הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

אימונופלואורסנציה היא טכניקת אבן פינה בביולוגיה התאית המודרנית שפותחה במקור על ידי אלברט קונס, המאפשרת זיהוי מולקולות בתאי התא הטבעיים שלהן ואפיון ההרכבים המולקולריים של אברונים תת-תאיים או מכונות¹. יחד עם מניפולציות גנטיות, immunofluorescence מסייע לבסס את הרעיון המקובל כיום כי לוקליזציה של חלבונים חיונית לתפקודו². מלבד נוגדנים ראשוניים ספציפיים וצבעים פלואורסצנטיים בהירים, הצלחתה של טכניקה זו נשענת על תהליך מקדים בשם קיבוע וחדירה, המשמר מורפולוגיות תאיות, משתק אנטיגנים ומגביר את נגישות הנוגדנים למדורים תוך תאיים. באופן בלתי נמנע, תהליך הקיבוע והחדירה יהרוג תאים ויסיים את כל התהליכים הביולוגיים³. לכן, immunofluorescence רק מספק תמונות של מסע החיים של חלבונים. עם זאת, תהליכים ביולוגיים רבים כגון נדידת תאים וחלוקות הם דינמיים באופיים, ודורשים חקירה של התנהגויות חלבונים באופן מרחבי-זמני ^4,5.

כדי לבחון דינמיקה של חלבונים באורגניזמים חיים, פותחו שיטות הדמיה חיות המבוססות על חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)⁶ ומיקרוסקופ קונפוקלי מהיר. בקצרה, ניתן לבצע מניפולציה גנטית של החלבון המעניין כדי להתיך אותו עם GFP⁷, ולאחר מכן לבטא אותו באופן אקטופי ממקדמי נגיפים או שמרים כגון ציטומגלווירוס (CMV)⁸ או רצף הפעלה במעלה הזרם (UAS)⁹. מכיוון ש-GFP הוא אוטופלואורסצנטי בטבעו, אין צורך בנוגדנים מצומדים לפלואורופור כדי לחשוף את הלוקליזציה של חלבוני המטרה, מה שעוקף את הצורך בתהליכים מקדימים של קיבוע או חלחול. במהלך שני העשורים^{האחרונים פותחו} תגים פלואורסצנטיים המשתרעים על פני כל ספקטרום אורך הגל, המאפשרים הדמיה חיה מרובת צבעים של מספר חלבוני מטרה בו זמנית. עם זאת, בהשוואה לצבעים פלואורסצנטיים מהונדסים כימית כגון AlexaFluor או ATTO, האוטופלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית אלה חלשה יחסית ובלתי יציבה כאשר היא באה לידי ביטוי ממקדמים אנדוגניים, במיוחד במהלך הדמיה חיה על פני טווחי זמן ארוכים יותר¹⁰. בעוד שניתן למתן את המחסור הזה על ידי ביטוי יתר של חלבוני מטרה המתויגים באופן פלואורסצנטי, רבים מהם עם פעילויות אנזימטיות כגון קינאזות ופוספטזות משבשים באופן חמור תהליכים ביולוגיים נורמליים אם אינם באים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות.

פרוטוקול זה מציג שיטה המאפשרת הארה של מטרות מבוססות נוגדנים במערך תמונה חיה, ולמעשה מאפשרת אימונופלואורסצנטיות ללא תהליך של קיבוע או חדירה (איור 1). באמצעות תגובת אמין ראשונית^{פשוטה מבוססת NHS 11}, ניתן להצמיד צבעים פלואורסצנטיים כגון AlexaFluor 488 או 594 עם כל נוגדן ראשוני או GFP/HA/Myc nanobody¹². תוך ניצול תכונה התפתחותית שכל התאים העובריים של דרוזופילה חולקים ציטופלסמה משותפת בשלב^{הסינקיטיום 13}, ניתן להשיג קשירה והארה של אנטיגן על פני עוברים שלמים לאחר הזרקת נוגדנים מצומדים. עם הרחבת ספריות של חלבונים מתויגים אנדוגניים הזמינים בדרוזופילה ובמערכות מודל אחרות¹⁴, שיטה זו יכולה להרחיב את היישומים של ספריות אלה על ידי חשיפת דינמיקה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית בשפע נמוך וחלבונים אחרים שאינם מתויגים פלואורסצנטית (HA/Myc-tagged) ברקמות חיות.