JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי לייצור תקע קומבינטורי

Published: December 01, 2023
doi:
10.3791/66154
, , ,
1Department of Biomedical Engineering, Institute for Complex Molecular Systems,Eindhoven University of Technology

Summary

הייצור של התקן דו-שכבתי מבוסס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) לייצור ספריות קומבינטוריות בתחליבים של מים בשמן (תקעים) מוצג כאן. החומרה והתוכנה הדרושים לאוטומציה של ייצור תקעים מפורטים בפרוטוקול, ומודגם גם ייצור ספרייה כמותית של תקעים פלואורסצנטיים.

Abstract

מיקרופלואידיקה טיפתית היא כלי רב-תכליתי המאפשר ביצוע מספר רב של תגובות בתאי ננוליטר מובחנים מבחינה כימית. מערכות כאלה שימשו לתמצת מגוון תגובות ביוכימיות – מדגירה של תאים בודדים ועד יישום תגובות PCR, מגנומיקה לסינתזה כימית. צימוד התעלות המיקרופלואידיות עם שסתומי הבקרה מאפשר שליטה על פתיחתן וסגירתן, ובכך מאפשר ייצור מהיר של ספריות קומבינטוריות בקנה מידה גדול המורכבות מאוכלוסיית טיפות בעלות הרכבים ייחודיים. במאמר זה מוצגים פרוטוקולים לייצור ותפעול של התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי מבוסס PDMS מונחה לחץ, שניתן להשתמש בו ליצירת ספריות קומבינטוריות של תחליבים של מים בשמן הנקראות תקעים. על ידי שילוב תוכנות וחומרה מיקרופלואידית, ניתן לשלוט ולתפעל את זרימת הנוזלים הרצויים במכשיר כדי ליצור ספריות תקע קומבינטוריות ולשלוט בהרכב ובכמות של אוכלוסיות התקעים המרכיבות. פרוטוקולים אלה יזרזו את תהליך יצירת המסכים הקומבינטוריים, במיוחד כדי לחקור תגובה תרופתית בתאים מביופסיות של חולי סרטן.

Introduction

מיקרופלואידיקה מאפשרת מניפולציה של כמויות קטנות של נוזלים במיקרו-ערוצים1. היקף הפעולה של התקנים מיקרופלואידים טיפוסיים הוא עשרות עד מאות מיקרומטרים המאפשרים מזעור של תגובות כימיות וביולוגיות, ובכך מאפשרים לבצע תגובות כאלה עם כמויות קטנות יחסית של ריאגנטים. בתחילה, התקנים microfluidic היו מיוצרים עם חומרים כגון סיליקון2 וזכוכית3. למרות שהם עדיין בשימוש4, הם מציבים בעיות מסוימות, כגון תאימות ממס, עלות ייצור גבוהה, וקשיים בשילוב בקרות עבור זרימת נוזלים 5,6. מתודולוגיות ייצור מבוססות PDMS, המכונות ליתוגרפיה רכה, מציעות חלופה זולה לאב טיפוס מהיר של התקנים7 ודרך לייצר התקנים רב-שכבתיים מורכבים8. הוספת שסתומים ומשאבות להתקני PDMS מאפשרת את היכולת לשלוט בניתוב ובמהירות הנוזלים במכשירים 9,10. פותחו מספר שיטות לתכנון והפעלה של מיקרו-שסתומים באופן הפיך או בלתי הפיך – לדוגמה, שסתומים דו-מתכתיים העשויים סיליקון ואלומיניום, המופעלים תרמית11 או שימוש בגז שנוצר מתגובה אלקטרוכימית כדי להסיט קרום סיליקון ניטריד12. Gu et al. מדגימים את השימוש בפינים המכניים של צג ברייל כדי להפעיל לחץ על מיקרו-ערוצים כדי לווסת זרימה13. קבוצה אחת של מיקרו-שסתומים שצברה פופולריות היא השסתומים הפנאומטיים מבוססי PDMS שפותחה על ידי קבוצת סטיבן קווייק14. בדרך כלל, שסתומים כאלה מורכבים משני microchannels orthogonal – ערוץ זרימה ערוץ בקרה. עם הפעלת לחץ על תעלת הבקרה, קרום PDMS דק מסיט את תעלת הזרימה, סוגר אותה ובכך קוטע את זרימת הנוזל. לאחר הדיכאון, הממברנה נרגעת, ובכך פותחת את ערוץ הזרימה ומאפשרת את חידוש זרימת הנוזלים. שסתומי PDMS מאפשרים בכך ויסות זרימה בצורה חזקה והפיכה מכיוון שניתן ללחוץ על תעלת הבקרה ולהוריד אותה מספר פעמים15. בנוסף, מכיוון ששסתומים כאלה יכולים להיות מופעלים על ידי הפעלת לחץ, הם פותחים אפיקים לבקרה דיגיטלית ואוטומציה16. יתר על כן, מכיוון שהם מאותו חומר, ניתן לשלב אותם בצורה חלקה בייצור התקנים מבוססי PDMS באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכה 8,17,18. תכונות אלה הופכות את שסתומי PDMS לבחירה אטרקטיבית לוויסות זרימה בהתקנים מיקרופלואידים. תורסן ועמיתיו השתמשו בעיקרון של שסתומים כאלה כדי לתכנן מרבב זורם – מערך קומבינטורי של שסתומים פנאומטיים – כדי לטפל בכמעט אלף ערוצי זרימת קלט עם עשרים ערוצי בקרה19. עיקרון זה הורחב לניתוב סלקטיבי של נוזלים לכימוסטטים מיקרופלואידים בתוך שבב, כך שניתן לבצע תגובות ייחודיות בו זמנית בכל כור 20,21,22,23. עם זאת, מיקרו-ריאקטורים כאלה, בעוד שהם שימושיים באופטימיזציה של השימוש בריאגנטים מוגבלים, אינם יכולים להקביל תגובות מרובות ואינם מספיקים למחקרים בעלי תפוקה גבוהה.

מיקרופלואידיקה טיפתית היא תת-קטגוריה של מיקרופלואידיקה הכוללת ייצור טיפות באמצעות מניפולציה של זרימת נוזל רב-פאזית בלתי ניתנת לערבוב בהתקנים מיקרופלואידים24. היווצרות טיפות כרוכה בפירוק של נוזל רציף על ידי הכנסת נוזל בלתי ניתן להפרעה, וכתוצאה מכך צביטה עקב חוסר יציבות באנרגיה הבין-פנים ובהיווצרות תחליב25. חומרים פעילי שטח מסייעים ביצירת טיפות מעוגלות כאשר תחליבים עוזבים את המיקרו-ערוץ על ידי ייצוב האנרגיות הבין-פנים26. טיפות גדולות יותר, הנקראות תקעים, הן פחות יציבות וניתן לאסוף אותן בתא אחיזה (כגון אורך צינורות) כמערך של תאים מימיים המרווחים מכל צד על ידי נוזל אחד או יותר בלתי ניתנים לערבוב27. בנוסף למזעור ומידור, מיקרופלואידיקה טיפתית מציעה גם תפוקה מוגברת של תגובות ביולוגיות, שכן ניתן לייצר מספר רב של טיפות חד-פיזור – שכל אחת מהן משמשת כננו-ריאקטור28. טיפות, לאחר שנוצרו, יכולות גם להיות נתונות למניפולציות נוספות, כגון פיצול29,30, היתוך31,32, מיון33,34 והרכבה למבנים מסדר גבוה יותר35,36. מיקרופלואידיקה טיפתית חוללה מהפכה במספר תחומים וטכנולוגיות מדעיות – מ-PCR37 לשעתוק חד-תאי38, מגילוי תרופות39,40 לווירולוגיה41, מריצוף הדור הבא42 לסינתזה כימית43.

