جهاز الموائع الدقيقة ثنائي الطبقة لإنتاج المكونات التوافقية
Summary
يتم تقديم تصنيع جهاز ثنائي الطبقة قائم على polydimethylsiloxane (PDMS) لإنتاج المكتبات التوافقية في مستحلبات الماء في الزيت (المقابس). يتم تفصيل الأجهزة والبرامج اللازمة لأتمتة إنتاج المكونات في البروتوكول ، كما يتم عرض إنتاج مكتبة كمية من المقابس الفلورية.
Abstract
Droplet microfluidics هي أداة متعددة الاستخدامات تسمح بتنفيذ عدد كبير من التفاعلات في مقصورات نانولتر متميزة كيميائيا. تم استخدام هذه الأنظمة لتغليف مجموعة متنوعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية – من حضانة الخلايا المفردة إلى تنفيذ تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من علم الجينوم إلى التخليق الكيميائي. يسمح اقتران قنوات الموائع الدقيقة بالصمامات التنظيمية بالتحكم في فتحها وإغلاقها ، مما يتيح الإنتاج السريع للمكتبات التوافقية واسعة النطاق التي تتكون من مجموعة من القطرات ذات التراكيب الفريدة. في هذا البحث ، يتم تقديم بروتوكولات لتصنيع وتشغيل جهاز الموائع الدقيقة ثنائي الطبقة القائم على الضغط PDMS والذي يمكن استخدامه لإنشاء مكتبات اندماجية لمستحلبات الماء في الزيت تسمى المقابس. من خلال دمج البرامج وأجهزة الموائع الدقيقة ، يمكن التحكم في تدفق السوائل المرغوبة في الجهاز ومعالجتها لإنشاء مكتبات سدادات اندماجية والتحكم في تكوين وكمية مجموعات المكونات المكونة. ستعمل هذه البروتوكولات على تسريع عملية إنشاء شاشات اندماجية ، خاصة لدراسة استجابة الأدوية في الخلايا من خزعات مرضى السرطان.
Introduction
تسمح الموائع الدقيقة بمعالجة كميات صغيرة من السوائل في القنوات الدقيقة1. يتراوح حجم تشغيل أجهزة الموائع الدقيقة النموذجية من عشرات إلى مئات الميكرومترات التي تسمح بتصغير التفاعلات الكيميائية والبيولوجية ، مما يتيح إجراء مثل هذه التفاعلات بكميات صغيرة نسبيا من الكواشف. في البداية ، تم تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة بمواد مثل السيليكون2 والزجاج3. على الرغم من أنها لا تزال قيد الاستخدام4 ، إلا أنها تطرح بعض المشكلات ، مثل توافق المذيبات ، وارتفاع تكلفة التصنيع ، والصعوبات في دمج ضوابط تدفق السوائل 5,6. توفر منهجيات التصنيع القائمة على PDMS ، والتي يطلق عليها الطباعة الحجرية الناعمة ، بديلا غير مكلف للنماذج الأولية السريعة للأجهزة7 ووسيلة لتصنيع أجهزة معقدة متعددة الطبقات8. تسمح إضافة الصمامات والمضخات إلى أجهزة PDMS بالقدرة على التحكم في توجيه وسرعة السوائل في الأجهزة 9,10. تم تطوير عدة طرق لتصميم وتشغيل الصمامات الدقيقة بطريقة عكسية أو لا رجعة فيها – على سبيل المثال ، الصمامات ثنائية المعدن المصنوعة من السيليكون والألمنيوم ، والتي يتم تشغيلها حراريا11 أو باستخدام الغاز المتولد من تفاعل كهروكيميائي لانحراف غشاء نيتريد السيليكون12. يوضح Gu et al. استخدام المسامير الميكانيكية لشاشة برايل للضغط على القنوات الدقيقة لتنظيم التدفق13. مجموعة واحدة