우리는 단일 및 복합 열, 가뭄 및 침수 처리에 대한 형태학적 및 생리학적 반응을 결정하기 위해 이미지 기반 표현형 프로토콜을 설계했습니다. 이 접근 방식을 통해 전체 플랜트 수준, 특히 지상 부품에서 초기, 후기 및 복구 반응을 식별할 수 있었고 여러 이미징 센서 사용의 필요성을 강조했습니다.
고처리량 이미지 기반 표현형은 시간이 지남에 따라 특정 조건에서 식물의 발달 및 성능을 비침습적으로 결정할 수 있는 강력한 도구입니다. 여러 이미징 센서를 사용하면 식물 바이오매스, 광합성 효율, 캐노피 온도 및 잎 반사율 지수를 포함한 많은 관심 특성을 평가할 수 있습니다. 식물은 극심한 폭염, 홍수 및 가뭄으로 인해 작물 생산성이 심각하게 위협받는 현장 조건에서 여러 스트레스에 자주 노출됩니다. 스트레스가 일치하면 시너지 또는 적대적 상호 작용으로 인해 식물에 미치는 영향이 뚜렷할 수 있습니다. 감자 식물이 자연적으로 발생하는 스트레스 시나리오와 유사한 단일 및 복합 스트레스에 어떻게 반응하는지 설명하기 위해 결절화가 시작될 때 선택된 감자 품종(Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta)에 5가지 다른 처리를 가했습니다(예: 제어, 가뭄, 열, 침수 및 열, 가뭄 및 침수 스트레스의 조합). 우리의 분석에 따르면 침수 스트레스는 식물 성능에 가장 해로운 영향을 미치며, 광계 II의 양자 수율 및 효율성 감소, 캐노피 온도 및 수분 지수 증가를 포함하여 기공 폐쇄와 관련된 빠르고 급격한 생리적 반응을 초래했습니다. 열과 결합된 스트레스 치료 하에서, 스트레스의 초기 단계에서 상대적 성장률이 감소하였다. 가뭄과 복합적인 스트레스 하에서, 식물의 부피와 광합성 성능은 떨어지고 스트레스의 후기 단계에서 온도가 증가하고 기공이 폐쇄되었습니다. 선택된 표현형 프로토콜과 함께 정의된 환경 조건에서 최적화된 스트레스 처리의 조합을 통해 단일 및 결합 응력에 대한 형태학적 및 생리학적 반응의 역학을 밝힐 수 있었습니다. 여기에서는 여러 기후 변화 관련 스트레스에 대한 회복력을 나타내는 식물 특성을 식별하려는 식물 연구자에게 유용한 도구를 제공합니다.
폭염, 홍수 및 가뭄 사건의 강도와 빈도 증가를 포함한 기후 변화의 잠재적 영향은 작물 재배에 부정적인 영향을 미칩니다1. 기후 변화가 작물 변동성에 미치는 영향과 그에 따른 연간 작물 생산량의 변동을 이해하는 것이 중요하다2. 인구와 식량 수요가 증가함에 따라 작물 식물의 수확량을 유지하는 것이 어려운 과제가 되었으며, 따라서 육종을 위한 기후 탄력적인 작물을 찾는 것이 시급히 필요합니다 3,4. 감자(Solanum tuberosum L.)는 영양가가 높고 물 사용 효율성이 높아 세계 식량 안보에 기여하는 필수 식량 작물 중 하나입니다. 그러나, 불리한 조건 하에서 성장과 수확량의 감소는 특히 감수성이 높은 품종 5,6에서 주요 문제이다. 많은 연구에서 농업 관행, 내성이 있는 유전자형 찾기, 스트레스가 발달 및 수확량에 미치는 영향 이해 7,8,9를 포함하여 감자 작물 생산성을 유지하기 위한 대체 접근 방식을 조사하는 것의 중요성을 강조했으며, 이는 유럽 감자 재배자(또는 농부)에게도 매우 요구됩니다10.