שילוב של ליתוגרפיה רכה מבוססת PDMS ומיקרו-שסתומים עם טכנולוגיית טיפות הוא שילוב רב עוצמה המאפשר ויסות זרימת נוזלים במיקרו-ערוצים ולאחר מכן שליטה על תכולת הטיפות. בהתאם לפתיחה וסגירה של תעלות, ניתן לייצר אוכלוסיות נפרדות של טיפות, כל אחת עם הרכב מסוים. פלטפורמה כזו יכולה למזער, למדר ולהקביל תגובות ביוכימיות ולכן להיות טכניקה שימושית לסינון קומבינטורי44. סינון קומבינטורי היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה ליצירת עשרות אלפי שילובים של ריאגנטים נבחרים ליצירת ספריות המורכבות מאוכלוסיות בודדות של הרכב ידוע. בדיקות סקר קומבינטוריות שימשו לגילוי השפעות סינרגטיות בין תרופות ואנטיביוטיקה לעיכוב גדילה חיידקי45. בתחום הטיפול בסרטן נעשה שימוש בבדיקות סקר קומבינטוריות לבדיקת שילובים של תרופות אנטי סרטניות לחולה נתון ובכך לקדם טיפול מותאם אישית46,47. Mathur ואחרים בנו על טכנולוגיה זו על ידי שילוב גישת ברקוד DNA קומבינטורית להערכת שינויי שעתוק בבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה48. לפיכך, סינון קומבינטורי הוא טכנולוגיה רבת עוצמה אך מתהווה, ויש צורך בפיתוח טכנולוגיות מיקרופלואידיות מגוונות כדי לבצע ולהקל על הליכי סינון כאלה.

מטרתו של כתב יד זה היא להציג מערכת שלמה של פרוטוקולים לייצור התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי המסוגל ליצור ספרייה קומבינטורית של תקעי מים בשמן ולתאר את החומרה והתוכנה הדרושות להפעלת מכשיר כזה. זרימת הנוזל מווסתת באמצעות שסתומים פניאומטיים מבוססי PDMS מבוקרי לחץ, אשר בתורם נשלטים על ידי תוכנית LabVIEW מותאמת אישית. זרימת ריאגנטים במכשיר מושגת באמצעות משאבות לחץ זמינות מסחרית. מוצג אב טיפוס בעל שמונה כניסות שבו נוצר תקע על ידי תכולתם של שלושה כניסות, שכל אחת מהן מכילה מגיב מימי. הפאזה המימית פוגשת פאזת שמן רציפה, ותקעים מיוצרים בצומת T בתדר של 0.33 הרץ. תפקוד המערכת מודגם על ידי הפקת ספרייה כמותית המכילה שלוש אוכלוסיות שונות של תקעים פלואורסצנטיים. טכנולוגיה זו ומערכת פרוטוקולים תסייע לזרז את הייצור של ספריות קומבינטוריות למטרות סינון בתפוקה גבוהה.