من الصمامات الدقيقة التي اكتسبت شعبية هي الصمامات الهوائية القائمة على PDMS التي ابتكرتها مجموعة ستيفن كويك14. عادة ، تتكون هذه الصمامات من قناتين صغيرتين متعامدتين – قناة تدفق وقناة تحكم. عند ضغط قناة التحكم ، ينحرف غشاء PDMS الرقيق على قناة التدفق ، ويغلقها وبالتالي يقطع تدفق السوائل. بمجرد إزالة الضغط ، يرتاح الغشاء ، وبالتالي يفتح قناة التدفق ويسمح باستئناف تدفق السوائل. وبالتالي تسمح صمامات PDMS بتنظيم التدفق بطريقة قوية وقابلة للعكس حيث يمكن ضغط قناة التحكم وإزالة الضغط عدة مرات15. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأنه يمكن تشغيل هذه الصمامات عن طريق تطبيق الضغط ، فإنها تفتح سبلا للتحكم الرقمي والأتمتة16. علاوة على ذلك ، نظرا لأنها من نفس المادة ، يمكن دمجها بسلاسة في تصنيع الأجهزة القائمة على PDMS باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية اللينة8،17،18. هذه الميزات تجعل صمامات PDMS خيارا جذابا لتنظيم التدفق في أجهزة الموائع الدقيقة. استخدم Thorsen et al. مبدأ هذه الصمامات لتصميم مضاعف سائل – مجموعة اندماجية من الصمامات الهوائية – لمعالجة ما يقرب من ألف قناة تدفق إدخال مع عشرين قناة تحكم19. تم توسيع هذا المبدأ لتوجيه السوائل بشكل انتقائي إلى كيموستات الموائع الدقيقة داخل الرقاقة بحيث يمكن إجراء تفاعلات فريدة في وقت واحد في كل مفاعل20،21،22،23. ومع ذلك ، فإن هذه المفاعلات الدقيقة ، على الرغم من فائدتها في الاستخدام الأمثل للكواشف المحدودة ، لا يمكن أن توازي تفاعلات متعددة ولا تكفي للدراسات عالية الإنتاجية.
الموائع الدقيقة للقطرات هي فئة فرعية من الموائع الدقيقة التي تنطوي على إنتاج قطرات من خلال معالجة تدفق السائل غير القابل للامتزاج متعدد الأطوار في أجهزة الموائع الدقيقة24. يتضمن تكوين القطيرات تفكك سائل مستمر عن طريق إدخال سائل غير قابل للامتزاج ، مما يؤدي إلى قرصة بسبب عدم الاستقرار في الطاقة البينية وفي تكوين مستحلب25. تساعد المواد الخافضة للتوتر السطحي في تكوين قطرات مستديرة عندما تغادر المستحلبات القناة الدقيقة عن طريق تثبيت الطاقات البينية26. القطرات الأكبر حجما ، والتي تسمى المقابس ، أقل استقرارا ويمكن جمعها في حجرة احتجاز (مثل طول الأنبوب) كمجموعة من المقصورات المائية متباعدة على كلا الجانبين بواحد أو أكثر من السوائل غير القابلة للامتزاج27. بالإضافة إلى التصغير والتقسيم ، توفر الموائع الدقيقة للقطرات أيضا إنتاجية متزايدة للتفاعلات البيولوجية ، حيث يمكن إنتاج عدد كبير من قطرات أحادية التشتت – كل منها بمثابة مفاعل نانوي28. يمكن أيضا أن تتعرض القطرات ، بمجرد توليدها ، لمزيد من التلاعب ، مثل تقسيم 29,30 ، والانصهار31,32 ، والفرز33,34 ، والتجميع في هياكل أعلى مرتبة35,36. أحدثت الموائع الدقيقة للقطرات ثورة في العديد من المجالات والتقنيات العلمية – من PCR37 إلى نسخ الخليةالواحدة 38 ، من اكتشاف الأدوية39,40 إلى علم الفيروسات41 ، من تسلسل الجيل التالي42 إلى التخليق الكيميائي43.