이미지 기반 표현형을 포함한 자동화된 표현형 분석 플랫폼은 관심 있는 관련 형질을 선택하는 데 필수적인 식물 구조 및 기능의 정량 분석을 가능하게 합니다11,12. 고처리량 표현형분석은 재현 가능하고 신속한 방식으로 다양한 형태학적 및 생리학적 관심 특성을 결정하기 위한 고급 비침습적 기법입니다 13. 표현형은 환경 영향과 관련하여 유전형 차이를 반영하지만, 통제된 조건 하의 식물을 스트레스와 비교하면 광범위한 표현형 정보를 특정 (스트레스) 조건에 연결할 수 있다14. 이미지 기반 표현형은 표현형 변동성을 설명하는 데 필수적이며, 개체군 크기(15)에 관계없이 식물 발달 전반에 걸쳐 일련의 형질을 스크리닝할 수도 있습니다. 예를 들어, RGB(Red-Green-Blue) 이미징 센서를 사용하여 잎의 모양, 크기 및 색상 지수를 포함한 형태학적 특성을 측정하여 식물의 성장과 발달을 결정하는 데 사용됩니다. 또한, 광합성 성능, 캐노피 온도 및 잎 반사율을 포함한 생리학적 특성의 측정은 엽록소 형광, 열적외선(IR) 및 초분광 이미징16과 같은 여러 유형의 센서를 사용하여 정량화됩니다. 통제된 환경에서의 최근 연구는 감자17의 열, 보리18, 쌀19, 밀20의 가뭄 및 열처리와 같은 비생물적 스트레스 하에서 식물의 다양한 메커니즘과 생리적 반응을 평가하는 데 이미지 기반 표현형을 사용할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 여러 스트레스 상호 작용에 대한 식물의 반응을 연구하는 것은 복잡하지만, 이번 연구 결과는 기후 조건의 급격한 변화에 대처하는 식물의 메커니즘을 이해하는 데 새로운 통찰력을 제공합니다21.
식물의 생리학적 및 형태학적 반응은 비생물적 스트레스 조건(고온, 물 부족 및 홍수)에 의해 직접적인 영향을 받아 수확량 감소를 초래한다22. 감자는 다른 작물에 비해 물 사용 효율이 높지만, 뿌리 구조가 얕아 수확량과 수확량에 부정적인 영향을 미친다5. 가뭄 수준의 강도와 지속 기간에 따라 잎 면적 지수가 감소하고, 새로운 잎 형성을 억제하는 캐노피 성장의 지연이 스트레스의 후기 단계에서 뚜렷하게 나타나 광합성 속도의 감소를 초래한다23. 물의 임계값 수준은 과도한 물 또는 장기간의 가뭄 기간으로 인해 매우 중요하며, 산소 제한, 뿌리 수력 전도도 감소 및 가스 교환 제한으로 인해 식물 성장 및 괴경 발달에 부정적인 영향을 미칩니다24,25. 더욱이, 감자는 최적 수준 이상의 온도로 인해 괴경 시작, 성장 및 동화 속도가 지연되는 고온에 민감하다26. 스트레스가 복합적으로 나타날 때, 생화학적 규칙과 생리적 반응은 개별 스트레스 반응과 다르며, 이는 스트레스 조합에 대한 식물의 반응을 조사할 필요성을 강조한다27. 결합된 스트레스는 식물 성장의 (훨씬 더) 심각한 감소와 생식 관련 형질에 대한 결정적 영향을 초래할 수 있다28. 스트레스 조합의 영향은 각 스트레스가 다른 스트레스에 비해 우세한 정도에 따라 달라지며, 이는 식물 반응을 강화하거나 억제합니다(예: 가뭄은 일반적으로 기공이 닫히는 반면 기공은 열 스트레스 하에서 잎 표면이 냉각될 수 있도록 열려 있습니다). 그러나, 결합 응력 연구는 여전히 등장하고 있으며, 이러한 조건 하에서 플랜트 반응을 매개하는 복잡한 조절을 더 잘 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요하다29. 따라서 이 연구는 형태 생리학적 반응을 평가하고 단일 및 결합 스트레스 처리에서 감자 전체 성능의 기본 메커니즘을 이해하는 데 적합할 수 있는 여러 이미징 센서를 사용하는 표현형 프로토콜을 강조하고 권장하는 것을 목표로 합니다. 가설에 따르면, 여러 이미징 센서를 결합하는 것은 식물 스트레스 반응 중 초기 및 후기 전략을 특성화하는 데 유용한 도구임이 입증되었습니다. 이미지 기반 표현형 프로토콜 최적화는 식물 연구자와 육종가가 비생물적 스트레스 내성에 대한 관심 형질을 찾을 수 있는 대화형 도구가 될 것입니다.