Protocol

1. ליתוגרפיה רכה הערה: המכשיר המיקרופלואידי מורכב משתי שכבות, שכבת זרימה ושכבת בקרה (איור 1A), וכל שכבה מעוצבת מפרוסות בדוגמה נפרדת באמצעות photoresist חיובי ושלילי בהתאמה (עיין בטבלת החומרים לפרטים על photoresist ומפתחים). בצע ייצור רקיק עבור שכבת הזרימה כמתואר להלן.יש לייבש פרוסת סיליקון (בקוטר 100 מ”מ, בכיוון , 525) למשך לילה (12-16 שעות) בטמפרטורה של 250°C. הניחו לרקיק להתקרר לפני שהמשיכו לציפוי מסתובב. החל 3-4 מ”ל של photoresist חיובי על מרכז רקיק. סחרור במשך 40 שניות ב-1,400 סל”ד (344 סל”ד לשנייה) לקבלת גובה תכונה של 45 מיקרומטר. אופים רך על פלטה חמה באמצעות רמפת טמפרטורה, להגדיל בקצב של 450 ° C / h, מ 35 °C ל 105 °C (75 °F). שלב זה יכול להתבצע גם על רקמות מיקרופייבר כדי למנוע מגע ישיר ולמזער את בעבוע של photoresist. הסר את רקיק מן hotplate ולאפשר לו להתקרר על רקמות microfiber. הניחו את מסיכת הפוטו (המיוצרת באופן מסחרי) המתאימה לשכבת הזרימה (צד תחליב כלפי מטה) על פרוסת סיליקון מצופה התנגדות וחשפו אותה תחת מנורת UV, בהספק של 10 mW/cm2, עד לקבלת חשיפה כוללת של 200 mJ/cm2 . השתמשו בשתי פלטות חמות – אחת ב-65 מעלות צלזיוס והשנייה ב-95 מעלות צלזיוס – כדי לאפות לאחר החשיפה – במשך דקה ו-7 דקות בהתאמה – על הצלחות. לפתח את רקיק על ידי העברתו צלחת פטרי מלא מפתח עבור photoresist חיובי. להסעיר את צלחת פטרי על ידי ניעור אותו על שייקר ספסל עם רקיק שקוע לחלוטין לרענן את פתרון המפתח מעת לעת עד רקיק מפותח לחלוטין, ואת התכונות ניתן לראות בבירור. השתמשו במים נטולי מינרלים כדי לשטוף שאריות התנגדות מהפרוסה ובדקו תחת מיקרוסקופ סטריאו אם יש שאריות בתוך התעלות. הסר שאריות על ידי החזרת רקיק לפתרון המפתח או בזהירות להוסיף את המפתח רקיק עם micropipette. לאחר השלמתו, יבשו את הפרוסת באמצעות אקדח ריסוס חנקן. הזרימו מחדש את רקיק הוופל על ידי הנחתו על פלטה חמה לטמפרטורה של 110°C למשך 25 דקות. תהליך זה יוצר תכונות מעוגלות. המשך לסילניזציה של רקיק כמפורט בשלב 1.3.הערה: ניתן לבצע שקיעת אדי Hexamethyldisilazane (HMDS) גם על פרוסות הסיליקון לפני יישום ההתנגדות כדי לשפר את ההיצמדות בין ההתנגדות לרקיק. בצע ייצור רקיק עבור שכבת הבקרה כמתואר להלן.קחו פרוסת סיליקון נוספת והתייבשו על ידי הנחתה על פלטה חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 15 דקות. מוציאים את הוופל ומניחים לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שממשיכים עם ציפוי סיבוב. החל 5 מ”ל של photoresist שלילי על מרכז רקיק. השתמש בפרוטוקול הסחיטה הבא כדי לקבל גובה תכונה של 40 מיקרומטר: 5 שניות ב-500 סל”ד (תאוצה של 100 סל”ד לשנייה), 33 שניות ב-1,400 סל”ד (300 סל”ד לשנייה), ולבסוף האט ל-0 סל”ד למשך 5 שניות ב-300 סל”ד לשנייה. אופים רך בשתי פלטות נפרדות לטמפרטורה של 65°C ו-95°C למשך דקה ו-15 דקות בהתאמה. הסר את רקיק מן hotplate ולאפשר לו להתקרר על רקמות microfiber. הניחו את מסיכת הפוטו (המיוצרת באופן מסחרי) המתאימה לשכבת הבקרה (צד האמולסיה כלפי מטה) על רקיק מצופה התנגדות וחשפו את הפרוסת מתחת למנורת UV, המוגדרת על 15 mW/cm2, עד לחשיפה כוללת של 250 mJ/cm2 . השתמשו בשתי פלטות חמות – אחת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס והשנייה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס – ובצעו אפייה לאחר החשיפה של הוופל במשך 2 דקות ולאחר מכן 5 דקות בהתאמה. הסר את רקיק מן hotplate ולאפשר לו להתקרר על רקמות microfiber. לפתח את רקיק על ידי העברתו צלחת פטרי מלא מפתח עבור photoresist שלילי במשך 4 דקות. רענן את המפתח והמשך את התהליך למשך 4 דקות נוספות. שטפו את הפרוסות עם איזופרופנול כדי להסיר שאריות photoresist והשתמשו במיקרוסקופ סטריאו כדי לבדוק אם יש שאריות בתוך התעלות. הסר שאריות על ידי החזרת רקיק לפתרון המפתח או בזהירות להוסיף את המפתח רקיק עם micropipette. לאחר השלמתו, יבשו את הפרוסת באמצעות אקדח ריסוס חנקן. לאחר הפיתוח המלא, אפו היטב את ה-photoresist על ידי הנחת רקיק על פלטה חמה בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות. המשך לסילניזציה כמפורט בשלב 1.3. לבצע סילניזציה כמתואר להלן.מניחים את רקיק לתוך מייבש. הכניסו בקבוק זכוכית למייבש והוסיפו 4-5 טיפות של 1,1,3,3 טטרמתילדיסילוקסן.זהירות: 1,1,3,3 טטרמתילדיסילוקסאן אינו רעיל אך דליק. ניתן להשתמש בסילנים אחרים, אך הם עלולים להיות רעילים. מומלץ לבצע סילניזציה במכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי (PPE) הכרחי כגון מעיל מעבדה, משקפיים וכפפות ניטריל. משכו את השואב למשך 15 דקות ואטמו את מייבש האבק למשך 12-16 שעות כדי לאפשר לסילאן לשקוע על הפרוסה. פתחו את מייבש הכביסה והשליכו את בקבוק הזכוכית. מניחים את הוופל בצלחת פטרי נקייה. בצע ייצור התקנים מיקרופלואידים כמתואר להלן.הערה: הפרוטוקול הבא הותאם מעבודות קודמות23.הכינו שני פתרונות PDMS נפרדים – אחד לשכבת הזרימה ואחד לשכבת הבקרה. עבור כל תמיסה, ערבבו את סוכן הבסיס ואת חומר הריפוי של ערכת PDMS בכד וערבבו באמצעות מוט ערבוב. שכבת הבקרה דורשת 10 גרם של סוכן בסיס ו 0.5 גרם של סוכן ריפוי (יחס של 20: 1) בעוד שכבת הזרימה דורשת 40 גרם של סוכן הבסיס ו 8 גרם של סוכן הריפוי (יחס 5: 1). נטרלו את תמיסות ה-PDMS במייבש עד שהתמיסות יהיו נטולות גזים. מניחים את פרוסת שכבת הזרימה הסילנית בכלי פטרי מכוסה בנייר כסף ויוצקים את תמיסת PDMS המתאימה על הפרוסה. מחזירים את צלחת הפטרי למייבש ומושכים את השואב לפירוק נוסף (למשך כ-20 דקות). יש לצפות את פרוסת שכבת הבקרה הסילנית בתמיסת PDMS המתאימה. יוצקים 3-4 מ”ל של התמיסה על מרכז הפרוסות ומסתובבים במשך 20 שניות ב-1500 סל”ד ב-408 סל”ד לשנייה. מניחים את הוופל על משטח ישר בצלחת פטרי סגורה למשך 20 דקות. מכניסים את שכבות הזרימה והבקרה לתנור ב-80°C למשך 18-20 דקות. מעת לעת לפקח על שתי השכבות כדי לבדוק אם הם נרפאו. השכבות מוכנות כאשר הן קשיחות מספיק כדי להיות גמישות אך מעט דביקות, מכיוון שזה משפר את הקשר בין שתי השכבות. גזור את PDMS סביב כל אחד מהמכשירים על פרוסת שכבת הזרימה עם אזמל. הקפד לא לחתוך קרוב מדי לתכונות ולהשאיר רווח של כ -2 ס”מ בין התכונה לבין הקצוות של PDMS. לאחר ניתוק פרוסת הסיליקון, כסו את בלוק PDMS בסרט בצד התכונה כדי למנוע זיהום אבק. לאחר שכל גושי PDMS נחתכו, הניחו אותם בזה אחר זה על פרוסת שכבת הבקרה המתאימה ובצעו יישור גס בעין. לאחר שכל הבלוקים הונחו על האזורים המתאימים שלהם בשכבת הבקרה, התאם את המיקום של כל אחד מהבלוקים כך ששסתומי הבקרה יחפפו מעל ערוצי הזרימה המתאימים כדי להשלים את היישור. זה יכול להתבצע גם בעזרת מיקרוסקופ סטריאו. הסר כיסי אוויר בין שתי השכבות על ידי הפעלת לחץ. אם כיס האוויר מופעל או בקרבתו, יש להקפיד לא למוטט את הערוצים בעת הפעלת לחץ. מכניסים את המכשירים לתנור ב-80 מעלות צלזיוס ומשאירים אותם להתחבר למשך 12-16 שעות. הניחו 100 גרם משקולות על כל אחד מהמכשירים כדי לשפר את הקשר בין שתי השכבות. הוציאו את הפרוסות וחתכו כל מכשיר בנפרד. קלף את המכשירים מפרוסת שכבת הבקרה וכסה את צד התכונה בסרט הדבקה. הניחו כל מכשיר בנפרד על משטח חיתוך כאשר צד התכונה פונה כלפי מעלה ונקבו חור עבור כל אחד משמונת פתחי שכבת הזרימה, שמונה פתחי תעלת שכבת הבקרה, פתחי השמן והשקע באמצעות ניקוב ביופסיה בקוטר 0.75 מ”מ כאשר צד התכונה פונה כלפי מעלה. טען את אשר הפלזמה עם שקופית מיקרוסקופ ומכשיר יחיד עם הקלטת הוסרה וצד התכונה פונה כלפי מעלה. בצע את אפר פלזמה חמצן עם כוח של 30 W למשך 20 שניות. הוציאו את המכשיר ואת הזכוכית החוצה ברגע שהאפר הושלם והניחו את המכשיר עם הצד של התכונה כלפי מטה על המגלשה. ההיצמדות בין PDMS לזכוכית צריכה להיות גלויה מיד לעין בלתי. הפעילו לחץ על אזורים עם כיסי אוויר כדי לסחוט את האוויר החוצה. הניחו את המכשירים על פלטה חמה המוגדרת לטמפרטורה של 110°C למשך 60 דקות עם משקולת מלמעלה כדי לשפר את החיבור של PDMS לזכוכית. 