يعد دمج الطباعة الحجرية اللينة والصمامات الدقيقة القائمة على PDMS مع تقنية القطيرات مزيجا قويا يسمح بتنظيم تدفق السوائل في القنوات الدقيقة والتحكم اللاحق في محتويات القطيرات. اعتمادا على فتح وإغلاق القنوات ، من الممكن إنتاج مجموعات متميزة من القطرات ، لكل منها تركيبة محددة. يمكن لمثل هذه المنصة تصغير التفاعلات الكيميائية الحيوية وتجزئتها وموازاتها ، وبالتالي تكون تقنية مفيدة للفحص التوافقي44. الفحص التوافقي هو طريقة عالية الإنتاجية لتوليد عشرات الآلاف من مجموعات الكواشف المختارة لإنتاج مكتبات تتكون من مجموعات فردية ذات تكوين معروف. تم استخدام الفحص التوافقي لاكتشاف التأثيرات التآزرية بين الأدوية والمضادات الحيوية لتثبيط نمو البكتيريا45. في مجال علاج السرطان ، تم استخدام الفحص التوافقي لاختبار مجموعات من الأدوية المضادة للسرطان لمريض معين وبالتالي تطوير العلاج الشخصي46,47. قام Mathur et al. بالبناء على هذه التقنية من خلال دمج نهج الترميز الشريطي للحمض النووي التوافقي لتقييم تغييرات النسخ في فحص الأدوية عالي الإنتاجية48. وبالتالي ، فإن الفحص التوافقي هو تقنية قوية ولكنها ناشئة ، وهناك حاجة لتطوير تقنيات الموائع الدقيقة المتنوعة لتنفيذ وتسهيل إجراءات الفحص هذه.
الهدف من هذه المخطوطة هو تقديم مجموعة كاملة من البروتوكولات لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة ثنائي الطبقة قادر على توليد مكتبة اندماجية من سدادات الماء في الزيت ووصف الأجهزة والبرامج اللازمة لتشغيل مثل هذا الجهاز. يتم تنظيم تدفق السوائل باستخدام صمامات هوائية قائمة على PDMS يتم التحكم فيها بالضغط ، والتي يتم التحكم فيها بدورها بواسطة برنامج LabVIEW مخصص. يتم تحقيق تدفق الكواشف في الجهاز باستخدام مضخات الضغط المتاحة تجاريا. يتم تقديم نموذج أولي من ثمانية مداخل حيث يتم تشكيل قابس من محتويات ثلاثة مداخل ، يحتوي كل منها على كاشف مائي. يلتقي الطور المائي بمرحلة الزيت المستمرة ، ويتم إنتاج المقابس عند تقاطع T بتردد 0.33 هرتز. يتم إثبات عمل النظام من خلال إنتاج مكتبة كمية تحتوي على ثلاث مجموعات متميزة من سدادات الفلورسنت. ستساعد هذه التكنولوجيا ومجموعة البروتوكولات على تسريع إنتاج المكتبات التوافقية لأغراض الفحص عالية الإنتاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة ، تم تقديم مجموعة من البروتوكولات لتصنيع وتشغيل جهاز الموائع الدقيقة القائم على PDMS للتوليد الآلي للمكتبات التوافقية في مقصورات الماء في الزيت تسمى المقابس. يوفر الجمع بين الموائع الدقيقة وتقنية القطيرات تقنية قوية لتغليف كمية صغيرة من الكواشف في عدد كبير من المقصورات ، وبالتالي فتح طرق للفحص التوافقي على نطاق واسع.
