Her anvender vi HD-MEA til at dykke ned i beregningsdynamikken i store neuronale ensembler, især i hippocampale, olfaktoriske pærekredsløb og humane neuronale netværk. Indfangning af rumlig tidsmæssig aktivitet kombineret med beregningsværktøjer giver indsigt i neuronal ensemblekompleksitet. Metoden øger forståelsen af hjernens funktioner og identificerer potentielt biomarkører og behandlinger for neurologiske lidelser.
Store neuronale netværk og deres komplekse distribuerede mikrokredsløb er afgørende for at generere opfattelse, kognition og adfærd, der stammer fra mønstre af rumlig neuronal aktivitet. Disse dynamiske mønstre, der stammer fra funktionelle grupper af sammenkoblede neuronale ensembler, letter præcise beregninger til behandling og kodning af multiscale neurale oplysninger og derved driver højere hjernefunktioner. For at undersøge beregningsprincipperne for neurale dynamikker, der ligger til grund for denne kompleksitet og undersøge multiskalavirkningen af biologiske processer inden for sundhed og sygdom, er store samtidige optagelser blevet instrumentelle. Her anvendes et mikroelektrodearray med høj densitet (HD-MEA) til at studere to modaliteter af neural dynamik – hippocampus og olfaktoriske pærekredsløb fra ex-vivo musehjerneskiver og neuronale netværk fra in vitro-cellekulturer af humant inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er). HD-MEA-platformen med 4096 mikroelektroder muliggør ikke-invasive, multi-site, label-fri optagelser af ekstracellulære affyringsmønstre fra tusindvis af neuronale ensembler samtidigt ved høj rumlig tidsmæssig opløsning. Denne fremgangsmåde muliggør karakterisering af flere elektrofysiologiske netværksdækkende funktioner, herunder enkelt/-multi-enhed spiking aktivitetsmønstre og lokale feltpotentielle svingninger. For at undersøge disse multidimensionelle neurale data har vi udviklet flere beregningsværktøjer, der inkorporerer maskinlæringsalgoritmer, automatisk hændelsesdetektion og klassificering, grafteori og andre avancerede analyser. Ved at supplere disse beregningsmæssige pipelines med denne platform leverer vi en metode til at studere den store, multiscale og multimodale dynamik fra cellesamlinger til netværk. Dette kan potentielt fremme vores forståelse af komplekse hjernefunktioner og kognitive processer inden for sundhed og sygdom. Forpligtelse til åben videnskab og indsigt i storskala beregningsmæssig neural dynamik kan forbedre hjerneinspireret modellering, neuromorfisk computing og neurale læringsalgoritmer. Desuden kan forståelse af de underliggende mekanismer for svækkede neurale beregninger i stor skala og deres indbyrdes forbundne mikrokredsløbsdynamik føre til identifikation af specifikke biomarkører, hvilket baner vejen for mere nøjagtige diagnostiske værktøjer og målrettede terapier til neurologiske lidelser.
Neuronale ensembler, ofte kaldet cellesamlinger, er afgørende for neural kodning, hvilket letter indviklede beregninger til behandling af multiscale neural information 1,2,3. Disse ensembler understøtter dannelsen af ekspansive neuronale netværk og deres nuancerede mikrokredsløb4. Sådanne netværk og deres oscillerende mønstre driver avancerede hjernefunktioner, herunder opfattelse og kognition. Mens omfattende forskning har udforsket specifikke neuronale typer og synaptiske veje, er en dybere forståelse af, hvordan neuroner sammen danner cellesamlinger og påvirker rumlig tidsmæssig informationsbehandling på tværs af kredsløb og netværk, stadig undvigende5.