2. הגדרת חומרה הערה: סכמה של החיבורים להתקן המיקרופלואידי מוצגת באיור 1B , ומימוש של סכימה כזו באמצעות החומרה הדרושה מוצג באיור 2. הגדר את השסתומים הפנאומטיים כמתואר להלן.הערה: כל ערוץ בקרה, המווסת שסתום PDMS על השבב נשלט בתורו על ידי שסתום סולנואיד יחיד. אב הטיפוס המוצג כאן מורכב משמונה ערוצי בקרה (איור 1A), ולכן נדרשים שמונה שסתומי סולנואידים.שסתומי הסולנואיד נשלטים באמצעות תוכנת LabVIEW מותאמת אישית (תוכנית ממשק ראשית; איור 3 ותיק משלים 1, קובץ משלים 2, קובץ משלים 3, קובץ משלים 4). תוכנית זו שולחת פקודות MODBUS באמצעות חיבור TCP (קובץ משלים 5, קובץ משלים 6), לבקר WAGO. חבר את התקן WAGO למחשב באמצעות התוכנית LabVIEW באמצעות כבל Ethernet. המשך לחבר את שסתומי הסולנואיד ברצף ליציאות בבקר WAGO. לקבלת תיאור מפורט יותר, עיין בפרוטוקולים23 שתוארו קודם לכן. חבר את מערך שסתומי הסולנואיד למקור אוויר דחוס באמצעות 1/4 בצנרת והגדר את הלחץ של מערך השסתומים ל -3.5 בר. במערכת זו נעשה שימוש בשמונת השסתומים המסומנים 9-16. הגדר וסתי לחץ כמתואר להלן.הערה: משאבת לחץ מסחרית זמינה כדי לשלוט בזרימת הנוזלים (איור 2). מערכת משאבות בעלת שמונה יציאות וארבע יציאות שימשו כדי להכיל שמונה פתחי מים ושני פתחי שמן במכשיר. הלחץ של כל יציאה מווסת באמצעות תוכנה המסופקת על ידי היצרנים.חבר את משאבת הלחץ למקור אוויר דחוס וודא שהלחץ המסופק אינו עולה על הלחץ המרבי המותר על ידי המשאבה (2.2 בר הן עבור בקר שמונה יציאות והן עבור בקר ארבע יציאות). חבר את משאבות הלחץ למחשב באמצעות מחבר USB. לאחר הפעלת המשאבות, הן אמורות להיות גלויות בתוכנה המתאימה. הגדר את הלחצים לאפס בעת הגדרת המשאבות. חבר Luer זכר למחבר barb 3/32 לכל אחת מ-12 יציאות המוצא של נעילת luer נקבה בבקרים. חבר חתיכת צינורות רכים (OD: 3 מ”מ, ID: 1 מ”מ, L: 15 ס”מ) למשקוף. חבר פיתוי זכר נוסף למחבר 3/32 בבארב לקצה השני של הצינור הרך. חבר סתום luer (23 G, 0.5 אינץ’) למחבר barb. בשלב זה, וסת הלחץ מוגדר ומוכן לשימוש. 3. הגדרת התקן מיקרופלואידי חבר את צינורות ערוץ הבקרה כמתואר להלן (איור 2).עבור כל תעלת בקרה, חתך אורך של צינורות PolyTetraFluoroEthylene (PTFE) (OD: 0.042 אינץ ‘, ID: 0.022 אינץ ‘). הכנס את הסיכה של 23 G, 0.5 ב luer stub בקצה אחד. חבר את סתום הפיתוי ללואר זכר למחבר ניילון דוקרני 3/32. הכנס את מוט המחבר לאורך צינורות פוליאוריתן (OD: 4 מ”מ, ID: 2.5 מ”מ). חבר את הקצה השני של צינור הפוליאוריתן ישירות לשסתום סולנואידים. ממלאים מזרק במים ומחברים 23 גרם, 0.5 בקצהו. חבר את הקצה החופשי של צינור ה- PTFE למזרק זה והזריק מים עד בערך באמצע הצינור. נתקו את הצינור מהמזרק והכניסו את הקצה החופשי של הצינור לחור מנוקב של תעלת הבקרה המתאימה (איור 1A-C1-8). חזור על הפעולה עד שכל ערוץ בקרה מחובר לשסתום הסולנואיד המתאים לו.הערה: במאמר זה, שסתומי הסולנואיד 9-16 היו מחוברים לתעלות הבקרה המתאימות ל- C1 עד C8, בהתאמה. בעוד אלה יכולים להיות מחוברים בכל דרך שהיא, חשוב לזכור את הסדר ואת רצף החיבורים, במיוחד בעת הפעלת תוכנית ממשק ראשי. השתמשו בתוכנית הממשק הראשי (איור 3) כדי לפתוח את כל שסתומי הסולנואידים (לחץ על כל ערוצי הבקרה). זה ידחוף את הנוזל מהצינור לתוך תעלות הבקרה של המכשיר microfluidic ובכך למלא אותו. דוגמה לשסתומים בלחץ ודיכאון מוצגת באיור 4. חבר ריאגנטים והפעל את המכשיר כמתואר להלן.ודא שכל ערוצי הבקרה מופעלים בלחץ על-ידי לחיצה על הלחצן לחץ על כל ערוצי הבקרה בתוכנית הממשק הראשי (איור 3). עבור כל אחד מהריאגנטים המימיים, חתכו קטע של צינורות PTFE (OD: 0.042 אינץ’, ID: 0.022 אינץ’) ארוך מספיק כדי לחבר את המשאבות לפתחי פתחי ההתקן המיקרופלואידים. חבר את אחד הצינוריות לספח הפיתוי משלב 2.2.6. ממלאים מזרק בריאגנט הנדרש ומחברים 23 גרם, 0.5 ב luer stub בסוף. הזריקו את המגיב לתוך צינור ה-PTFE המתאים עד שהצינורית מלאה. ודא שהמגיב אינו נכנס ליציאת הפלט בערכת המשאבה. הכנס את הקצה החופשי של הצינור לכניסה מתאימה בשבב המיקרופלואיד. החל לחץ של 400 mbar על כל ריאגנטים מימיים הכניסה באמצעות התוכנה שסופקה. לחץ ברצף על ערוצי הבקרה בנפרד באמצעות תוכנית הממשק הראשי (איור 3) כדי לוודא שכל הריאגנטים הגיעו לצומת T של המכשיר. הפעל שסתומים בודדים , במידת הצורך, על ידי לחיצה על הלחצנים המתאימים בתוכנית בתיבה ערוצי בקרה לחץ ידני. חזור על שלבים 3.2.3 עד 3.2.5 עבור ריאגנטים שמן. החל לחץ של 400 mbar על כל ריאגנטים שמן כניסה. הורידו בו-זמנית את כל ערוצי הבקרה על-ידי לחיצה על Depressurize All Control Channels (איור 3) עד שכל האוויר יוסר מהמכשיר. זה נצפה על ידי עין בלתי או תחת מיקרוסקופ. לחצו על כל ערוצי הבקרה על-ידי לחיצה על הלחצן ‘לחץ על כל ערוצי הבקרה’ (איור 3). בשלב זה, כל הריאגנטים חוברו והמכשיר מוכן לשימוש. תכנת ובצע את הניסוי כמתואר להלן.קידוד ההרכב, הרצף וההעתקים של כל אוכלוסיית תקע שתיווצר בקובץ .csv כפי שמוצג בקובץ משלים 7 המשמש כקלט עבור הניסוי האוטומטי בתוכנית הממשק הראשי (איור 3). סמן את ערוצי הבקרה הדרושים עם 0 אם המתאים לכניסה צריך להיות פתוח ו- 1 אם הוא צריך להיות סגור. כל שורה בקובץ .csv מתאימה לאוכלוסיית תקע נפרדת אחת. טען את .csv לתוכנית הממשק הראשי על ידי לחיצה על תיקייה כפתור בכרטיסייה קובץ ניסוי . הזן את השדות הרלוונטיים בתוכנית כגון איטרציות של ניסוי (כדי לקבוע כמה פעמים רצף נתון של תקעים מיוצרים), זמן של depressurization (כדי לקבוע כמה זמן ערוצי הכניסה צריכים להיות פתוחים ואת ערוץ הבקרה המתאים צריך להיות depressurized באלפיות השנייה), זמן של לחץ (כדי לקבוע כמה זמן הכניסות צריך להיות סגור בין רצפים של אוכלוסיית תקע באלפיות השנייה). בחר את ערוצי הכניסה המתאימים להפקת ברקוד במקטע כניסות ברקוד (עד 3 ערוצים) יחד עם משך הזמן שבו הם צריכים להיות פתוחים (זמן לברקוד (ms)). לחלופין, ניתן גם לקודד ברקודים אלה לקובץ הקלט .csv כפי שמוצג בקובץ משלים 7. להפחית את הלחץ של ריאגנטים שמן הכניסה ל 200 mbar. חבר צינורות PTFE (OD: 0.042 אינץ ‘, ID: 0.022 אינץ ‘) באורך הרצוי בשקע כדי לאסוף את התקעים. על מנת להבטיח ייצור תקע אחיד, יש להשתמש בצינורות של כ-100 ס”מ ממולאים מראש בתקעים לאיסוף. זאת על מנת לנטרל את הפרש הלחץ בשקע המופעל על ידי אוסף התקעים בצינורות. לחץ על הפעל ניסוי כדי להפעיל את התוכנית ואת ייצור התקעים. בצע רישום וניתוח נתונים כמתואר להלן (ראה איור 5).הערה: סעיף זה מתאר באופן ספציפי שיטה לניתוח תקעים פלואורסצנטיים. בהתאם לאופי התקעים שנוצרו, ניתן לשנות סעיף זה כנדרש.ממלאים מזרק בשמן (שמן מינרלי או שמן מופלר) ומחברים 23 גרם 0.5 בקצהו. הדקו את המזרק למשאבה. חברו את אחד מקצות צינור האיסוף הממולא לגבעולי הפיתוי שעל המזרק. הצמידו את הקצה השני של צינור האוסף המלא מעל עדשת המטרה של מיקרוסקופ. הניחו מאגר פסולת מתחת לקצה הצינור בסמוך למטרה. מקדו את המיקרוסקופ באזור נתון של הצינורית והגדירו אותו לרשום פלואורסצנטיות בתעלות הרצויות. כוונו את המשאבה לקצב זרימה של 50 מיקרוליטר/דקה. הקלט את הווידאו של ערוץ הפלואורסצנט כקובץ .avi. נתח את קובץ .avi באמצעות סקריפט Python שסופק (קובץ משלים 8) כדי לחלץ את הפלואורסצנטיות הממוצעת באזור עניין מוגדר מראש (ROI) לכל מסגרת של קובץ .avi (דוגמה לכך ניתנת בקובץ משלים 9). השתמש בסקריפט R המותאם אישית שסופק (קובץ משלים 10) כדי לחלץ את התנאים ולהתוות את הנתונים הגולמיים ואת גבהי השיא.הערה: סקריפט R בקובץ משלים 10 שימש לניתוח במאמר זה. פונקציות R בהתאמה אישית המשמשות בסקריפט זה לחיתוך נתונים, זיהוי תנאים באמצעות ברקודים וניתוח גבהי השיא עבור תקעים והתווייות בודדים מסופקות בקובץ משלים 11.

