Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.
Abstract
Die Visualisierung von Proteinen in lebenden Zellen mit GFP (Green Fluorescent Protein) und anderen fluoreszierenden Markierungen hat das Verständnis der Lokalisierung, Dynamik und Funktion von Proteinen erheblich verbessert. Im Vergleich zur Immunfluoreszenz spiegelt die Live-Bildgebung die Proteinlokalisierung genauer wider, ohne dass potenzielle Artefakte durch die Gewebefixierung entstehen. Wichtig ist, dass die Live-Bildgebung eine quantitative und zeitliche Charakterisierung von Proteinspiegeln und -lokalisierungen ermöglicht, was für das Verständnis dynamischer biologischer Prozesse wie Zellbewegung oder -teilung entscheidend ist. Eine wesentliche Einschränkung von Fluoreszenz-Markierungsansätzen ist jedoch die Notwendigkeit einer ausreichend hohen Proteinexpression, um eine erfolgreiche Visualisierung zu erreichen. Folglich können viele endogen markierte fluoreszierende Proteine mit relativ geringer Expression nicht nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite kann die ektopische Expression mit viralen Promotoren manchmal zu Proteinfehllokalisationen oder funktionellen Veränderungen in physiologischen Kontexten führen. Um diese Einschränkungen zu adressieren, wird ein Ansatz vorgestellt, der einen hochempfindlichen Antikörper-vermittelten Proteinnachweis in lebenden Embryonen verwendet, der im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne Gewebefixierung durchführt. Als Proof of Principle kann ein endogen GFP-markierter Notch-Rezeptor, der in lebenden Embryonen kaum nachweisbar ist, nach Antikörperinjektion erfolgreich sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz angepasst, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) in lebenden Embryonen sichtbar zu machen, was die Detektion zeitlicher Veränderungen der Tyrosinphosphorylierungsmuster während der frühen Embryogenese ermöglicht und eine neue Subpopulation von Phosphotyrosin (p-Tyr) unter apikalen Membranen aufdeckt. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um andere proteinspezifische, tagspezifische oder PTM-spezifische Antikörper aufzunehmen, und sollte mit anderen injektionsfähigen Modellorganismen oder Zelllinien kompatibel sein. Dieses Protokoll eröffnet neue Möglichkeiten für die Live-Bildgebung von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder PTMs, die bisher mit herkömmlichen Fluoreszenz-Markierungsmethoden nur schwer zu erkennen waren.
Introduction
Die Immunfluoreszenz ist eine Grundtechnik der modernen Zellbiologie, die ursprünglich von Albert Coons entwickelt wurde und die Detektion von Molekülen in ihren nativen zellulären Kompartimenten und die Charakterisierung der molekularen Zusammensetzung von subzellulären Organellen oder Maschinen ermöglicht1. In Verbindung mit genetischen Manipulationen trägt die Immunfluoreszenz dazu bei, das heute allgemein akzeptierte Konzept zu etablieren, dass die Lokalisierung von Proteinen für ihre Funktion unerlässlich ist2. Abgesehen von spezifischen Primärantikörpern und hellen Fluoreszenzfarbstoffen beruht der Erfolg dieser Technik auf einem vorläufigen Prozess namens Fixierung und Permeabilisierung, der zelluläre Morphologien bewahrt, Antigene immobilisiert und die Zugänglichkeit von Antikörpern in intrazelluläre Kompartimente erhöht. Der Fixierungs- und Permeabilisierungsprozess würde unweigerlich Zellen abtöten und alle biologischen Prozesse beenden3. Daher liefert die Immunfluoreszenz nur Momentaufnahmen des Lebenswegs von Proteinen. Viele biologische Prozesse, wie z.B. Zellmigration und Zellteilungen, sind jedoch dynamischer Natur und erfordern eine räumlich-zeitlich aufgelöste Untersuchung des Verhaltens von Proteinen 4,5.