Akutte, ex-vivo hjerneskiver er afgørende elektrofysiologiske værktøjer til undersøgelse af intakte neurale kredsløb, der tilbyder en kontrolleret indstilling til sonde oscillerende aktivitetsmønstre af neurale funktioner, synaptisk transmission og tilslutningsmuligheder med konsekvenser i farmakologisk test og sygdomsmodellering 6,7,8. Denne undersøgelsesprotokol fremhæver to vigtige hjernekredsløb – hippocampal-kortikal (HC) involveret i lærings- og hukommelsesprocesser 9,10 og den olfaktoriske pære (OB), der er ansvarlig for lugtdiskrimination 11,12,13. I disse to regioner genereres nye funktionelle neuroner kontinuerligt af voksen neurogenese gennem hele livet i pattedyrhjerner14. Begge kredsløb demonstrerer multidimensionelle dynamiske neurale aktivitetsmønstre og iboende plasticitet, der deltager i omledning af det eksisterende neurale netværk og letter alternative informationsbehandlingsstrategier, når det kræves15,16.
Akutte, ex-vivo hjerneskivemodeller er uundværlige for at dykke ned i hjernens funktionalitet og forstå sygdomsmekanismer på mikrokredsløbsniveau. Imidlertid tilbyder in vitro-cellekulturer afledt af humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) neuronale netværk en lovende vej til translationel forskning, der problemfrit forbinder resultater fra dyreforsøg med potentiel human klinisk behandling17,18. Disse menneskecentrerede in vitro-assays tjener som en pålidelig platform til vurdering af farmakologisk toksicitet, muliggør præcis lægemiddelscreening og fremmer forskning i innovative cellebaserede terapeutiske strategier19,20. I erkendelse af iPSC-neuronmodellens centrale rolle har vi dedikeret det tredje modul i denne protokolundersøgelse til grundigt at undersøge de funktionelle egenskaber ved dets afledte netværk og finjustere de tilknyttede cellekulturprotokoller.
Disse elektrogene neurale moduler er blevet almindeligt undersøgt ved hjælp af teknikker som calcium (Ca2+ billeddannelse), patch-clamp optagelser, og low-density mikroelektrode arrays (LD-MEA). Mens Ca2+ billeddannelse tilbyder kortlægning af enkeltcelleaktivitet, er det en cellemærkningsbaseret metode, der hindres af dens lave tidsmæssige opløsning og udfordringer i langsigtede optagelser. LD-MEA’er mangler rumlig præcision, mens patch-clamp, der er en invasiv single-site teknik og besværlig, ofte giver en lav succesrate 21,22,23. For at løse disse udfordringer og effektivt undersøge netværksdækkende aktivitet er store samtidige neurale optagelser opstået som en central tilgang til forståelse af beregningsprincipperne for neurale dynamikker, der ligger til grund for hjernens kompleksitet og deres konsekvenser for sundhed og sygdom24,25.
I denne JoVE-protokol demonstrerer vi en storstilet neural optagelsesmetode baseret på MEA (HD-MEA) med høj densitet til opsamling af spatiotemporal neuronal aktivitet på tværs af forskellige hjernemodaliteter, herunder hippocampus og olfaktoriske pærekredsløb fra ex-vivo musehjerne akutte skiver (figur 1A-C) og in vitro humane iPSC-afledte neuronale netværk (figur 1D-E), tidligere rapporteret af vores gruppe og andre kolleger26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, der er bygget på CMOS-teknologi (complementary-metal-oxide-semiconductor), kan prale af on-chip-kredsløb og forstærkning, hvilket muliggør optagelser på under millisekunder på tværs af en 7 mm2 array-størrelse36. Denne ikke-invasive tilgang fanger multi-site, etiketfri ekstracellulære affyringsmønstre fra tusindvis af neuronale ensembler samtidigt ved hjælp af 4096 mikroelektroder ved en høj spatiotemporal opløsning, hvilket afslører den indviklede dynamik i lokale feltpotentialer (LFP’er) og multiunit spiking aktivitet (MUA)26,29.