개선된 고급 고해상도 이미징 도구 및 컴퓨터 비전 기술은 재현 가능한 방식으로 대규모 식물 이미지로부터 정량적 데이터를 얻기 위해 식물 표현형의 급속한 개발을 가능하게 했습니다39. 이 연구는 단일 및 결합 비생물적 스트레스 하에서 식물의 동적 반응을 모니터링하기 위해 현재 사용 가능한 이미징 센서 어레이를 사용하여 고처리량 이미지 기반 방법론을 조정하고 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 적용된 접근법의 몇 가지 중요한 단계에서는 응력 적용 및 측정에 적합한 이미징 프로토콜 선택을 포함하여 조정이 필요합니다. 이미지 획득을 위해 여러 센서를 사용하면 주요 표현형 형질(예: 식물 성장, 광합성 효율성, 기공 조절, 잎 반사율 등)을 정량화할 수 있습니다. 또한 감자 식물이 다양한 비생물적 스트레스에 어떻게 반응하는지에 대한 이해를 향상시킵니다. 이는 기후 내성 유전자형40을 개발하기 위한 식물 육종 프로젝트를 가속화하기 위한 핵심 전제 조건입니다. 유도 스트레스에 대한 형태 학적 반응은 발달 단계에 따라 다릅니다. 예를 들어, 스톨론 또는 괴경 시작 단계에서 응력을 유발하는 것은 잎 및 식물의 발달을 억제하고 스톨론의 수를 제한하여 최종 수율을 감소시킨다(41). 그러나 불리한 조건 하에서 식물은 스트레스 유발 세포 손상을 예방하고 복구하기 위한 적응 반응으로 스트레스 반응을 활용한다42. 식물은 심각도수준 43에 따라 스트레스 조건을 피하고 견딜 수 있는 적응 메커니즘을 가지고 있습니다.
식물의 메커니즘을 이해하려면 이미징 센서를 사용하여 스트레스의 적절한 지속 시간과 강도를 유도하고 스트레스에 대한 식물의 반응을 결정하는 것이 중요한 단계 중 하나로 간주됩니다. 여러 응력이 일치하면 한 응력의 강도가 응력의 조합, 강도 및 지속 시간에 따라 다른 응력의 효과보다 우선할 수 있습니다. 따라서 스트레스 효과가 합산되거나 반대되는 반응이 (부분적으로) 서로를 상쇄하여 궁극적으로 식물에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구에서 선택한 프로토콜은 충분한 스트레스 수준이 적용되었는지 확인하기 위해 이전 경험을 기반으로 했습니다. 예를 들어, 가뭄 스트레스의 적용은 이전 실험에서와 같이 중간 수준으로 조정되었으며, 반응은 엽록소 형광 이미징을 기반으로 한 스트레스 초기 단계의 대조 처리와 다르지 않았습니다. 이것은 틸라코이드 막의 전자에 대한 대체 싱크 역할을하는 광 호흡의 발생과 광시스템 II44,45에 대한 보호 메커니즘 때문입니다. 결합된 스트레스 반응 하에서, 식물이 경미한 1차 스트레스 요인에 노출되면 다음 스트레스 요인에 대한 내성이 향상될 수 있으며, 이는 유익하거나 해로운 영향을 미칠 수 있다46. 이 연구에서는 개별 가뭄 스트레스에 비해 결합된 스트레스 하에서 더 강력한 반응이 관찰되었습니다. 다른 생리적 반응을 조사한 결과, 가뭄 시 기공이 가까워짐에 따라 과도한 수분 손실을 피하기 위해 ΔT(deltaT)가 증가하는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 열과 가뭄 스트레스가 결합된 밀에서 20의 결과에 따라 잎 냉각을 향상시키기 위해 기공 개방을 반영하는 대조군에 비해 ΔT가 더 낮은 열 스트레스 하에서 역반응이 관찰되었습니다20. 침수 중에는 기공 폐쇄로 인한 ΔT의 증가는 토양의 산소 결핍과 뿌리 수분 항상성의 붕괴로 인해 발생하며, 이로 인해 물 스트레스 반응의 핵심 호르몬인 ABA가 증가하여 증산 흐름이 감소합니다47.
식물 스트레스 연구에서 스트레스 및 후속 회복 처리의 지속 시간은 스트레스 강도에 정비례합니다. 예를 들어, 토양 수분을 20%의 현장 용량(FC)으로 유지하는 것과 같은 중간 정도의 가뭄 스트레스는 일반적으로 재관개 하루 후에 회복되는 가역적 표현형 변화를 유도합니다. 대조적으로, 침수와 같은 심각한 스트레스 조건은 광범위한 표현형 손상을 초래하여 더 긴 회복 기간을 필요로 합니다. 처리 기간을 표준화하는 것이 이상적이지만, 응력 강도의 내재적 변동성을 실험 설계에서 고려해야 합니다.
