biomarkører og veilede etableringen av presise diagnostiske verktøy og målrettede behandlinger for nevrologiske forhold.
Den intrikate dynamikken til spatiotemporal nevronaktivitet, som kommer fra sammenkoblede nevronale ensembler, har lenge vært gjenstand for intriger i nevrovitenskap. Tradisjonelle metoder, som patch-clamp, standard MEA og Ca2+ bildebehandling, har gitt verdifull innsikt i hjernens kompleksitet. Imidlertid kommer de ofte til kort når det gjelder å fange opp den omfattende nettverksomfattende beregningsdynamikken 21,22,23. Den tekniske protokollen til HD-MEA-plattformen, som beskrevet i denne JoVE-studien, representerer et betydelig sprang fremover, og tilbyr panoramautsikt over nevral dynamikk på tvers av ulike modaliteter, fra cellesammensetninger til ekspansive nettverk (dvs. akutte, ex vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-nettverk)26,29,30,32.
Akutte, ex-vivo musehjerneskiver har vært et grunnleggende verktøy i nevronforskning, og letter molekylære og kretsnivåundersøkelser 6,7. Utfordringen med å opprettholde vevets levedyktighet har imidlertid vært en vedvarende flaskehals. Protokollen som er avgrenset i denne studien introduserer kritiske modifikasjoner for å optimalisere kvaliteten og levetiden til disse skivene for å utnytte fordelene på HD-MEA-plattformen. Denne protokollen understreker viktigheten av – i) Oppnå skiveuniformitet, der bruk av en vibratome foretrekkes fremfor en vevshakker på grunn av dens presisjon og minimale vevskader, til tross for avveiningen av lengre kuttetider. ii) Sikre konstant karbogenasjon gjennom hele prosessen, fra ekstraksjon til opptak, for å opprettholde vevets levedyktighet. iii) Regulere temperatur og tillate tilstrekkelig restitusjonstid før opptak. iv) Bruk av en agaroseblokk eller mugg for å stabilisere hjernen, forhindre riving og minimere limkontakt. v) Opprettholde optimale strømningshastigheter av karbogenert aCSF i HD-MEA-reservoaret for å sikre skivehelsen samtidig som man unngår problemer som frakobling, støy og drift (tabell 2).
For både musehjerneskiver og humane iPSC-preparater er forbedring av elektrodevevgrensesnittkobling avgjørende 30,46,47. Vår protokoll understreker viktigheten av å utnytte det adhesjonsfremmende molekylet Poly-dl-ornitin (PDLO). Dette molekylet øker ikke bare overflaten for å oppdage elektriske signaler, men øker også elektrisk ledningsevne46. Ved å gjøre det, fremmer det cellulær adhesjon, vekst og utvikling av funksjonelle nettverksegenskaper. Slik optimalisering spiller en sentral rolle i å øke effektiviteten til HD-MEA-plattformen. Dette sikrer i sin tur nøyaktig og konsistent analyse av mikroskala ex vivo og in vitro connectomes og deres spatiotemporale avfyringssekvenser. Spesielt har PDLO vist seg å overgå andre substrater som polyetylenimin (PEI) og poly-l-ornitin (PLO) for å fremme spontan avfyringsaktivitet og respons på elektriske stimuli i nevronkulturer. I tillegg har PDLO blitt brukt til overflatefunksjonalisering på HD-MEA og vist seg å forbedre elektrodeskjæringskoblingsgrensesnittet og øke signal-støy-forholdet i både OB- og HC-skiver26,29. Tillegget av et spesialbygd platinaanker forsterker elektrodeskivegrensesnittkoblingen ytterligere, noe som fører til opptak med høyere signal-til-støy-forhold.
Bruken av HD-MEA for både ex-vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-nettverk introduserer en metode som er dyktig til å utforske omfattende, multiskala og multimodal dynamikk. Denne innovative tilnærmingen bringer imidlertid frem betydelige utfordringer, spesielt i datahåndtering 48,49,50,51. Et enkelt HD-MEA-opptak tatt med 18 kHz/elektrodesamplingsfrekvens genererer svimlende 155 MB/s med data. Datavolumet eskalerer raskt når man tar hensyn til flere skiver, forskjellige farmakologiske forhold eller langvarige registreringsperioder. En slik tilstrømning av informasjon krever robuste lagringsinfrastrukturer og avanserte beregningsverktøy for strømlinjeformet behandling. HD-MEA-plattformens evne til samtidig å samle inn data fra tusenvis av nevronale ensembler er både en velsignelse og et hinder. Det gir suveren innsikt i beregningsdynamikken til hjernefunksjoner, men det krever også et raffinert analytisk rammeverk. I denne JoVE-protokollen har vi gitt eksempler på beregningsstrategier, inkludert storskala hendelsesdeteksjon, klassifisering, grafteori, frekvensanalyse og maskinlæring. Disse metodene understreker den intensive innsatsen som er gjort for å takle utfordringene ved å analysere komplekse nevrale data. Likevel er det fortsatt betydelig rom for utvikling av mer avanserte beregningsverktøy for å analysere disse flerdimensjonale nevrale datasettene. Bevæpnet med passende verktøy og metoder, er potensialet til HD-MEA-plattformen forstørret, og gir dyp innsikt i vanskelighetene med hjernefunksjoner under både sunne og patologiske forhold.