Representative Results

אחד המאפיינים המכריעים של השבב המיקרופלואידי הם שסתומי PDMS ויכולתם לווסת את זרימת הנוזלים התאפיינה בכך שהיא משפיעה על הפרדיגמה התפעולית של המכשיר. לשם כך, קצב הזרימה של מים מזוקקים (שנמדד באמצעות חיישן קצב זרימה מסחרי) דרך תעלות הכניסה נרשם כפונקציה של לחצי כניסה שונים תוך הפעלת לחץ תקופתי (3.5 בר עבור 2000 מילישניות) והפחתת לחץ (1000 מילישניות) על שסתומי PDMS (איור 6A). נצפה כי השסתומים היו מסוגלים לווסת את זרימת הנוזל עד כ 800 mbar של לחץ קלט, כפי שצוין על ידי הירידה בקצב הזרימה לאפס כאשר השסתומים מופעלים (איור 6 B-D). זה מאמת את השימוש בשסתומים מבוססי PDMS כאלה כדי לווסת את זרימת הריאגנטים בתוך הערוצים. יתר על כן, ב- 1200 mbar, לחץ הכניסה גבוה מכדי שהשסתומים יוכלו לווסת את הזרימה, כפי שניתן לראות בכך שקצב הזרימה אינו יורד לאפס (איור 6E). בעוד שניתן לשנות את משך הלחץ והדיכאון של שסתומי PDMS, חושב קצב השינוי של זרימת הנוזלים בתנאים הנוכחיים של לחץ (2000 מילישניות) ודיכוי (1000 מילישניות). עבור לחץ כניסה של 400 mbar, ניתן להפעיל ולכבות את הזרימה בקצב של 1.26 הרץ ו-1.44 הרץ בהתאמה (איור 6C). איטרציות קודמות של התקן מיקרופלואידי קומבינטורי דומה בעל תפוקה גבוהה שילבו גם תעלת פסולת המוצמדת לכל ערוץ זרימה46,47. מכשירים אלה הופעלו במשטר קצב זרימה קבוע (שבו ריאגנטים הוזרקו למכשיר בקצב זרימה קבוע ולא בלחץ קבוע), ותעלות הפסולת תוכנתו להיפתח כאשר תעלות הכניסה המתאימות להן נסגרו כדי להקל על הצטברות לחץ. תעלות כאלה, למרות שהן שימושיות, גורמות לאובדן ריאגנטים מכיוון שתכולת תעלת הפסולת אינה תורמת להיווצרות תקעים. כמו כן, נדרשות גם תעלות בקרה נוספות – ובכך משאבות נוספות – כדי לווסת את פתיחתן וסגירתן של תעלות הפסולת. באב הטיפוס המוצג כאן הוסרו תעלות הפסולת, ונקבעה פרדיגמה מבצעית המאפשרת צמצום בזבוז ריאגנטים וצמצום המורכבות התכנונית והתפעולית. זה כרוך בהזרקת ריאגנטים מימיים במצב לחץ קבוע בניגוד למצב קצב זרימה קבוע. כדי להבין טוב יותר את שני המשטרים, הוערך הקשר בין הלחץ לקצב הזרימה בתעלות במהלך הפעלת השסתומים בכל אחד מהמקרים (באמצעות אותו מערך כפי שמוצג באיור 6A), שתוצאותיו מוצגות באיור 7. באיור 7A נמדד קצב הזרימה של מים מזוקקים בעת הזרקה בלחץ קבוע (300 mbar) ונצפה כי במהלך הפעלת השסתום, קצב הזרימה יורד לאפס ועם הלחץ על השסתום קצב הזרימה חוזר לרמות שלפני ההפעלה. עם זאת, במשטר קצב זרימה קבוע, שבו הלחץ בתעלות נרשם תוך הזרקת המים המזוקקים בקצב זרימה קבוע (2.5 מיקרוליטר/דקה; איור 7B), הפעלת השסתומים לא הביאה לסגירה מוחלטת של הכניסה – עדות לכך היא שקצב הזרימה לא ירד לאפס – ונצפתה הצטברות של לחץ בתעלה. זהו הלחץ שמשתחרר על ידי פתיחת תעלות פסולת. מכיוון שמשטר לחץ קלט קבוע מאפשר את הפעלת המכשיר ללא לחץ אחורי בעת הפעלת השסתום, ובכך שולל את הצורך בתעלות פסולת, אומץ משטר זה להפעלת השבב המיקרופלואידי. כדי להדגים את הפונקציונליות של המכשיר המיקרופלואידי, נוצרה ספרייה קומבינטורית כמותית של תקעים פלואורסצנטיים. לשמונה הכניסות של המכשיר, שלושה ריאגנטים מימיים – פלואורסצאין (50 מיקרומטר) בארבעה פתחים (I1אני3, אני5, אני7), מים מזוקקים בשלושה פתחים (I4אני6, אני8), פתח אחד עם צבע כחול (I2; לשמש כברקוד) – ושני ריאגנטים של שמן – שמן מופלר (FC-40) ושמן מינרלי (MO) בכניסות O1 ו-O2בהתאמה – היו מחוברים לחשמל (איור 1A, איור 8A). השמן המופלר משמש כשלב המוביל בו מתפזרים התקעים המימיים, והשמן המינרלי מסייע ליציבות התקע וממזער הידבקות של תכולת התקע לדפנות, ובכך ממזער זיהום צולב בין תקעים46. עם שלושה פתחים התורמים להרכב אוכלוסיית תקע יחידה, תצורה זו יכולה ליצור שלוש אוכלוסיות פלואורסצנטיות נפרדות: FFF – המורכב מפלואורסצאין משלושה ערוצים, FFW – המורכב מפלואורסצאין משני ערוצים, ומים מערוץ אחד, ו- FWW – המורכב מפלואורסצאין מתעלה אחת ומים משני ערוצים. עם התקנה זו, ישנם 12 תנאים נפרדים (אוכלוסיות תקעים המיוצרים עם שילוב מובהק של שלושה כניסות) שיכולים לייצר תקעי FWW, 18 תנאים נפרדים שיכולים לייצר תקעי FFW, וארבעה תנאים נפרדים שיכולים לייצר תקעי FFF. לכן, השבב תוכנת לייצר את 34 התנאים השונים הללו עם חמישה תקעי שכפול שונים כל אחד, יחד עם חמישה העתקים של תקעי ברקוד המפרידים ביניהם. מומלץ לשלב את אוכלוסיות התקעים הפלואורסצנטיים באוכלוסיית ברקוד, כלומר קבוצה של תקעים צבעוניים (רצוי שאינם פלואורסצנטיים) (במקרה זה נוצרים על ידי פתיחת תעלות הכניסה המתאימות לצבע הכחול ושתי תעלות מים מזוקקות) הנראות לעין בלתי. זה מאפשר למשתמש לפקח על ייצור התקע עבור בעיות כגון פירוק תקע או היתוך ומסייע בניתוח במורד הזרם של תקעים. לכן, סך של 340 תקעים – 170 תקעים ניסיוניים ו -170 תקעי ברקוד המפרידים בין התנאים השונים – נוצרו ונאספו בצינורות PTFE, שמדגם מהם מוצג ב איור 8B. זמן הדיכאון וזמן הלחץ נקבעו על 1000 מילישניות ו -2000 מילישניות, בהתאמה. נותחו הפלואורסצנטיות של התקעים והשתנותם בתוך ועל פני תנאי הניסוי השונים, שתוצאותיהם מוצגות ב איור 8ג,ד. איור 8ג מציג את הפלואורסצנטיות לכל מסגרת של קובץ .avi שנוצר בשלב 3.4.6, המדגיש את 34 תנאי הניסוי הנדונים בחשבון (מסומן בקו כחול). הערך הפלואורסצנטי הממוצע של פסגות בתנאי מוצג באדום, והקווים המקווקווים מציינים את שגיאת התקן בתוך תנאי זה. גבהי הפסגות של כל התקעים בכל אוכלוסייה, המתקבלים על ידי הפחתת הפלואורסצנטיות הבסיסית מהפלואורסצנטיות המרבית שהתגלתה בכל פסגה, שורטטו ב איור 8D. השיא האחרון בכל מצב הוזנח לצורך החישובים מכיוון שהיה תקע מזוהם עקב ערבוב ריאגנטים בצומת T (מכיוון שהפלואורסצנטיות של התקעים נרשמה בסדר הפוך של ייצור תקעים, התקע הראשון באוכלוסייה במהלך הייצור הוא התקע האחרון באוכלוסייה במהלך הניתוח). ניכר כי גובה תקעי ה- FWW הוא כשליש (ממוצע = 40.9, סטיית תקן = 3.1) וזה של תקעי ה- FFW הוא כשני שלישים (ממוצע = 78.4, סטיית תקן = 5) מגובה תקעי ה- FFF (ממוצע = 117, סטיית תקן = 10). תוצאות אלה תואמות את הפרופורציות הצפויות של פלואורסצנטיות באוכלוסיות שונות של תקעי FFF/FFW/FWW, מה שמדגיש את עמידות המכשיר ותפקודו. איור 1: סכמה של תכנון ההתקן וההגדרה המיקרופלואידית. (A) שכבת הזרימה של השבב מוצגת בכחול ושכבת הבקרה מוצגת באדום. בסך הכל שמונה ריאגנטים מימיים ייחודיים יכולים לזרום דרך הפתחים (I1-8) לכיוון צומת T, שם הם פוגשים את פאזות השמן מפתחי הנפט (O1-2) ליצירת תקעים הנאספים בשקע. כל ערוץ זרימת כניסה נמצא תחת שליטה של ערוץ בקרה ייחודי (C1-8). (B) סכימה של השבב המיקרופלואידי יחד עם חיבורי הצינור לכניסות, לתעלות הבקרה ולריאגנטים של השמן מוצגת יחד עם צינורות היציאה. חצים מציינים את כיוון זרימת הנוזל בצינורית. הכניסה מציגה את עקרון העבודה של שסתומי PDMS. קווים מקווקווים מציינים ששכבת הבקרה נמצאת מתחת לשכבת הזרימה. נתון זה שונה מ Dubuc et al49. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: סכמה של הגדרת החומרה לייצור תקעים. משאבות הלחץ שולטות בזרימת ריאגנטים (הן מימיים והן שמן) בתעלות הכניסה, ושסתומי הסולנואיד שולטים בהפעלת שסתומי PDMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: תוכנית הממשק הראשית לשליטה במכשיר המיקרופלואידי. תוכנית מותאמת אישית זו מאפשרת לחץ ידני של שסתומים פניאומטיים בודדים (לוח לבן). הוא גם מאפשר ביצוע ניסוי שלם (לוח כחול) שבו הוא מקבל קובץ .csv עם אוכלוסיות התקע הרצויות ופרמטרים נחוצים כגון לחץ שסתומים וזמני דיכוי ומציג את מצב ביצוע הניסוי, כולל אילו ערוצי בקרה מופעלים לחץ ולא, בזמן אמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: הפעלת שסתום מונחה לחץ. תמונות מיקרוסקופ שדה בהיר של (A) שסתום PDMS (אופקי) מדוכא וערוץ הכניסה (אנכי) פתוח ו-(B) שסתום PDMS בלחץ וסוגר את תעלת הכניסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: סכמה של הגדרת רישום הנתונים. צינורות האיסוף מחוברים למזרק עם שמן, המודבק למשאבה. התקעים מוטסים דרך צינורות האיסוף, ותמונות/סרטונים מצולמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: השפעת הפעלת השסתום על קצב הזרימה בלחץ כניסה נתון. (A) סכמה של מערך החומרה המשמש לניטור קצב הזרימה בתעלות המיקרופלואידיות. תגובת קצב הזרימה בערוצים כאשר היא מופעלת בלחצי כניסה שונים של (B) 200 mbar, (C) 400 mbar, (D) 800 mbar ו-(E) 1200 mbar. משך הפעלת השסתום מוצג באזור המוצלל באדום. מים מזוקקים שימשו לכל הניסויים. סטיית תקן של שלוש מדידות בלתי תלויות מוצגת על ידי האזור המוצלל הירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: הקשר בין לחץ וקצב זרימה של ריאגנטים בתעלות הכניסה בעת הפעלת השסתום. (A) בשסתום משטר לחץ כניסה קבוע (300 mbar) קצב הזרימה יורד לאפס עם הפעלת השסתום. (B) במשטר קצב זרימה קבוע (2.5 מיקרוליטר/דקה) הפעלת השסתום גורמת להצטברות לחץ מהירה בתעלה עד לשחרור השסתום. משך הפעלת השסתום מוצג באזור המוצלל באדום. מים מזוקקים שימשו לכל הניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: ייצור אוכלוסיות תקעים פלואורסצנטיים. (A) סכמה של מערך הניסוי המתאר את החיבור של ריאגנטים שונים למכשיר. קיצורים: F = פלואורסצאין, W = מים מזוקקים, B = צבע מאכל כחול, FC-40 = שמן מופלר, ו-MO = שמן מינרלי. (B) תמונה לדוגמה של צינורות איסוף המכילים תקעים. (C) נתונים גולמיים המתקבלים מהניתוח מראים את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת שנמדדה באזור עניין מסוים (ROI) לעומת מספר המסגרת של קובץ הווידאו. קווים אדומים מציגים את הממוצע של שיא הפלואורסצנטיות עבור כל תנאי (אוכלוסיית התקעים המיוצרים בשילוב ספציפי של שלושה כניסות), והקווים המקווקווים מציגים את שגיאת התקן המתאימה. (ד) קופסאות בגובה הפסגות בתנאים השונים. נקודות מתאימות לפסגות בודדות, תיבות לכל תנאי נעות בין הרביעון הראשון לשלישי של התפלגות הפסגות המתאימות, והקו העבה משמש לערך החציוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. קובץ משלים 1: תוכנית הממשק הראשית להפעלת המכשיר. ממשק הבקרה ללחץ ידני של ערוצי הבקרה והפעלת ניסוי אוטומטי במכשיר שמונה כניסות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 2: תוכנית ממשק ראשית חלופית להפעלת המכשיר. ממשק הבקרה להפעלת התקן שמונה כניסות ללא פונקציית ברקוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 3: תת-תוכנית LabVIEW עם משתנים גלובליים. SubVI של תוכנית הממשק הראשי רישום והצגת מצב המשתנים הגלובליים בתוכנית הממשק הראשית, כלומר ערוצי הבקרה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 4: תוכנית LabVIEW לשמירת ערכים של משתנים גלובליים. SubVI של תוכנית הממשק הראשי השומר את המצב הנוכחי של השסתומים כמערך, אשר ישמש כדי לשמור על אותו מצב של השסתומים במקרה של המשתמש להיות לא פעיל במשך יותר מ -30 שניות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 5: פרוטוקול בקרת שידור (TCP) תוכנית LabVIEW. SubVI לשמירה על חיבור TCP בין תוכנית הממשק הראשית לבקר WAGO. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 6: משתנה גלובלי TCP LabVIEW תת-תוכנית. תוכנית לאחסון משתנה פלט TCP. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 7: קלט לביצוע ניסוי אוטומטי. קובץ .csv מקודד הרכב, רצף והעתקים של אוכלוסיות תקעים לביצוע ניסויים לייצור תקעים פלואורסצנטיים כמותיים, כמפורט במאמר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 8: סקריפט Python לניתוח אוכלוסיית תקעים פלואורסצנטיים. סקריפט Python מותאם אישית לקריאת ערכי פלואורסצנטיות מהקלטת תקעים (קובץ .avi). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 9: פלט ניתוח פלואורסצנטי של תקעים. פלט מסקריפט Python המכיל ערכי פלואורסצנטיות עבור החזר השקעה של 5×5 מהקלטת התקעים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 10: תוכנית R לקריאת קובץ פלט. תוכנית מותאמת אישית המשמשת בעבודה זו לקריאת ערכי הפלואורסצנט של הפלט ולהתוויית נתונים גולמיים, גבהי שיא וסטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 11: פונקציות R לניתוח והתוויית נתונים פלואורסצנטיים. פונקציות R מותאמות אישית המשמשות ל- 1. גזור את הנתונים הגולמיים של ערכי הפלואורסצנט, 2. הגדר תנאי ניסוי שונים, 3. לזהות שיאים מהתנאים הנתונים, 4.להתוות את הנתונים הגולמיים ואת התנאים שזוהו חופפים, ו 5. התווה את הפסגות שזוהו והנתונים הגולמיים חפפו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