두 번째 중요한 단계는 적절한 프로토콜을 선택하고 각 센서에 대한 설정을 최적화하는 것입니다. 엽록소 형광은 응력 하에서 광합성 장치의 성능을 결정하는 강력한 도구이다48. 다양한 엽록소 형광 측정 프로토콜은 연구 질문 및 실험 설계에 따라 밝은 또는 어두운 적응 식물로 선택할 수 있습니다49. 이 연구에서, 선택된 프로토콜(짧은 광 응답)은 다양한 조건(50)에서 광합성 성능을 나타내는 Fv‘/Fm‘, φPSII 및 qL을 포함한 다양한 형질의 측정을 가능하게 한다. 이전 연구에 따르면 고처리량 표현형에 사용된 프로토콜은 스트레스 처리의 다양한 응용 분야에서 식물의 광합성 효율성을 조사하고 건강한 식물과 스트레스 받은 식물을 구별하는 데 효과적입니다14,20. 실험 설계에 따라 식물 개체군이 많은 고처리량 시스템에서 측정할 때 선택한 프로토콜의 지속 시간을 고려하는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 단시간 프로토콜을 사용하여 광 적응 식물에 대한 엽록소 형광 측정은 다양한 처리에서 반응을 구별하기 위해 선택되었습니다. 유전자형-환경 상호작용은 많은 표현형 형질에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 측정 중에 매우 중요하다12. 광합성 제한에 대한 일일적 영향을 최소화하기 위해 측정 시간이 짧은 시간에 완료되어야 한다는 점을 고려하는 것이 필수적이다51.
열적외선 이미징을 사용하여 캐노피 온도를 결정하고 다양한 치료법에서 기공 조절을 이해하였다52. 히팅 월이 카메라의 반대쪽에 위치한 곳에 기술 최적화가 사용되었고 월의 온도가 동적으로 제어되고 프로그래밍 가능했다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 따라서, 환경 센서가 통합된 배경 가열 벽을 조정하는 것은 이미징된 물체의 온도에 대한 배경 온도의 대비를 증가시킴으로써 배경에서 식물을 적절하게 선택하기 위해 필요합니다.
이미지 분석이 자동화되더라도, 식물(53)을 정밀하게 선택하기 위해 RGB 이미징에서 적절한 바이너리 마스크를 얻기 위해서는 RGB 임계값 인덱스를 조정하는 것이 여전히 요구된다. 또한 디지털 바이오매스 및 성장률을 포함한 정량적 매개변수를 적절하게 추정하기 위해 여러 각도를 선택하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 식물 부피와 상대 성장률을 정확하게 계산하기 위해 RGB 측면도의 세 가지 각도(0°, 120° 및 240°)를 선택하고 평균을 냈습니다.
스펙트럼 범위에 따라, 초분광 이미징(hyperspectral imaging) 54을 사용하여 많은 생리학적 특성을 조사할 수 있다. 반사율 지수 중 어느 것이 필요한 정보를 제공하고 다양한 조건에서 식물의 반응을 보여주는지 결정해야 합니다14. 초분광 지수와 다른 생리적 형질 사이의 상관관계를 결정하기 위해 내성 품종 및 식물 표현형을 스크리닝하는 데 매우 요구된다55. 이 연구에서 침수 처리된 식물은 VNIR 이미징에서 엽록소 함량과 광합성 효율에서 뚜렷한 반응을 보였습니다. 또한, 열처리 및 침수 하에서 SWIR 이미징으로 계산된 수분 지수에서 다른 기공 규정과 잎의 수분 함량이 다르기 때문에 다른 반응이 관찰되었습니다.