Um die Proteindynamik in lebenden Organismen zu untersuchen, wurden Live-Imaging-Methoden entwickelt, die auf genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen wie dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)6 basieren, und konfokale Hochgeschwindigkeitsmikroskope. Kurz gesagt, das interessierende Protein kann genetisch so manipuliert werden, dass es mit GFP7 fusioniert wird, und dann ektopisch aus viralen oder Hefepromotoren wie dem Cytomegalievirus (CMV)8 oder der Upstream-Aktivierungssequenz (UAS)9 exprimiert werden. Da GFP von Natur aus autofluoreszierend ist, sind keine Fluorophor-gekoppelten Antikörper erforderlich, um die Lokalisierung von Zielproteinen aufzudecken, wodurch die Notwendigkeit vorbereitender Prozesse der Fixierung oder Permeabilisierung umgangen wird. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden fluoreszierende Markierungen entwickelt, die das gesamte Wellenlängenspektrum abdecken10 und eine mehrfarbige Live-Bildgebung mehrerer Zielproteine gleichzeitig ermöglichen. Im Vergleich zu chemisch hergestellten Fluoreszenzfarbstoffen wie AlexaFluor oder ATTO ist die Autofluoreszenz dieser genetisch kodierten fluoreszierenden Proteine jedoch relativ schwach und instabil, wenn sie von endogenen Promotoren exprimiert werden, insbesondere während der Live-Bildgebung über längere Zeitskalen10. Während dieses Defizit durch die Überexpression fluoreszenzmarkierter Zielproteine gemildert werden kann, stören viele mit enzymatischen Aktivitäten wie Kinasen und Phosphatasen normale biologische Prozesse erheblich, wenn sie nicht auf physiologischem Niveau exprimiert werden.
Dieses Protokoll stellt eine Methode dar, die eine photostabile antikörperbasierte Zielbeleuchtung in einem Live-Bildaufbau ermöglicht, die im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne den Prozess der Fixierung oder Permeabilisierung ermöglicht (Abbildung 1). Durch eine einfache NHS-basierte primäre Aminreaktion11 kann man Fluoreszenzfarbstoffe wie AlexaFluor 488 oder 594 mit im Wesentlichen jedem primären Antikörper oder GFP/HA/Myc-Nanobody12 konjugieren. Unter Ausnutzung eines Entwicklungsmerkmals, dass alle embryonalen Zellen von Drosophila während des Synzytiumstadiums13 ein gemeinsames Zytoplasma teilen, kann man nach der Injektion von farbstoffkonjugierten Antikörpern eine Antigenbindung und Beleuchtung über ganze Embryonen erreichen. Mit der Erweiterung von Bibliotheken endogen markierter Proteine, die in Drosophila und anderen Modellsystemen verfügbar sind14, kann diese Methode die Anwendungen dieser Bibliotheken möglicherweise erweitern, indem sie die Dynamik von fluoreszenzmarkierten Proteinen mit geringer Häufigkeit und anderen nicht-fluoreszenzmarkierten Proteinen (HA/Myc-markierten) Proteinen in lebenden Geweben aufdeckt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses vorgestellte Verfahren beschreibt die spezielle Methode der Fluoreszenzmarkierung mit maßgeschneiderten Antikörpern und der anschließenden Injektion in Drosophila-Embryonen im Frühstadium. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung von Proteinen oder posttranslationalen Modifikationen, die in geringen Mengen vorliegen und mit herkömmlichen GFP/mCherry-Markierungsmethoden typischerweise nur schwer zu beobachten sind.
Vorsicht ist geboten, wenn diese Methode erwei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Jennifer A. Zallen für die Bereitstellung der Sqh-GFP Drosophila-Linie und die Unterstützung bei der ersten Entwicklung dieser Technik sowie Dr. Francois Schweisguth für die Bereitstellung der Notch-GFP Drosophila-Linie . Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32270809) an S.H.Yu, großzügiger finanzieller und personeller Unterstützung von der School of Life Sciences, SUSTech, und von Y. Yan von der Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722 unterstützt.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Referências
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