Validazione preliminare delle coordinate di iniezione stereotassiche tramite criosezione
Summary
Il presente protocollo descrive una strategia pratica per accelerare la fase di verifica delle coordinate di iniezione stereotassiche prima di eseguire il tracciamento virale utilizzando coloranti e sezioni congelate.
Abstract
L’iniezione stereotassica di una specifica regione del cervello costituisce una tecnica sperimentale fondamentale nelle neuroscienze di base. I ricercatori basano comunemente la loro scelta dei parametri di iniezione stereotassica su atlanti cerebrali di topo o materiali pubblicati che impiegano varie popolazioni/età di topi e diverse apparecchiature stereotassiche, richiedendo un’ulteriore convalida dei parametri delle coordinate stereotassiche. L’efficacia dell’imaging del calcio, delle manipolazioni chemiogenetiche e optogenetiche si basa sull’espressione precisa dei geni reporter all’interno della regione di interesse, che spesso richiede diverse settimane di sforzo. Pertanto, è un compito che richiede tempo se le coordinate della regione del cervello bersaglio non vengono verificate in anticipo. Utilizzando un colorante appropriato al posto di un virus e implementando la criosezione, i ricercatori possono osservare il sito di iniezione immediatamente dopo la somministrazione del colorante. Ciò facilita le regolazioni tempestive per coordinare i parametri nei casi in cui esistano discrepanze tra il sito di iniezione effettivo e la posizione teorica. Tali aggiustamenti migliorano significativamente l’accuratezza dell’espressione virale all’interno della regione target negli esperimenti successivi.
Introduction
Quasi tutti i moderni strumenti di neuromodulazione, compresi gli strumenti di registrazione del calcio in vivo, optogenetici e chemiogenetici, richiedono l’uso di coordinate stereotassiche per colpire l’area cerebrale di interesse 1,2,3, costituendo la base della manipolazione neurale. Le coordinate stereotassiche per le regioni cerebrali del topo sono definite in relazione a bregma e lambda, i punti di riferimento ossei sul cranio, che formano il cosiddetto sistema di coordinate stereotassiche derivato dal cranio. Sia bregma che lambda possono fungere da punto zero delle coordinate tridimensionali. I tre assi sono anteroposteriore (AP), mediolaterale (ML) e dorso-ventrale (DV), che rappresentano gli assi y, x e z sul display digitale degli strumenti stereotassici. Per regioni cerebrali ben note, i parametri delle coordinate stereotassiche di un’area specifica possono essere ottenuti dagli atlanti del cervello di topo4 (ad esempio, Paxinos e il cervello di topo di Franklin in coordinate stereotassiche) e/o dalla letteratura pubblicata 5,6. Tuttavia, è necessaria un’ulteriore convalida a causa delle variazioni nell’attrezzatura stereotassica e dell’età/popolazione dei topi utilizzati da diversi ricercatori.
La struttura è la base della funzione. I circuiti neurali costituiscono la base di molte funzioni cerebrali, come le attività cognitive, le emozioni, la memoria,le funzioni sensoriali e motorie. Etichettare la struttura e manipolare l’attività dei circuiti neurali è vitale per comprendere la funzione di uno specifico circuito neurale. Negli ultimi decenni, i traccianti neurali si sono evoluti attraverso molte generazioni; le prime ricerche hanno adottato l’agglutinina del germe di grano (WGA) e l’agglutinina phaseolus vulgaris (PHA) come traccianti anterogradi, e il fluorogold (FG), la subunità B della tossina del colera (CTB), la carbocianina come traccianti retrogradi. Tuttavia, a differenza dei traccianti virali, questi traccianti neurali tradizionali non possono integrare geni esogeni nell’ospite, né hanno selettività per tipo di cellula. Al giorno d’oggi, la strategia virale è diventata una proposta importante durante la ricerca di base sulle neuroscienze. Per diversi scopi di ricerca, è possibile selezionare vari strumenti virali 7,8. Esistono virus non transsinaptici, virus trans-multisinaptici (retrogradi e anterogradi) e virus trans-monosinaptici (retrogradi e anterogradi). Ogni categoria contiene diversi tipi con le rispettive caratteristiche.
Il processo di somministrazione ed espressione virale richiede molto tempo e risorse, spesso richiede settimane o anche di più. Tra i vari vettori virali, il virus adeno-associato è stato identificato come un mezzo promettente per la consegna genica, fornendo un’ampia finestra che va da 3 a 8 settimane dopo l’iniezione per la procedura sperimentale 7,8. Con l’evolversi dell’AAV, l’analisi può essere eseguita 2-3 settimane dopo la somministrazione 9,10. Anche altri traccianti di circuiti neurali, come il virus della pseudorabbia (PRV) e il virus della rabbia (RV), richiedono un periodo di tracciamento di almeno 2-7 giorni 11,12,13,14,15. Pertanto, una verifica preliminare del sito di iniezione prima di osservare i segnali di fluorescenza è efficace sia in termini di tempo che di costi.
Per facilitare una verifica semplice e rapida delle iniezioni stereotassiche, in questo studio, viene somministrato un colorante prima dei vettori virali e la criosezione consente ai ricercatori di osservare il sito di iniezione e tracciarlo entro 30 minuti dopo l’iniezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo ha descritto una strategia stabile per verificare l’accuratezza delle iniezioni cerebrali stereotassiche 5,6 più rapidamente e semplicemente prima del tracciamento virale, ma l’aspetto insostituibile dell’espressione genica reporter nella regione del cervello è cruciale per la marcatura della regione del cervello. Il colorante blu che abbiamo utilizzato ha permesso la visualizzazione immediata del sito di iniezione.
D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (sovvenzione n. 82101249 a XY Sun), Fondazione di ricerca post-dottorato della Cina (sovvenzione n. 2022M722125 a XY Sun). Programma di vela di Shanghai (sovvenzione n. 21YF1425100 a SH Chen). Progetto Speciale per la Ricerca Clinica della Commissione Sanitaria Municipale di Shanghai (sovvenzione n. 202340088 a J Zhou). Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (sovvenzione n. 82101262 a X Zhang, sovvenzione n. 82101287 a SH Chen).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
Referências
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