따라서 이러한 결과는 설정을 최적화한 후 이러한 접근 방식의 유용성과 기후 내성과 관련된 스트레스 특성을 찾기 위해 여러 센서를 사용할 수 있는 잠재력을 강조합니다. 여러 이미징 센서를 사용하여 반응의 역학을 평가하는 것은 육종 프로그램을 개선하는 강력한 도구 중 하나로 사용될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 ADAPT 프로젝트(Accelerated Development of multiple-stress tolerant Potato)는 보조금 계약 No GA 2020 862-858에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 지원받았습니다. 이 작업은 체코 공화국 교육, 청소년 및 스포츠부(Ministry of Education, Youth and Sports)의 유럽 지역 개발 기금(European Regional Development Fund) 프로젝트 “SINGING PLANT”(no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446)입니다. CEITEC MU의 핵심 시설 식물 과학은 재배 시설 지원으로 인정 받고 있습니다. 우리는 이 연구에 사용된 체외 절단을 제공한 Meijer BV를 인정합니다. 그림 2의 그래픽 디자인을 도와준 Lenka Sochurkova와 Photon Systems Instruments(PSI) Research Center(Drásov, 체코)에서 실험 중 식물 재료 준비를 도와준 Pavla Homolová에게 감사드립니다.
1.1” CMOS Sensor with RGB camera | PSI, Drásov, Czech Republic | https://psi.cz/ | The sensor delivers a resolution of 4112 × 4168 pixels for side view and 2560 × 1920 pixels for top view. The sensor is extremely sensitive and is a real megapixel CCD replacement and produces sharp, low-noise images |
FluorCam | PSI, Drásov, Czech Republic | FC1300/8080-15 | Pulse amplitude modulated (PAM) chlorophyll fluorometer |
Fluorcam 10 software | PSI, Drásov, Czech Republic | Version 1.0.0.18106 | For Chlorophyll fluorescence images visualization and analysis |
GigE PSI RGB – 12.36 Megapixels Camera | PSI, Drásov, Czech Republic | https://psi.cz/ | For the side view projections, line scan mode was used with a resolution of 4112 px/line, 200 lines per second. The imaged area from the side view was 1205 × 1005 mm (height × width), while the imaged area from the top view position was 800 × 800 mm. |
Hyperspectral Analyzer software | PSI, Drásov, Czech Republic | Version 1.0.0.14 | For hyperspectral images visualization and analysis |
Hyperspectral camera HC-900 Series | PSI, Drásov, Czech Republic | https://hyperspec.org/products/ | Visible-near-infrared (VNIR) camera 380-900 nm with a spectral resolution of 0.8 nm FWHM |
Hyperspectral camera SWIR1700 | PSI, Drásov, Czech Republic | https://hyperspec.org/products/ | Short-wavelength infrared camera (SWIR) camera 900 – 1700 nm with a spectral resolution of 2 nm FWHM |
InfraTec thermal camera (VarioCam HEAD 820(800)) | Flir, United States | https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/ | Resolution of 1024 × 768 pixels, thermal sensitivity of < 20 mK and thermal emissivity value set default to 0.95. with a scanning speed of 30 Hz and each line consisting of 768 pixels. The imaged area was 1205 × 1005 mm (height × width). |
LED panel | PSI, Drásov, Czech Republic | https://led-growing-lights.com/products/ | Equipped with 4 × 240 red-orange (618 nm), 120 cool-white LEDs (6500 K) and 240 far-red LEDs (735 nm) distributed equally over an imaging area of 80 × 80 cm |
Light, temperature and relative humidity sensors | PSI, Drásov, Czech Republic | https://psi.cz/ | Sensors used to monitor controlled conditions in greenhouse |
MEGASTOP Blue mats | Friedola | 75831 | To cover soil surface |
Morphoanalyzer software | PSI, Drásov, Czech Republic | Version 1.0.9.8 | For RGB images visualization and analysis and color segmentation analysis |
PlantScreen Data Analyzer software (Version 3.3.17.0) | PSI, Drásov, Czech Republic | https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/ | To visualize and analyze the data from all imaging sensors, watering-weighing unit and environmental conditions in greenhouse |
PlantScreen Modular system | PSI, Drásov, Czech Republic | https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/ | Type of phenotyping platform |
Plantscreen Scheduler software | PSI, Drásov, Czech Republic | Version 2.6.8368.25987 | To plan the experiment and set the measuring protocol |
SpectraPen MINI | PSI, Drásov, Czech Republic | https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details | Light meter to adjust light level on a canopy level |
TOMI-2 high-resolution camera | PSI, Drásov, Czech Republic | https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/ | Resolution of 1360 × 1024 pixels, frame rate 20 fps and 16-bit depth) with a 7-position filter wheel is mounted on a robotic arm positioned in the middle of the multi-color LED light panel with dimensions of 1326 x 1586 mm. |
Walk-in FytoScope growth chamber | PSI, Drásov, Czech Republic | https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/ | Type of chambers used to grow the plant |