في السابق ، تم وصف العديد من التقنيات لتوليد مقصورات متميزة كيميائيا باستخدام الموائع الدقيقة ، ولكل منها مزاياها وقيودها. وصف Kulesa et al.50 استراتيجية لتغليف الخلايا بالرموز الشريطية في قطرات باستخدام ألواح المعايرة الدقيقة ودمج هذه القطرات باستخدام مجال كهربائي لإنشاء مكتبة توافقية. في حين أن مثل هذا النهج يمكن أن يولد الكثير من مجموعات القطرات ، إلا أنه محدود بالحاجة إلى خطوات المعالجة اليدوية في سير العمل. طور Tomasi et al.51 منصة الموائع الدقيقة لدمج قطرة كروية (مجاميع الخلايا العائمة الحرة) المحتوية مع قطرة محفزة ، مما يسمح بمعالجة البيئة المكروية الكروية. تسمح هذه الطريقة بدراسة الظواهر المهمة مثل تفاعلات الخلايا والخلايا وتأثير الأدوية ، ولكنها إنتاجية منخفضة نسبيا. طور Eduati et al.46 و Utharala et al.47 منصة قائمة على صمام الموائع الدقيقة يمكنها إنشاء مكتبات اندماجية عالية الإنتاجية بطريقة آلية. ومع ذلك ، في هذه الدراسات ، يتم تشغيل الصمامات باستخدام جهاز برايل ، مما يتطلب خطوات محاذاة مرهقة بين الصمام الدقيق وشريحة الموائع الدقيقة. الميزة الرئيسية للنظام الموصوف في هذا البحث هي تنفيذ صمامات PDMS الهوائية لتنظيم تدفق السوائل في قنوات الإدخال. نظرا لأن هذه الصمامات تعتمد على PDMS ، فيمكن دمجها بسلاسة في خطوات تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، فهي خيار مباشر نسبيا للتحكم في تدفق السوائل في قنوات المدخل ، حيث يمكن تشغيلها عن طريق الضغط من خلال مصدر غاز خارجي. أخيرا ، يمكن برمجة مدة وتسلسل الضغط وإزالة الضغط من هذه الصمامات ، وبالتالي أتمتة إنتاج مجموعات متميزة من المقابس بطريقة عالية الإنتاجية. ميزة أخرى مهمة هي استخدام أنظمة الضغط المستمر لحقن الكواشف من خلال المدخل ، مما يسمح للمرء بإلغاء الاشتراك في دمج قنوات النفايات لتخفيف أي تراكم للضغط ينشأ في نظام معدل التدفق المستمر. هذا يبسط تصميم الجهاز ، ويقلل من الحاجة إلى صمامات وأجهزة إضافية للتحكم في صمامات قناة النفايات ، ويقلل من هدر الكاشف.
في حين أن تصنيع الأجهزة المزودة بنظام PDMS غير معقد نسبيا ، فإن تنفيذ مثل هذه الأجهزة يتطلب استخدام أدوات أجهزة واسعة النطاق مثل صمامات الملف اللولبي الهوائية (للتحكم في تشغيل صمامات PDMS) ومضخات الضغط (للتحكم في تدفق الكواشف الداخلية والزيتية) والبرامج (لتنظيم صمامات الملف اللولبي). في حين أنها تمثل استثمارا كبيرا ، فإن هذا الإعداد يوفر الاتساق والموثوقية للتشغيل الناجح للجهاز. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إعداد مكونات الأجهزة والبنية الموضحة في هذا البروتوكول بطريقة معيارية. لذلك ، يمكن استخدام بدائل لبعض الوحدات لتقليل التكاليف أو لتكييفها مع حاجة معينة. على سبيل المثال ، هناك مجموعة متنوعة من المضخات التي يمكن استخدامها بناء على المرافق والميزانية والتوافر والراحة52،53،54. يمكن دمج مكونات إضافية مثل خزانات السوائل ومنظمات درجة الحرارة لكواشف المدخل الحساسة23. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع نطاق هذا التصميم أو تصغيره لتلبية احتياجات علمية محددة. على سبيل المثال ، في هذه الورقة ، تم وصف نموذج أولي من ثمانية مداخل يسمح بدمج ثمانية كواشف فريدة لإنتاج المقابس. يمكن ترقية هذا إلى جهاز مكون من 16 مدخلا يسمح بعدد أكبر من المداخل ومجموعات أكبر منها. وبالتالي ، ستحتاج إلى قنوات تحكم إضافية وصمامات ملف لولبي لمعالجة المداخل ، لكن مثل هذا النموذج الأولي يسمح بإنشاء مكتبات اندماجية أكبر وأكثر تنوعا. أخيرا ، في هذه الورقة ، يتم إنتاج كل مجموعة سدادة عن طريق فتح ثلاثة من أصل ثمانية مداخل مائية لجهاز الموائع الدقيقة. وقد لوحظ أنه بالنسبة لمثل هذا التكوين ، فإن الضغط البالغ حوالي 200 ملي بار لكواشف الزيت و 400 ملي بار للكواشف المائية يتوافق مع نظام إنتاج المكونات ، والذي يتم تشغيله فقط عن طريق تشغيل الصمام. عندما تم تطبيق ضغوط أعلى على الزيت (الزيتات) ، لوحظ تفكك المقابس ، وأدى تطبيق ضغوط أقل إلى اندماج المقابس. يعتمد نظام الضغط الأمثل لإنتاج المكونات على مجموعة واسعة من العوامل ، مثل عدد المداخل التي تساهم في تكوين القابس ، وطبيعة ولزوجة السوائل ، وأبعاد القنوات ، ويجب تحسينها عند الضرورة.
