通过荧光抗体注射观察活果蝇胚胎中的低丰度蛋白质和翻译后修饰

免疫荧光是现代细胞生物学的一项基石技术，最初由 Albert Coons 开发，它能够检测其天然细胞区室的分子并表征亚细胞器或机器的分子组成¹。结合基因操作，免疫荧光有助于建立现在广为接受的概念，即蛋白质定位对其功能至关重要²。除了特异性一抗和明亮的荧光染料外，该技术的成功还依赖于称为固定和透化的初步过程，该过程保留了细胞形态，固定了抗原，并增加了抗体进入细胞内区室的可及性。不可避免地，固定和透化过程会杀死细胞并终止所有生物过程³.因此，免疫荧光仅提供蛋白质生命旅程的快照。然而，许多生物过程（如细胞迁移和分裂）本质上是动态的，需要以时空分辨的方式研究蛋白质行为^4,5。

为了研究生物体中的蛋白质动力学，已经开发了基于基因编码荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 （GFP）⁶ 和高速共聚焦显微镜）的实时成像方法。简而言之，目标蛋白可以通过基因操作与GFP⁷融合，然后从病毒或酵母启动子（如巨细胞病毒（CMV）⁸ 或上游激活序列（UAS）⁹）异位表达。由于GFP本质上是自发荧光的，因此不需要荧光团偶联抗体来揭示靶蛋白的定位，从而绕过了固定或透化的初步过程的必要性。在过去的二十年中，已经开发了跨越整个波长光谱的荧光标签¹⁰，可以同时对多种靶蛋白进行多色实时成像。然而，与化学工程荧光染料（如AlexaFluor或ATTO）相比，这些基因编码的荧光蛋白的自发荧光在内源性启动子表达时相对较弱且不稳定，特别是在较长时间尺度的实时成像^期间10。虽然这种不足可以通过过度表达荧光标记的靶蛋白来缓解，但许多具有酶活性的蛋白（如激酶和磷酸酶）如果不在生理水平上表达，会严重破坏正常的生物过程。

该协议提出了一种在实时图像设置中实现基于光稳定抗体的靶标照明的方法，基本上允许免疫荧光，而无需固定或透化过程（图1）。通过简单的基于 NHS 的伯胺反应¹¹，可以将荧光染料（如 AlexaFluor 488 或 594）与基本上任何一抗或 GFP/HA/Myc 纳米抗体¹² 偶联。利用所有 果蝇 胚胎细胞^{在第 13} 阶段共享共同细胞质的发育特征，可以在注射染料偶联抗体后实现整个胚胎的抗原结合和照明。随着 果蝇 和其他模型系统¹⁴中可用的内源性标记蛋白库的扩展，该方法可以通过揭示活组织中低丰度荧光标记蛋白和其他非荧光标记（HA/Myc标记）蛋白的动力学来潜在地扩大这些文库的应用。