I betragtning af omfanget af de data, der genereres af denne metode, er en sofistikeret analytisk ramme afgørende, men indebærer udfordringer37. Vi har udviklet beregningsværktøjer, der omfatter automatisk hændelsesregistrering, klassificering, grafteori, maskinlæring og andre avancerede teknikker (figur 1F)26,29,38,39. Ved at integrere HD-MEA med disse analytiske værktøjer udtænkes en holistisk tilgang til at undersøge den indviklede dynamik fra individuelle cellesamlinger til bredere neurale netværk på tværs af forskellige neurale modaliteter. Denne kombinerede tilgang uddyber vores forståelse af beregningsdynamikken i normale hjernefunktioner og giver indsigt i anomalier til stede under patologiske tilstande28. Desuden kan indsigt fra denne tilgang drive fremskridt inden for hjerneinspireret modellering, neuromorfisk computing og neurale læringsalgoritmer. I sidste ende er denne metode lovende med hensyn til at afdække kernemekanismerne bag neurale netværksforstyrrelser, potentielt identificere biomarkører og vejlede oprettelsen af præcise diagnostiske værktøjer og målrettede behandlinger for neurologiske tilstande.
Den indviklede dynamik i spatiotemporal neuronal aktivitet, der stammer fra sammenkoblede neuronale ensembler, har længe været genstand for intriger inden for neurovidenskab. Traditionelle metoder, såsom patch-clamp, standard MEA og Ca2+ billeddannelse, har givet værdifuld indsigt i hjernens kompleksitet. De kommer dog ofte til kort med at fange den omfattende netværksdækkende beregningsdynamik 21,22,23. Den tekniske protokol for HD-MEA-platformen, som beskrevet i denne JoVE-undersøgelse, repræsenterer et betydeligt spring fremad, der giver et panoramaudsigt over neurale dynamikker på tværs af forskellige modaliteter, fra cellesamlinger til ekspansive netværk (dvs. akutte, ex-vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-netværk)26,29,30,32.
Akutte, ex-vivo musehjerneskiver har været et grundlæggende værktøj i neuronal forskning, hvilket letter molekylære undersøgelserog kredsløbsniveau 6,7. Udfordringen med at opretholde vævets levedygtighed har imidlertid været en vedvarende flaskehals. Protokollen beskrevet i denne undersøgelse introducerer kritiske ændringer for at optimere kvaliteten og levetiden af disse skiver for at udnytte deres fordele på HD-MEA-platformen. Denne protokol understreger vigtigheden af – i) At opnå skiveensartethed, hvor brugen af et vibratomt foretrækkes frem for en vævshakker på grund af dens præcision og minimerede vævsskade på trods af afvejningen af længere udskæringstider. ii) Sikring af konstant carbogenation gennem hele processen, fra ekstraktion til optagelse, for at opretholde vævets levedygtighed. iii) Regulering af temperaturen og tilladelse til tilstrækkelig restitutionstid før optagelse. iv) Brug af en agaroseblok eller skimmelsvamp til at stabilisere hjernen, forhindre rivning og minimere limkontakt. v) Opretholdelse af optimale strømningshastigheder for carbogeneret aCSF i HD-MEA-reservoiret for at sikre skivesundhed, samtidig med at problemer som afkobling, støj og afdrift undgås (tabel 2).
For både musehjerneskiver og humane iPSC-præparater er forbedring af elektrodevævsgrænsefladekobling altafgørende 30,46,47. Vores protokol understreger vigtigheden af at udnytte det vedhæftningsfremmende molekyle Poly-dl-ornithin (PDLO). Dette molekyle øger ikke kun overfladearealet til detektering af elektriske signaler, men øger også elektrisk ledningsevne46. Ved at gøre dette fremmer det cellulær vedhæftning, vækst og udvikling af funktionelle netværksegenskaber. En sådan optimering spiller en afgørende rolle i at øge effektiviteten af HD-MEA-platformen. Dette sikrer igen nøjagtig og konsistent analyse af mikroskala ex-vivo og in vitro connectomer og deres spatiotemporale affyringssekvenser. Især har PDLO vist sig at overgå andre substrater som polyethyleneimin (PEI) og poly-l-ornithin (PLO) i at fremme spontan fyringsaktivitet og lydhørhed over for elektriske stimuli i neuronale kulturer. Derudover er PDLO blevet brugt til overfladefunktionalisering på HD-MEA og vist sig at forbedre elektrode-skivekoblingsgrænsefladen og øge signal-støjforholdet i både OB- og HC-skiver26,29. Tilføjelsen af et specialbygget platinanker forstærker yderligere elektrode-skive-interfacekoblingen, hvilket fører til optagelser med et højere signal-støj-forhold.