أحد عيوب العمل في نظام الضغط الثابت هو أن السوائل ذات اللزوجة المختلفة لها معدلات تدفق مختلفة تحت ضغط ثابت. لذلك ، يجب التأكد من أن الكواشف المائية التي تتدفق عبر المداخل ذات لزوجة مماثلة. لن يؤثر استخدام السوائل ذات اللزوجة المختلفة على تدفق السوائل في قنوات المدخل فحسب ، بل سيؤثر أيضا على تكوين السدادة عند تقاطع T ، مما يضر بتكوين مجموعات القابس. عيب آخر هو تلوث مجموعة المكونات من الكواشف المتبقية عند تقاطع T. عندما ينتقل الجهاز بين إنتاج مجموعات سدادة مختلفة ، يميل القابس الأول / الأخير في تسلسل كل مجموعة سكانية إلى أن يكون ملوثا بالسكان السابقين أو التاليين. يمكن التغلب على ذلك عن طريق إنتاج نسخ متماثلة إضافية لكل مجموعة وخصم القابس الملوث أثناء التحليل. أخيرا ، هناك أيضا احتمال حدوث تباين بين الأجهزة الفردية الناشئة عن التناقضات في التصنيع و / أو المصادر الخارجية (تقلبات الضغط). يمكن التخفيف من هذه المشكلة عن طريق إعادة استخدام شريحة ميكروفلويديك واحدة عدة مرات والتأكد من إجراء تشغيل كامل لمكتبة اندماجية على شريحة واحدة لتقليل تأثير هذه التناقضات.
تم استخدام جهاز الموائع الدقيقة والمجموعة المصاحبة من البروتوكولات التشغيلية المقدمة في هذه الورقة لإثبات إنتاج مكتبة اندماجية كمية من المقابس. وبالتالي ، يمكن لهذه المنصة أن تولد بسرعة مكتبات اندماجية لمجموعات توصيل متميزة بطريقة عالية الإنتاجية. نتيجة لذلك ، يمكن استخدام هذه التقنيات لمجموعة متنوعة من أغراض الفحص بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، فحص الأدوية التوافقي على عينات خزعة المريض – حيث يمكن توزيع عدد صغير من الخلايا المسترجعة من الخزعة في عدد كبير من القطرات ومعالجتها بمزيج كبير من الدواء المضاد للسرطان لتحسين العلاج الفردي لعينة معينة من المريض – وبالتالي تسريع علاج السرطان الشخصي46 ، 48,55.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ستايسي مارتينا من NanoLab TuE للمساعدة في ترسب بخار HMDS. تم تمويل هذا البحث من قبل معهد الأنظمة الجزيئية المعقدة (ICMS) في TU / e ومن قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO) برنامج الجاذبية IMAGINE! (رقم المشروع 24.005.009).
