No tratamento de águas residuais e na recuperação de recursos hídricos, biofilmes benéficos em reatores de crescimento acoplados são cada vez mais empregados para permitir que micróbios convertam poluentes indesejáveis, como matéria orgânica, nitrogênio e fosfato, em formas estabilizadas que podem ser facilmente removidas da água¹. Nesses sistemas, a função emergente do biofilme, ou seja, as transformações bioquímicas, está intimamente associada à diversidade de micróbios que nele residem e aos nutrientes que esses micróbios recebem². Assim, o crescimento contínuo do biofilme pode representar um desafio para manter a funcionalidade consistente do reator, pois o crescimento do novo biofilme pode alterar os processos metabólicos gerais do biofilme, as características de transferência de massa e a composição da comunidade. Estabilizar ao máximo o ambiente do biofilme pode proteger contra tais alterações³. Isso inclui garantir um fluxo consistente de nutrientes e manter a estrutura do biofilme estável com uma espessura constante⁴. O monitoramento da rigidez e da estrutura física do biofilme permitiria que os pesquisadores obtivessem informações sobre a saúde geral e o funcionamento do biofilme.

Os biofilmes apresentam propriedades viscoelásticas ^5,6,7. Essa natureza viscoelástica resulta em uma combinação de uma deformação instantânea e lenta, dependente do tempo, em resposta a forças mecânicas externas. Um aspecto único dos biofilmes é que, quando submetidos a deformações substanciais, respondem como líquidos viscosos. Por outro lado, quando submetidos a pequenas deformações, sua resposta é comparável aos sólidos⁵. Além disso, dentro dessa pequena região de deformação, existe uma faixa de deformação sob a qual os biofilmes exibem uma relação linear força-deslocamento ^5,6,7. Deformações dentro dessa faixa linear são ótimas para avaliar as características mecânicas do biofilme, pois produzem medidas reprodutíveis. Várias técnicas podem quantificar a resposta elástica dentro dessa faixa. A elastografia de coerência óptica (ECO) é uma técnica emergente que está sendo adaptada para a análise de biofilmes nessa faixa linear (deformações da ordem de 10-4-10-5)^8,9.

A aplicação mais estabelecida da OCE até agora é na área biomédica, onde a técnica tem sido aplicada para caracterizar tecidos biológicos que requerem apenas acesso óptico superficial. Por exemplo, Li e col. utilizaram a OCE para caracterizar as propriedades elásticas do tecido cutâneo¹⁰. Outros autores caracterizaram as propriedades elásticas anisotrópicas dos tecidos corneanos suínos e humanos e como eles são afetados pela pressão intraocular 11,12,13,14,15,16. Algumas vantagens do método OCE para o estudo de biofilmes são que ele não é destrutivo e fornece resolução espacial de mesoescala, não requer nenhum preparo de amostra e o método em si é rápido; Ele fornece medidas co-registradas da estrutura física e propriedades elásticas (por exemplo, porosidade, rugosidade superficial e morfologia)8,9,17,18.

O método OCE mede o deslocamento local de propagação de ondas elásticas em um espécime usando tomografia de coerência óptica (OCT) sensível à fase. OCT é um interferômetro óptico de baixa coerência que transforma mudanças locais no deslocamento da amostra em uma mudança de intensidade que é registrada com um espectrômetro óptico. A técnica de OCT também tem sido utilizada em pesquisas de biofilmes para caracterização da estrutura de mesoescala, distribuição de porosidade em três dimensões e deformação do biofilme17,19,20,21. Além disso, Picioreanu e col. estimaram propriedades mecânicas do biofilme usando a modelagem inversa da interação fluido-estrutura de imagens de deformação transversal da OCT²².