במאמר זה הוצגה סדרה של פרוטוקולים לייצור ותפעול של התקן מיקרופלואידי מבוסס PDMS לייצור אוטומטי של ספריות קומבינטוריות בתאי מים בשמן הנקראים תקעים. השילוב של מיקרופלואידיקה עם טכנולוגיית טיפות מספק טכניקה רבת עוצמה לתמצת כמות קטנה של ריאגנטים במספר רב של תאים, ובכך פותח אפיקים לסינון קומבינטורי בקנה מידה גדול.

בעבר, תוארו מספר טכנולוגיות ליצירת תאים מובחנים מבחינה כימית באמצעות מיקרופלואידיקה, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה. Kulesa et al.50, תיארו אסטרטגיה לתמצת תאים עם ברקודים בטיפות באמצעות לוחות microtiter ומיזוג טיפות אלה באמצעות שדה חשמלי כדי ליצור ספרייה קומבינטורית. בעוד גישה כזו יכולה ליצור הרבה שילובים של טיפות, היא מוגבלת על ידי הצורך בשלבי טיפול ידניים בזרימת העבודה. Tomasi et al.51 פיתחו פלטפורמה מיקרופלואידית כדי למזג טיפה המכילה ספרואיד (צברי תאים צפים חופשיים) עם טיפת גירוי, ובכך לאפשר מניפולציה של מיקרו-סביבה ספרואידית. שיטה זו מאפשרת לחקור תופעות חשובות כגון אינטראקציות תא-תא והשפעת תרופות, אך היא בעלת תפוקה נמוכה יחסית. Eduati et al.46 ו- Utharala et al.47 פיתחו פלטפורמה מבוססת שסתומים מיקרופלואידים שיכולה ליצור ספריות קומבינטוריות בעלות תפוקה גבוהה באופן אוטומטי. עם זאת, במחקרים אלה, השסתומים מופעלים באמצעות התקן ברייל, מה שמחייב שלבי יישור מסורבלים בין המיקרו-שסתום לבין השבב המיקרופלואידי. תכונה מרכזית של המערכת המתוארת במאמר זה היא יישום של שסתומי PDMS פנאומטיים כדי לווסת את זרימת הנוזל בתעלות הקלט. מכיוון ששסתומים אלה מבוססים על PDMS, ניתן לשלב אותם בצורה חלקה למדי בשלבי הייצור של השבב המיקרופלואידי. בנוסף, הם אפשרות פשוטה יחסית לשלוט על זרימת הנוזלים בתעלות הכניסה, שכן הם יכולים להיות מופעלים על ידי הפעלת לחץ דרך מקור גז חיצוני. לבסוף, ניתן לתכנת את משך ורצף הלחץ והדיכאון של שסתומים אלה, ובכך להפוך את הייצור של אוכלוסיות נפרדות של תקעים לאוטומטי באופן בתפוקה גבוהה. תכונה חשובה נוספת היא השימוש במשטרי לחץ קבועים להזרקת ריאגנטים דרך המפרצון, המאפשר לבטל את הסכמתך לשלב תעלות פסולת כדי להקל על כל הצטברות לחץ המתעוררת במשטר קצב זרימה קבוע. זה מפשט את תכנון המכשיר, מפחית את הצורך בשסתומים וחומרה נוספים כדי לשלוט בשסתומים של ערוץ הפסולת, וממזער בזבוז מגיבים.

בעוד הייצור של מכשירים עם PDMS הוא יחסית לא מסובך, יישום של התקנים כאלה דורש שימוש באביזרי חומרה נרחבים כגון שסתומי סולנואיד פנאומטיים (כדי לשלוט על ההפעלה של שסתומי PDMS), משאבות לחץ (כדי לשלוט על זרימת ריאגנטים כניסה ושמן) ותוכנות (כדי לווסת את שסתומי הסולנואידים). למרות שהם מייצגים השקעה משמעותית, התקנה כזו מספקת עקביות ואמינות לפעולה מוצלחת של המכשיר. בנוסף, רכיבי החומרה והארכיטקטורה המתוארים בפרוטוקול זה מוגדרים באופן מודולרי. לכן, ניתן להשתמש בחלופות עבור מודולים מסוימים כדי להפחית עלויות או להתאים אותם לצורך ספציפי. לדוגמה, קיים מגוון משאבות שניתן להשתמש בהן על בסיס שירות, תקציב, זמינות ונוחות 52,53,54. ניתן לשלב רכיבים נוספים כגון מאגרי נוזלים ומווסתי טמפרטורה עבור ריאגנטים רגישיםלכניסה 23. יתר על כן, ניתן להגדיל או להקטין עיצוב זה כדי לענות על צרכים מדעיים ספציפיים. לדוגמה, במאמר זה מתואר אב טיפוס בעל שמונה כניסות המאפשר לשלב שמונה ריאגנטים ייחודיים ליצירת תקעים. ניתן לשדרג זאת להתקן בעל 16 כניסות המאפשר מספר גדול יותר של כניסות ושילובים גדולים יותר שלהן. כתוצאה מכך, הוא יזדקק לתעלות בקרה נוספות ושסתומי סולנואיד כדי לטפל בפתחים, אך אב טיפוס כזה מאפשר ליצור ספריות קומבינטוריות גדולות ומגוונות יותר. לבסוף, במאמר זה, כל אוכלוסיית תקע נוצרת על ידי פתיחה של שלושה מתוך שמונת הפתחים המימיים של המכשיר המיקרופלואידי. נצפה כי עבור תצורה כזו, לחץ של כ 200 mbar עבור ריאגנטים שמן ו 400 mbar עבור ריאגנטים מימיים תואם משטר של ייצור תקע, אשר מונע אך ורק על ידי הפעלת שסתום. כאשר הופעלו לחצים גבוהים יותר על השמן, נצפתה התפרקות של תקעים, והפעלת לחצים נמוכים יותר הובילה לאיחוי של תקעים. משטר הלחץ האופטימלי לייצור תקע תלוי במגוון רחב של גורמים, כגון מספר הכניסות התורמות להיווצרות תקע, אופי וצמיגות הנוזלים ומידות התעלות, ויש לייעל אותו בעת הצורך.

אחד החסרונות של פעולה במשטר לחץ קבוע הוא שלנוזלים בעלי צמיגות שונה יש קצבי זרימה שונים תחת לחץ קבוע. לכן, יש לוודא כי ריאגנטים מימיים הזורמים דרך המפרצונים הם בעלי צמיגות דומה. השימוש בנוזלים בעלי צמיגויות שונות ישפיע לא רק על זרימת הנוזלים בתעלות הכניסה אלא גם על היווצרות התקע בצומת T, ובכך יפגע בהרכב אוכלוסיות התקעים. חסרון נוסף הוא זיהום אוכלוסיית תקע מגיבים שיוריים בצומת T. כאשר המכשיר עובר בין ייצור של אוכלוסיות תקע שונות, התקע הראשון/האחרון ברצף של כל אוכלוסייה נוטה להיות מזוהם על ידי האוכלוסייה הקודמת או הבאה. ניתן להתגבר על כך על ידי ייצור עותקים משוכפלים נוספים של כל אוכלוסייה והנחת התקע המזוהם במהלך הניתוח. לבסוף, קיים גם פוטנציאל לשונות בין מכשירים בודדים הנובעת מחוסר עקביות בייצור ו / או במקורות חיצוניים (תנודות לחץ). ניתן להקל על בעיה זו על ידי שימוש חוזר בשבב מיקרופלואידי יחיד מספר פעמים והבטחת הפעלה מלאה של ספריה קומבינטורית על שבב יחיד כדי למזער את ההשפעה של חוסר עקביות אלה.

המכשיר המיקרופלואידי והמערך הנלווה של פרוטוקולים תפעוליים המוצגים במאמר זה שימשו להדגמת הייצור של ספרייה קומבינטורית כמותית של תקעים. פלטפורמה זו יכולה, אם כן, ליצור במהירות ספריות קומבינטוריות של אוכלוסיות תקע נפרדות באופן בתפוקה גבוהה. כתוצאה מכך, טכנולוגיות כאלה יכולות לשמש למגוון מטרות הקרנה, כולל, אך לא רק, סינון תרופתי קומבינטורי על דגימות ביופסיה של מטופל – לפיו מספר קטן של תאים שנשלפו מביופסיה יכולים להיות מופצים במספר רב של טיפות ומטופלים בשילוב גדול של התרופה האנטי סרטנית כדי לייעל את הטיפול הפרטני בדגימת חולה נתונה – ולכן להאיץ טיפול מותאם אישית בסרטן46, 48,55.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לסטייסי מרטינה מ-NanoLab TuE על עזרתה בתצהיר אדי HMDS. מחקר זה מומן על ידי המכון למערכות מולקולריות מורכבות (ICMS) ב- TU/e ועל ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) תוכנית הכבידה IMAGINE! (פרויקט מספר 24.005.009).