Materials
| 1,1,3,3 tetramethyldisiloxane | Merck Life Science NV | MFCD00008256 | |
| 4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | |
| Acetone | Boom Labs | BOOMSKEUZW3 | |
| Analysis Software | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE | |
| AZ 40XT 11D | Merck Life Science NV | 212299 | Positive photoresist |
| AZ 726 MIF developer | Merck Life Science NV | 10055824960 | Developer for positive photoresist |
| Biopsy Punch, Rapid Core | World Precision Instruments Germany, GMBH | 504529 | 0.75 mm ID, W/Plunge |
| Blue food dye | PME | FC1036 | |
| Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
| Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
| FC-40 | Merck Millipore | F9755-100ML | |
| Fluigent flow unit | Fluigent | FLU-S-D | |
| Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 – 2 bar |
| Fluorescein | Merck Life Science NV | MFCD00005050 | |
| Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
| Isopropanol | Boom Labs | BOOMSKEUZE3 | |
| LabVIEW (Software Version 20) | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1 |
All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files. |
| Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | 23 ga, 0.5" |
| Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
| MasterFlex PTFE tubing | Avator/VWR | 48634 | |
| Microscope Slides | VWR | 470150-480 | |
| Microscope slides, Plain | Corning | 2947-75X50 | |
| Mineral Oil | Merck Millipore | 330760-1L | |
| mr DEV 600 | Micro resist Technology | R815100 | Developer for negative photoresist |
| Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
| Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | ||
| Photomask Design | Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL) | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg | |
| Pneumatic valve array | FESTO | 1x 8 valve array, Normally closed valves | |
| Silicon Wafers | Silicon Materials | <1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness | |
| Single edge blades | GEM Scientific | ||
| Soft tubing | Fluigent | 1 mm ID, 3 mm OD | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
| Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| SU-8 3050 | Kayakli Advanced Materials | Y311075 1000L1GL | Negative photoresist |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 1317318 | |
| Syringe | B Braun Injekt – F Fine Dosage Syringe | 10303002 | |
| UV-LED exposure system | Idonus | UV-EXP150S-SYS | |
| Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
| Weighing scales | Sartorius | M-prove |
Referências
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Terry, S. C., Herman, J. H., Angell, J. B. A gas chromatographic air analyzer fabricated on a Silicon wafer. IEEE Transactions on Electron Devices. 26 (12), 1880-1886 (1979).
- Mellors, J. S., Gorbounov, V., Ramsey, R. S., Ramsey, J. M. Fully integrated glass microfluidic device for performing high-efficiency capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80 (18), 6881-6887 (2008).
- Wlodarczyk, K. L., Hand, D. P., Maroto-Valer, M. M. Maskless, rapid manufacturing of glass microfluidic devices using a picosecond pulsed laser. Sci Rep. 9 (1), 20215 (2019).
- Nielsen, J. B., et al. Microfluidics: innovations in materials and their fabrication and functionalization. Anal Chem. 92 (1), 150-168 (2020).
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Oh, K. W., Ahn, C. H. A review of microvalves. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (5), R13 (2006).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (2), 179-220 (2011).
- Jerman, H. Electrically-activated, normally-closed diaphragm valves. J. Micromech. Microeng. 4 (4), 210 (1994).
- Neagu, C. R., Gardeniers, J. G. E., Elwenspoek, M., Kelly, J. J. An electrochemical microactuator: principle and first results. J microelectromechanical sys. 5 (1), 2-9 (1996).
- Gu, W., Zhu, X., Futai, N., Cho, B. S., Takayama, S. Computerized microfluidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15861-15866 (2004).
- Studer, V., et al. Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve. J Appl Phys. 95 (1), 393-398 (2004).
- Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (40), 14431-14436 (2004).
- Ridgeway, W. K., Seitaridou, E., Phillips, R., Williamson, J. R. RNA-protein binding kinetics in an automated microfluidic reactor. Nucleic Acids Res. 37 (21), e142 (2009).
- Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C., Arnold, F. H., Quake, S. R. An integrated microfabricated cell sorter. Anal Chem. 74 (11), 2451-2457 (2002).
- Liu, J., Enzelberger, M., Quake, S. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction. Electrophoresis. 23 (10), 1531-1536 (2002).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Galas, J. C., Haghiri-Gosnet, A. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab Chip. 13 (3), 415-423 (2013).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 15985-15990 (2013).
- Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synth Biol. 7 (12), 2879-2887 (2018).
- van der Linden, A. J., et al. A multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression. J Vis Exp. (152), 59655 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging droplet microfluidics. Chem Rev. 117 (12), 7964-8040 (2017).
- Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S. Droplet based microfluidics. Rep Prog Phys. 75, 016601 (2012).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Clausell-Tormos, J., et al. Droplet-based microfluidic platforms for the encapsulation and screening of mammalian cells and multicellular organisms. Chem Biol. 15 (5), 427-437 (2008).
- Umbanhowar, P. B., Prasad, V., Weitz, D. A. Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream. Langmuir. 16 (2), 347-351 (2000).
- Abate, A. R., Thiele, J., Weitz, D. A. One-step formation of multiple emulsions in microfluidics. Lab Chip. 11 (2), 253-258 (2011).
- Chen, Y., Gao, W., Zhang, C., Zhao, Y. Three-dimensional splitting microfluidics. Lab Chip. 16 (8), 1332-1339 (2016).
- Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl Phys Lett. 88 (26), 264105 (2006).
- Fidalgo, L. M., Abell, C., Huck, W. T. S. Surface-induced droplet fusion in microfluidic devices. Lab Chip. 7 (8), 984-986 (2007).
- Bernath, K., et al. In vitro compartmentalization by double emulsions: Sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
- Aharoni, A., Amitai, G., Bernath, K., Magdassi, S., Tawfik, D. S. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments. Chem Biol. 12 (12), 1281-1289 (2005).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. S. Monodisperse uni- and multicompartment liposomes. J Am Chem Soc. 138 (24), 7584-7591 (2016).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. S. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. J Am Chem Soc. 139 (2), 587-590 (2016).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Shembekar, N., Chaipan, C., Utharala, R., Merten, C. A. Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics. Lab Chip. 16 (8), 1314-1331 (2016).
- Wong, A. H., et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 7 (1), 9109 (2017).
- Jing, W., Han, H. Droplet microfluidics for high-resolution virology. Anal Chem. 94 (23), 8085-8100 (2022).
- Ding, Y., Choo, J., deMello, A. J. From single-molecule detection to next-generation sequencing: microfluidic droplets for high-throughput nucleic acid analysis. Microfluid Nanofluidics. 21 (3), 58 (2017).
- Nightingale, A. M., et al. A stable droplet reactor for high temperature nanocrystal synthesis. Lab Chip. 11 (7), 1221-1227 (2011).
- De Stefano, P., Bianchi, E., Dubini, G. The impact of microfluidics in high- throughput drug-screening applications. Biomicrofluidics. 16 (3), 031501 (2022).
- Tekin, E., et al. Prevalence and patterns of higher-order drug interactions in Escherichia coli. NPJ Syst Biol Appl. 4, 31 (2018).
- Eduati, F., et al. A microfluidics platform for combinatorial drug screening on cancer biopsies. Nat Commun. 9 (1), 2434 (2018).
- Utharala, R., et al. A microfluidic Braille valve platform for on-demand production, combinatorial screening and sorting of chemically distinct droplets. Nat Protoc. 17 (12), 2920-2965 (2022).
- Mathur, L., et al. Combi-seq for multiplexed transcriptome-based profiling of drug combinations using deterministic barcoding in single-cell droplets. Nat Commun. 13 (1), 4450 (2022).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription–translation for the prototyping of synthetic communication networks. Curr Opin Biotechnol. 58, 72-80 (2019).
- Kulesa, A., Kehe, J., Hurtado, J. E., Tawde, P., Blainey, P. C. Combinatorial drug discovery in nanoliter droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (26), 6685-6690 (2018).
- Tomasi, R. F. X., Sart, S., Champetier, T., Baroud, C. N. Individual control and quantification of 3D spheroids in a high-density microfluidic droplet array. Cell Rep. 31 (8), 107670 (2020).
- White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).
- Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
- Gonzalez-Suarez, A. M., Long, A., Huang, X. H., Revzin, A. A Compact control system to enable automated operation of microfluidic bioanalytical assays. Biosensors. 12 (12), 1160 (2022).
- Mathur, L., Ballinger, M., Utharala, R., Merten, C. A. Microfluidics as an enabling technology for personalized cancer therapy. Small. 16 (9), e1904321 (2020).