Brugen af HD-MEA til både ex-vivo musehjerneskiver og in vitro humane iPSC-netværk introducerer en metode, der er dygtig til at udforske omfattende, multiscale og multimodal dynamik. Denne innovative tilgang medfører imidlertid betydelige udfordringer, især inden for datastyring 48,49,50,51. En enkelt HD-MEA-optagelse, der optages ved 18 kHz/elektrodesamplingfrekvens, genererer svimlende 155 MB/s data. Datamængden eskalerer hurtigt, når der tages højde for flere udsnit, forskellige farmakologiske tilstande eller længere registreringsperioder. En sådan tilstrømning af information kræver robuste lagringsinfrastrukturer og avancerede beregningsværktøjer til strømlinet behandling. HD-MEA-platformens evne til samtidig at indsamle data fra tusindvis af neuronale ensembler er både en velsignelse og en forhindring. Det giver suveræn indsigt i hjernefunktionernes beregningsdynamik, men det kræver også en raffineret analytisk ramme. I denne JoVE-protokol har vi givet eksempler på beregningsstrategier, herunder hændelsesregistrering i stor skala, klassificering, grafteori, frekvensanalyse og maskinindlæring. Disse metoder understreger den intensive indsats, der gøres for at tackle udfordringerne ved at analysere komplekse neurale data. Ikke desto mindre er der stadig betydelig plads til udvikling af mere avancerede beregningsværktøjer til at analysere disse multidimensionelle neurale datasæt. Bevæbnet med de rette værktøjer og metoder forstørres potentialet i HD-MEA-platformen, hvilket giver dyb indsigt i hjernefunktionernes forviklinger under både raske og patologiske tilstande.
I bund og grund tilbyder HD-MEA-platformen, når den integreres med de detaljerede protokoller og beregningsværktøjer, der diskuteres, en transformativ tilgang til forståelse af hjernens indviklede funktion. Ved at registrere storstilet, multiskala og multimodal dynamik giver det uvurderlig indsigt i processer som læring, hukommelse og informationsbehandling. Desuden har dets anvendelse i in vitro humane iPSC-netværk potentialet til at revolutionere lægemiddelscreening og personlig medicin. Selvom denne platform repræsenterer et betydeligt fremskridt inden for neurovidenskabelig forskning, er det imidlertid afgørende at anerkende og tackle de iboende tekniske udfordringer. Med løbende forbedringer og integration af avancerede beregningsværktøjer står HD-MEA-platformen klar til at indlede en ny æra med præcise diagnostiske værktøjer, identifikation af specifikke biomarkører og målrettede behandlinger for neurologiske lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af institutionelle fonde (DZNE), Helmholtz Association inden for Helmholtz Validation Fund (HVF-0102) og Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering (DIGS-BB). Vi vil også gerne anerkende platformen for adfærdsmæssige dyreforsøg på DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther og Jens Bergmann) for deres støtte. Vi vil gerne anerkende, at en del af figur 1 blev oprettet ved hjælp af platformen BioRender.com.