Materials

1,1,3,3 tetramethyldisiloxane Merck Life Science NV MFCD00008256
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504
Acetone Boom Labs BOOMSKEUZW3
Analysis Software Eindhoven University of Technology https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11D Merck Life Science NV  212299  Positive photoresist 
AZ 726 MIF developer Merck Life Science NV 10055824960 Developer for positive photoresist
Biopsy Punch, Rapid Core World Precision Instruments Germany, GMBH 504529 0.75 mm ID, W/Plunge
Blue food dye PME FC1036
Controller end module  WAGO Kontakttechnik GmbH  750-600
Ethernet Controller  WAGO Kontakttechnik GmbH  750-881
FC-40 Merck Millipore F9755-100ML
Fluigent flow unit Fluigent FLU-S-D
Fluigent pressure system  Fluigent  MFCS-EZ  0 – 2 bar
Fluorescein Merck Life Science NV MFCD00005050
Hot plate  Torrey Pines Scientific  HP61
Inverted microscope  Nikon Instruments  Eclipse Ti-E
Isopropanol Boom Labs BOOMSKEUZE3
LabVIEW (Software Version 20) Eindhoven University of Technology https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_
VERSION_1		 All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files.
Luer stubs  Instech Laboratories, Inc.  LS23 23 ga, 0.5"
Male Luer to barb connectors  Cole Parmer  45505-32  3/32" ID
MasterFlex PTFE tubing Avator/VWR 48634
Microscope Slides VWR 470150-480
Microscope slides,  Plain Corning 2947-75X50
Mineral Oil Merck Millipore 330760-1L
mr DEV 600 Micro resist Technology R815100 Developer for negative photoresist
Oven Thermo Scientific  Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
Photomask CAD/Art Services, Inc.
Photomask Design Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL) https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
Pneumatic valve array FESTO 1x 8 valve array, Normally closed valves
Silicon Wafers Silicon Materials <1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness
Single edge blades  GEM Scientific
Soft tubing Fluigent 1 mm ID, 3 mm OD
Spin coater  Laurell Technologies Corporation  WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope  Olympus Corporation  SZ61
SU-8 3050 Kayakli Advanced Materials Y311075 1000L1GL Negative photoresist
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow 1317318
Syringe B Braun Injekt – F Fine Dosage Syringe 10303002
UV-LED exposure system Idonus UV-EXP150S-SYS
Vacuum pump  Vacuumbrand GmbH  MD1C
Weighing scales  Sartorius  M-prove
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  2. Terry, S. C., Herman, J. H., Angell, J. B. A gas chromatographic air analyzer fabricated on a Silicon wafer. IEEE Transactions on Electron Devices. 26 (12), 1880-1886 (1979).
  3. Mellors, J. S., Gorbounov, V., Ramsey, R. S., Ramsey, J. M. Fully integrated glass microfluidic device for performing high-efficiency capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80 (18), 6881-6887 (2008).
  4. Wlodarczyk, K. L., Hand, D. P., Maroto-Valer, M. M. Maskless, rapid manufacturing of glass microfluidic devices using a picosecond pulsed laser. Sci Rep. 9 (1), 20215 (2019).
  5. Nielsen, J. B., et al. Microfluidics: innovations in materials and their fabrication and functionalization. Anal Chem. 92 (1), 150-168 (2020).
  6. Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
  7. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Oh, K. W., Ahn, C. H. A review of microvalves. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (5), R13 (2006).
  10. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (2), 179-220 (2011).
  11. Jerman, H. Electrically-activated, normally-closed diaphragm valves. J. Micromech. Microeng. 4 (4), 210 (1994).
  12. Neagu, C. R., Gardeniers, J. G. E., Elwenspoek, M., Kelly, J. J. An electrochemical microactuator: principle and first results. J microelectromechanical sys. 5 (1), 2-9 (1996).
  13. Gu, W., Zhu, X., Futai, N., Cho, B. S., Takayama, S. Computerized microfluidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15861-15866 (2004).
  14. Studer, V., et al. Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve. J Appl Phys. 95 (1), 393-398 (2004).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Ridgeway, W. K., Seitaridou, E., Phillips, R., Williamson, J. R. RNA-protein binding kinetics in an automated microfluidic reactor. Nucleic Acids Res. 37 (21), e142 (2009).
  17. Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C., Arnold, F. H., Quake, S. R. An integrated microfabricated cell sorter. Anal Chem. 74 (11), 2451-2457 (2002).
  18. Liu, J., Enzelberger, M., Quake, S. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction. Electrophoresis. 23 (10), 1531-1536 (2002).
  19. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  20. Galas, J. C., Haghiri-Gosnet, A. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab Chip. 13 (3), 415-423 (2013).
  21. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synth Biol. 7 (12), 2879-2887 (2018).
  23. van der Linden, A. J., et al. A multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression. J Vis Exp. (152), 59655 (2019).
  24. Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging droplet microfluidics. Chem Rev. 117 (12), 7964-8040 (2017).
  25. Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S. Droplet based microfluidics. Rep Prog Phys. 75, 016601 (2012).
  26. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  27. Clausell-Tormos, J., et al. Droplet-based microfluidic platforms for the encapsulation and screening of mammalian cells and multicellular organisms. Chem Biol. 15 (5), 427-437 (2008).
  28. Umbanhowar, P. B., Prasad, V., Weitz, D. A. Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream. Langmuir. 16 (2), 347-351 (2000).
  29. Abate, A. R., Thiele, J., Weitz, D. A. One-step formation of multiple emulsions in microfluidics. Lab Chip. 11 (2), 253-258 (2011).
  30. Chen, Y., Gao, W., Zhang, C., Zhao, Y. Three-dimensional splitting microfluidics. Lab Chip. 16 (8), 1332-1339 (2016).
  31. Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl Phys Lett. 88 (26), 264105 (2006).
  32. Fidalgo, L. M., Abell, C., Huck, W. T. S. Surface-induced droplet fusion in microfluidic devices. Lab Chip. 7 (8), 984-986 (2007).
  33. Bernath, K., et al. In vitro compartmentalization by double emulsions: Sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
  34. Aharoni, A., Amitai, G., Bernath, K., Magdassi, S., Tawfik, D. S. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments. Chem Biol. 12 (12), 1281-1289 (2005).
  35. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. S. Monodisperse uni- and multicompartment liposomes. J Am Chem Soc. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  36. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. S. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. J Am Chem Soc. 139 (2), 587-590 (2016).
  37. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  38. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  39. Shembekar, N., Chaipan, C., Utharala, R., Merten, C. A. Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics. Lab Chip. 16 (8), 1314-1331 (2016).
  40. Wong, A. H., et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 7 (1), 9109 (2017).
  41. Jing, W., Han, H. Droplet microfluidics for high-resolution virology. Anal Chem. 94 (23), 8085-8100 (2022).
  42. Ding, Y., Choo, J., deMello, A. J. From single-molecule detection to next-generation sequencing: microfluidic droplets for high-throughput nucleic acid analysis. Microfluid Nanofluidics. 21 (3), 58 (2017).
  43. Nightingale, A. M., et al. A stable droplet reactor for high temperature nanocrystal synthesis. Lab Chip. 11 (7), 1221-1227 (2011).
  44. De Stefano, P., Bianchi, E., Dubini, G. The impact of microfluidics in high- throughput drug-screening applications. Biomicrofluidics. 16 (3), 031501 (2022).
  45. Tekin, E., et al. Prevalence and patterns of higher-order drug interactions in Escherichia coli. NPJ Syst Biol Appl. 4, 31 (2018).
  46. Eduati, F., et al. A microfluidics platform for combinatorial drug screening on cancer biopsies. Nat Commun. 9 (1), 2434 (2018).
  47. Utharala, R., et al. A microfluidic Braille valve platform for on-demand production, combinatorial screening and sorting of chemically distinct droplets. Nat Protoc. 17 (12), 2920-2965 (2022).
  48. Mathur, L., et al. Combi-seq for multiplexed transcriptome-based profiling of drug combinations using deterministic barcoding in single-cell droplets. Nat Commun. 13 (1), 4450 (2022).
  49. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription–translation for the prototyping of synthetic communication networks. Curr Opin Biotechnol. 58, 72-80 (2019).
  50. Kulesa, A., Kehe, J., Hurtado, J. E., Tawde, P., Blainey, P. C. Combinatorial drug discovery in nanoliter droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (26), 6685-6690 (2018).
  51. Tomasi, R. F. X., Sart, S., Champetier, T., Baroud, C. N. Individual control and quantification of 3D spheroids in a high-density microfluidic droplet array. Cell Rep. 31 (8), 107670 (2020).
  52. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).
  53. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  54. Gonzalez-Suarez, A. M., Long, A., Huang, X. H., Revzin, A. A Compact control system to enable automated operation of microfluidic bioanalytical assays. Biosensors. 12 (12), 1160 (2022).
  55. Mathur, L., Ballinger, M., Utharala, R., Merten, C. A. Microfluidics as an enabling technology for personalized cancer therapy. Small. 16 (9), e1904321 (2020).

Tags

Microfluidic DeviceBilayer Microfluidic DeviceCombinatorial Plug ProductionQuake ValvesTumor MicroenvironmentPrecision OncologyDroplet MicrofluidicsPDMSPressure-drivenCombinatorial LibraryBiochemical Reactions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Yelleswarapu, M., Spinthaki, S., de Greef, T. F. A., Eduati, F. Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production. J. Vis. Exp. (202), e66154, doi:10.3791/66154 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image