과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리
Summary
이 프로토콜은 과립세포 세포가 없는 제브라피시에서 깨끗한 I기 난모세포를 신속하게 분리하기 위한 수정된 절차를 설명하여 난모세포별 연구를 위한 편리한 방법을 제공합니다.
Abstract
난모세포 발달에 대한 연구는 발달 생물학에서 중요한 의미를 지닙니다. 제브라피시(Danio rerio)는 난모세포에서 배아까지의 초기 발달 과정을 조사하기 위한 모델 유기체로 광범위하게 사용되었습니다. 제브라피시에서 난모세포는 체세포 과립세포(somatic granulosa cell)의 단일 층으로 둘러싸여 있습니다. 그러나 정확한 분석을 위해서는 순수한 난모세포를 얻는 것이 중요하기 때문에 난모세포에서 과립세포를 분리하는 것은 어려운 일입니다. 다양한 발달 단계에서 제브라피시 난모세포를 분리하기 위한 다양한 방법이 제안되었지만, 현재의 기술로는 과립구 세포를 완전히 제거하기에는 부족하여 난모세포에만 초점을 맞춘 게놈 분석의 정확도가 제한됩니다. 이 연구에서 우리는 제브라피시에서 순수 I기 난모세포를 분리하는 동시에 과립 세포 오염을 제거하는 빠르고 효율적인 프로세스를 성공적으로 개발했습니다. 이 기술은 생화학 및 분자 분석을 용이하게 하며, 특히 난모세포에 특이적인 후성유전학 및 게놈 구조 측면을 탐구하는 데 도움이 됩니다. 특히, 이 방법은 사용자 친화적이고, 난모세포 손상을 최소화하며, 후속 연구 및 분석을 위한 실용적인 솔루션을 제공합니다.
Introduction
제브라피쉬는 발달 생물학에서 가장 중요한 모델 시스템 중 하나입니다. 최근 몇 년 동안 수많은 연구에서 난모세포에서 배아에 이르기까지 중요한 생물학적 사건과 조절 과정을 연구하기 위한 모델로 제브라피시를 활용했습니다. 여기에는 난모세포의 발달과 성숙의 복잡한 과정1, 모계 유전자의 기능2, 모체-접합 전이의 조절3, 광범위한 오믹스 분석4이 포함된다.
난소 난포5,6 내에서 발달 중인 난모세포를 둘러싸고 육성하는 체세포인 과립세포는 이러한 발달 과정에서 중추적인 역할을 합니다. 원시 생식세포(primordial germ cell, PGCs)가 난자(oogonia)로 진화함에 따라, 이들은 과립세포(granulosa cell)의 단층(monolayer)으로 둘러싸이게 된다7. 외부 thecal cell과 함께, oocyte 및 그 주변의 과립 세포는 성숙한 난포를 구성한다8. 생식 세포와 체세포 사이의 근본적인 차이점을 감안할 때, 특히 게놈 관련 분석의 경우 순수한 난모세포 샘플을 얻는 것이 필수적입니다.
제브라피쉬의 여포 구조 내에서, 과립세포 세포는 전형적으로 직경이 수 미크론에 불과하며8 이는 과립세포와 난모세포 사이의 긴밀한 상호 연결을 강조한다9. 이러한 밀접한 연관성은 과립구 세포와 난모세포의 수와 부피가 모두 상당한 차이(단일 난모세포에 비해 수백 개의 과립세포)로 인해 완전한 분리를 달성하는 데 어려움을 초래합니다10,11. 단일 과립 세포에 대한 최소한의 오염조차도 특히 난모세포를 표적으로 하는 다운스트림 분석을 방해할 수 있습니다. 따라서 게놈 및 후성유전학적 특성에 초점을 맞춘 연구에서는 과립종 세포를 제거하는 것이 필수적입니다.