150 mm Glass Petri Dish | generic | generic | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
0.22 μm Sterile Filter Unit | Assorted | Assorted | Assorted |
90 mm Plastic Culture Dish | TPP | 93100 | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Agarose | Roth | 6351.5 | Brain Preparation Workspace |
Agarose Mold | CUSTOM | CUSTOM | Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Aluminum Foil | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Anesthesia chamber | generic | generic | Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544-25G | Solution Preparation Workspace |
Assorted Beakers | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 50 mL |
Assorted Luers | Cole Parmer | 45511-00 | Brain Slice Recording Workspace |
Assorted Volumetric flasks | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
BDNF | Peprotech | 450-02 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Biological Safety Cabinet with UV Lamp | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
BrainPhys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol |
Brainwave Software | 3Brain AG | Version 4 | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay | BrainXell | BX-0300 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Solution Preparation Workspace |
Carbogen | generic | generic | All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture |
Cell Culture Incubator | Assorted | Assorted | Assorted |
CMOS-based HD-MEA chip | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) | STEMCELL Technologies | 38010 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | Brain Slice Recording Workspace |
Curved Forceps | FST | 11052-10 | Brain Extraction Workspace |
DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 11330-032 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | STEMCELL Technologies | 37350 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Filter Paper | Macherey-Nagel | 531 011 | Brain Preparation Workspace |
Fine Brush | Leonhardy | 773 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Forceps | VITLAB | 67895 | Brain Slice Recording Workspace |
GDNF | Peprotech | 450-10 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Geltrex | Life Technologies | A1413201 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Glass pasteur pipette | Roth | 4518 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Solution Preparation Workspace |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Gravity-based Perfusion System | ALA | VC3-8xG | Brain Slice Recording Workspace |
HD-MEA Recording platform | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Heater | Warner Instruments | TC-324C | Brain Slice Recording Workspace |
Hemocytometer or Automated Cell Counter | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Hypo Needles | Warner Instruments | 641489 | Brain Slice Recording Workspace |
iCell GlutaNeurons Kit, 01279 | CDI | R1061 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Iris Scissors | Vantage | V95-304 | Brain Extraction Workspace |
Isoflurane | Baxter | HDG9623 | Brain Extraction Workspace |
KCl | Sigma Aldrich | P5405-250G | Solution Preparation Workspace |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Liquid Nitrogen Storage Unit | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Magnetic Stirrer | generic | generic | Solution Preparation Workspace |
Metal Screws | Thorlabs | HW-KIT2/M | Brain Slice Recording Workspace |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028-100ML | Solution Preparation Workspace |
MgSO4 | Sigma Aldrich | 63138-250G | Solution Preparation Workspace |
Microdissection Tool Holder | Braun | 4606108V | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Microdissection Tool Needle | Braun | 9186166 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Modular Stereomicroscope | Leica | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014-1KG | Solution Preparation Workspace |
NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751-100G | Solution Preparation Workspace |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | Solution Preparation Workspace |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Optical Cage System | Thorlabs | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Optical Table w/Breadboard | Thorlabs | SDA7590 | Brain Slice Recording Workspace |
PDLO | Sigma Aldrich | P0671 | HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace |
Penicillin-streptomycin, 100x | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Pipette tips | TipONE | S1120-8810 | Brain Slice Recording Workspace |
Pipettors | Assorted | Assorted | Assorted |
Platinum Anchor | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace |
Polyethylene Tubing | Assorted | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Pump | MasterFlex | 78018-22 | Brain Slice Recording Workspace |
Razor Blade | Apollo | 10179960 | Brain Preparation Workspace |
Reference Electrode Cell Culture Cap | CUSTOM | CUSTOM | Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Rubber Pipette Bulb | Duran Wheaton Kimble | 292000205 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL | Assorted | Assorted | Assorted |
Slice Recovery Chamber | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Spatula | ISOLAB | 047.06.150 | Brain Preparation Workspace |
Sucrose | Sigma Aldrich | 84100-1KG | Solution Preparation Workspace |
Super Glue | UHU | 358221 | Brain Slice Preparation Workspace |
Surgical Scissors | Peters Instruments | BC 344 | Brain Extraction Workspace |
Tabletop Centrifuge | Assorted | Assorted | Assorted |
TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Tissue Paper | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Trypan Blue | STEMCELL Technologies | 07050 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Upright Microscope | Olympus | CUSTOM | Imaging Workspace; Custom specifications and modifications |
Vacusip | Integra | 159010 | Brain Slice Recording Workspace |
Vibratome | Leica | VT1200s | Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool |
Vibratome Blade | Personna | N/A | Brain Slice Preparation Workspace |
Water Bath | Lauda | L000595 | Brain Slice Recovery Workspace |