I hovedsak tilbyr HD-MEA-plattformen, når den integreres med de detaljerte protokollene og beregningsverktøyene som diskuteres, en transformativ tilnærming til å forstå hjernens intrikate arbeid. Ved å fange storskala, multiskala og multimodal dynamikk, gir den uvurderlig innsikt i prosesser som læring, hukommelse og informasjonsbehandling. Videre har anvendelsen i in vitro humane iPSC-nettverk potensialet til å revolusjonere legemiddelscreening og personlig medisin. Selv om denne plattformen representerer et betydelig fremskritt innen nevrovitenskapelig forskning, er det imidlertid avgjørende å erkjenne og adressere de iboende tekniske utfordringene. Med kontinuerlig forbedring og integrering av avanserte beregningsverktøy, står HD-MEA-plattformen klar til å innlede en ny epoke med presise diagnostiske verktøy, identifisering av spesifikke biomarkører og målrettede terapier for nevrologiske lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av institusjonelle midler (DZNE), Helmholtz Association innenfor Helmholtz Validation Fund (HVF-0102), og Dresden International Graduate School for biomedisin og bioteknologi (DIGS-BB). Vi vil også gjerne anerkjenne plattformen for atferdsdyrtesting ved DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther og Jens Bergmann) for deres støtte. Vi ønsker å erkjenne at en del av figur 1 ble opprettet ved hjelp av plattformen BioRender.com.
150 mm Glass Petri Dish | generic | generic | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
0.22 μm Sterile Filter Unit | Assorted | Assorted | Assorted |
90 mm Plastic Culture Dish | TPP | 93100 | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Agarose | Roth | 6351.5 | Brain Preparation Workspace |
Agarose Mold | CUSTOM | CUSTOM | Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Aluminum Foil | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Anesthesia chamber | generic | generic | Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544-25G | Solution Preparation Workspace |
Assorted Beakers | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 50 mL |
Assorted Luers | Cole Parmer | 45511-00 | Brain Slice Recording Workspace |
Assorted Volumetric flasks | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
BDNF | Peprotech | 450-02 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Biological Safety Cabinet with UV Lamp | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
BrainPhys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol |
Brainwave Software | 3Brain AG | Version 4 | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay | BrainXell | BX-0300 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Solution Preparation Workspace |
Carbogen | generic | generic | All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture |
Cell Culture Incubator | Assorted | Assorted | Assorted |
CMOS-based HD-MEA chip | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) | STEMCELL Technologies | 38010 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | Brain Slice Recording Workspace |
Curved Forceps | FST | 11052-10 | Brain Extraction Workspace |
DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 11330-032 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | STEMCELL Technologies | 37350 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Filter Paper | Macherey-Nagel | 531 011 | Brain Preparation Workspace |
Fine Brush | Leonhardy | 773 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Forceps | VITLAB | 67895 | Brain Slice Recording Workspace |
GDNF | Peprotech | 450-10 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Geltrex | Life Technologies | A1413201 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Glass pasteur pipette | Roth | 4518 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Solution Preparation Workspace |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Gravity-based Perfusion System | ALA | VC3-8xG | Brain Slice Recording Workspace |
HD-MEA Recording platform | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Heater | Warner Instruments | TC-324C | Brain Slice Recording Workspace |
Hemocytometer or Automated Cell Counter | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Hypo Needles | Warner Instruments | 641489 | Brain Slice Recording Workspace |
iCell GlutaNeurons Kit, 01279 | CDI | R1061 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Iris Scissors | Vantage | V95-304 | Brain Extraction Workspace |
Isoflurane | Baxter | HDG9623 | Brain Extraction Workspace |
KCl | Sigma Aldrich | P5405-250G | Solution Preparation Workspace |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Liquid Nitrogen Storage Unit | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Magnetic Stirrer | generic | generic | Solution Preparation Workspace |
Metal Screws | Thorlabs | HW-KIT2/M | Brain Slice Recording Workspace |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028-100ML | Solution Preparation Workspace |
MgSO4 | Sigma Aldrich | 63138-250G | Solution Preparation Workspace |
Microdissection Tool Holder | Braun | 4606108V | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Microdissection Tool Needle | Braun | 9186166 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Modular Stereomicroscope | Leica | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014-1KG | Solution Preparation Workspace |
NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751-100G | Solution Preparation Workspace |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | Solution Preparation Workspace |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Optical Cage System | Thorlabs | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Optical Table w/Breadboard | Thorlabs | SDA7590 | Brain Slice Recording Workspace |
PDLO | Sigma Aldrich | P0671 | HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace |
Penicillin-streptomycin, 100x | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Pipette tips | TipONE | S1120-8810 | Brain Slice Recording Workspace |
Pipettors | Assorted | Assorted | Assorted |
Platinum Anchor | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace |
Polyethylene Tubing | Assorted | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Pump | MasterFlex | 78018-22 | Brain Slice Recording Workspace |
Razor Blade | Apollo | 10179960 | Brain Preparation Workspace |
Reference Electrode Cell Culture Cap | CUSTOM | CUSTOM | Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Rubber Pipette Bulb | Duran Wheaton Kimble | 292000205 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL | Assorted | Assorted | Assorted |
Slice Recovery Chamber | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Spatula | ISOLAB | 047.06.150 | Brain Preparation Workspace |
Sucrose | Sigma Aldrich | 84100-1KG | Solution Preparation Workspace |
Super Glue | UHU | 358221 | Brain Slice Preparation Workspace |
Surgical Scissors | Peters Instruments | BC 344 | Brain Extraction Workspace |
Tabletop Centrifuge | Assorted | Assorted | Assorted |
TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Tissue Paper | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Trypan Blue | STEMCELL Technologies | 07050 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Upright Microscope | Olympus | CUSTOM | Imaging Workspace; Custom specifications and modifications |
Vacusip | Integra | 159010 | Brain Slice Recording Workspace |
Vibratome | Leica | VT1200s | Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool |
Vibratome Blade | Personna | N/A | Brain Slice Preparation Workspace |
Water Bath | Lauda | L000595 | Brain Slice Recovery Workspace |