잘 특성화된 형태학적 기준의 이점을 활용하여 각 단계의 난모세포는 직경11을 기준으로 구별할 수 있습니다. 제브라피쉬의 난자형성 과정은 형태학과 핵형(karyotype) 11에 따라 5단계로 분류된다. I기 난모세포(직경 7-140μm)는 감수분열 시작부터 감수분열 I의 초기 단계까지 난모세포를 포함하며, 결정적으로 이 난모세포는 투명하여 투과광을 통해 중심핵을 관찰할 수 있습니다(그림 1Ai). II기 난모세포(직경 140-340μm)는 점차 거품이 생기고 반투명해집니다. 난포가 커지고 대뇌 피질 폐포가 증식함에 따라 중앙의 생식 소포를 구별하기가 어려워집니다12 (그림 1Aii). III기 난모세포(직경 340-690μm)는 점차 비텔로게닌을 축적하고 신선한 난포는 점점 불투명해집니다(그림 1Aiii). 감수분열은 IV기 난모세포(직경 690-730μm)에서 염색체가 II감수분열의 중앙으로 들어가 정체됨에 따라 계속됩니다(그림 1Aiv). V기 난모세포(직경 730-750μm)는 성숙하여 배란을 위한 준비가 되었습니다 7,11(그림 1Av).
앞서 언급한 각 단계의 고유한 특성을 바탕으로, 콜라겐분해효소 I, 콜라겐분해효소 II, 히알루로니다아제를 함유한 소화액을 사용하여 제브라피시 난소를 소화한 후 특정 크기의 세포 여과기를 통해 여과함으로써 난모세포를 I기에서 III기까지 분리하는 방법이 제안되었다(13). 그러나 이 방법을 사용하면 다양한 발달 단계에서 난모세포를 얻을 수 있지만 난모세포와 과립세포를 완전히 분리하지는 못합니다. 다른 연구자들은 또한 난모세포에서 과립세포를 분리하는 방법을 제안했습니다. 그러나 이러한 방법은 주로 기계적 접근법에 의존하는데, 이는 난모세포 손상을 유발할 수 있고, 시간이 많이 소요되며, 분석을 위해 상당한 수의 난모세포를 얻기에는 부적절하다14,15.
기존 방법의 한계와 특정 연구 요구 사항을 감안할 때 이 연구는 난모세포와 과립세포를 철저히 분리하고 분석을 위한 충분한 수의 깨끗한 I 단계 난모세포를 얻는 절차를 확립하는 것을 목표로 합니다. 참조된 방법13을 확장하여, 우리는 더 부드럽고 난모세포의 분산과 과립구 세포의 해리를 촉진하는 개선된 소화 완충액( 재료 표 참조)을 사용합니다. 그 후, 난모세포는 세포 여과기를 통과한 후 세척 및 추가 현미경 선택을 거쳐 많은 수의 깨끗한 I기 난모세포를 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 다운스트림 분석(특히 게놈 분석)을 위해 과립세포를 제외한 순수하고 깨끗한 I기 난모세포를 분리하는 방법을 개발했습니다. 이 수정된 방법을 참조된 방법13과 비교하면, 이 방법을 사용하여 얻은 I기 난모세포는 형태학적으로 온전하고 수가 충분하며 다른 체세포와의 오염이 없어 다양한 후속 연구 및 분석에 적합합니다. 더욱이, 다른 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국국가자연과학재단(32170813, 31871449)과 쓰촨성 과학기술부(2024NSFSC0651)의 지원을 받았으며, 쓰촨대학교 화화병원 1·3·5 우수분야 프로젝트(2024HXFH035)가 수행했다. 저자들은 이 연구와 관련된 제브라피시 사육에 대해 소아외과 연구소의 Zhao Wang과 Yanqiu Gao에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자들은 또한 본 검토에 참여한 모든 검토자들과 이 원고를 준비하는 동안 영어 편집 서비스를 제공해준 MJEditor(www.mjeditor.com)에게도 감사의 뜻을 전한다.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
Referências
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