Por outro lado, as medidas de OCE, juntamente com a modelagem de onda elastodinâmica inversa, fornecem a velocidade de onda das ondas elásticas na amostra, o que permite a caracterização das propriedades elásticas e viscoelásticas da amostra. Nosso grupo adaptou a técnica OCE para mensuração quantitativa das propriedades elásticas e viscoelásticas do biofilme ^8,9,18 e validou a técnica contra medidas de reometria de cisalhamento em amostras de placa gel de agarose¹⁸. A abordagem OCE fornece estimativas precisas e confiáveis das propriedades do biofilme, uma vez que a velocidade de onda elástica medida está correlacionada com as propriedades elásticas da amostra. Além disso, o decaimento espacial da amplitude da onda elástica pode ser diretamente correlacionado com as propriedades viscoelásticas devido aos efeitos viscosos no material. Nós relatamos medidas OCE de propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos de cultura mista cultivados em um reator anular rotativo (RAR) e biofilmes granulares com geometrias complexas usando modelos de ondas elastodinâmicas¹⁸.

A técnica OCE também é uma alternativa poderosa à reometria^{tradicional18}, que é utilizada para caracterização viscoelástica. Os métodos de reometria são mais adequados para amostras com geometria plana. Dessa forma, biofilmes granulares, que apresentam formas e morfologias superficiais arbitrárias, não podem ser caracterizados com precisão em um reômetro ^8,23. Além disso, ao contrário da OCE, os métodos de reometria podem ser difíceis de adaptar para medidas em tempo real, por exemplo, durante o crescimento de biofilme em células de fluxo^24,25.

Neste artigo, mostramos que as medidas OCE da velocidade de onda independente da frequência das ondas de superfície podem ser usadas para caracterizar as propriedades elásticas do biofilme sem a necessidade de modelos complicados. Este desenvolvimento tornará a abordagem OCE mais acessível à comunidade mais ampla de biofilmes para o estudo das propriedades mecânicas do biofilme.

A Figura 1 mostra uma ilustração esquemática do sistema de OCT utilizado neste estudo. O sistema incorpora vários instrumentos, incluindo um sistema OCT comercial sensível à fase no domínio espectral, um gerador de atraso, um gerador de função e um transdutor piezoelétrico. O sistema OCT opera com o princípio da interferometria empregando uma fonte de luz de banda larga com um comprimento de onda central de 930 nm. A intensidade luminosa coletada, que está correlacionada com detalhes estruturais intrincados na amostra, é analisada na unidade de pós-processamento e, em seguida, convertida em uma imagem transversal da amostra – comumente referida como uma imagem de OCT. A profundidade da OCT depende da gravidade do espalhamento óptico na amostra, que decorre da variação local no índice de refração e é limitada a 1-3 mm em tecidos biológicos e biofilmes. Como a fase óptica na amostra e a intensidade da interferência são moduladas pelo movimento, a OCT pode ser usada para detectar o deslocamento local da amostra. Aproveitamos a sensibilidade de deslocamento da OCT no método OCE para rastrear o campo de deslocamento em estado estacionário das ondas elásticas na amostra. Especificamente, o gerador de função emite uma tensão senoidal para acionar o transdutor piezoelétrico. O transdutor, por sua vez, se alonga e contrai com um histórico de tempo oscilante. O deslocamento oscilatório do transdutor confere uma força senoidal na superfície da amostra através de uma ponta de cunha impressa em 3D no ápice do transdutor, levando à geração de ondas elásticas harmônicas na amostra. A ponta da cunha faz contato leve com a amostra, de modo que a amostra permanece intacta depois que o atuador é retraído da superfície da amostra. Para registrar o deslocamento local na amostra, varreduras de profundidade adjacentes separadas por um atraso de tempo fixo são adquiridas em cada pixel da amostra. A diferença de fase óptica entre varreduras consecutivas em cada ponto de pixel é proporcional ao deslocamento vertical local no mesmo ponto. A sincronização entre o deslocamento do transdutor e a óptica de varredura no sistema OCT é obtida através de um pulso de disparo que se origina do gerador de função e é retardado no gerador de atraso. Esta etapa de sincronização facilita a aquisição de imagens transversais consistentes da distribuição de fase óptica local na amostra. Essas imagens são diretamente proporcionais ao deslocamento harmônico vertical local na amostra e são conhecidas como imagem OCE. As imagens OCE são adquiridas em diferentes frequências de atuação do transdutor para obter o comprimento de onda elástico e a velocidade de onda em função da frequência. As velocidades de onda medidas são analisadas com um modelo elastodinâmico para determinar as propriedades elásticas da amostra.