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Biologia

Un système de culture hépatique entièrement humain pour des applications de développement de médicaments

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65992
, , , , ,
1Institute of Regenerative Medicine,LifeNet Health, 2Biologics Division,LifeNet Health, 3LifeSciences Division,LifeNet Health, 4Research and Development,LifeSciences, LifeNet Health

Summary

Les progrès techniques récents ont permis la production à grande échelle d’une plate-forme in vitro pour le métabolisme des médicaments et les applications de toxicité. Un système hépatique 2D+ entièrement humain (TV2D+) fournit des résultats physiologiquement pertinents en utilisant des méthodes de culture bidimensionnelles traditionnelles. Ce protocole assistera les utilisateurs finaux dans la configuration, la maintenance et l’application du système.

Abstract

La recherche d’un modèle de culture à long terme et pertinent pour l’homme pour les hépatocytes humains primaires (PHH) pour les études pharmacologiques et toxicologiques reste un défi. Les plates-formes modèles in vitro actuelles sont souvent peu pratiques et complexes, manquent de stabilité phénotypique dans le temps et ne prennent pas en charge plusieurs lots de PHH, manquant de reproductibilité expérimentale et de flexibilité. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la décongélation, le placage et la maintenance d’un système hépatique 2D+ entièrement humain (TV2D+), qui tire parti des techniques et des équipements de culture bidimensionnels (2D) standard tout en maintenant la longévité et la stabilité phénotypique dans le temps qui accompagnent généralement les systèmes tridimensionnels (3D) plus complexes. Les résultats montrent l’attachement et le pourcentage de plaqueabilité dans TV2D+ en fonction de la densité de semis de PHH, ainsi qu’une fonctionnalité stable pendant au moins 2 semaines en culture. Une gamme de densités de semis de PHH est évaluée afin d’obtenir une culture réussie à long terme. Lorsqu’ils sont correctement établis, les PHH de TV2D+ s’organisent en colonies hépatocytes, expriment un marqueur hépatique spécifique et maintiennent la viabilité, l’intégrité architecturale et des niveaux physiologiquement pertinents d’albumine et d’urée. Cette combinaison unique d’attributs fait du système TV2D+ un modèle hépatique approprié pour une variété d’applications pharmacologiques et toxicologiques.

Introduction

La prédiction de l’innocuité et de l’efficacité thérapeutiques est une partie importante du développement préclinique de médicaments. Cependant, les modèles hépatiques in vitro précliniques conventionnels sont limités dans leur capacité à imiter avec précision le microenvironnement cellulaire hépatique in vivo et à maintenir la fonctionnalité et la morphologie des hépatocytes au fil du temps. Il est nécessaire de disposer de modèles qui fournissent une compétence métabolique stable pendant plus d’une semaine pour évaluer les composés à renouvellement lent ou étudier les résultats associés à une exposition subaiguë ou chronique. Les tests in vivo sur les animaux échouent souvent à prédire l’efficacité et le risque des médicaments en raison des différences translationnelles entre les espèces dans les mécanismes de clairance hépatique humaine1. Les modèles hépatiques in vitro actuels en 2 dimensions (2D), tels que la monoculture traditionnelle d’hépatocytes humains primaires (PHH) ou les cultures sandwich, manquent de stabilité phénotypique et de longévité en culture, ce qui entraîne une perte de la fonction hépatocellulaire clé et de l’intégrité architecturale au fil du temps2. Une méthode alternative implique la formation de sphéroïdes hépatocytes tridimensionnels (3D), offrant un microenvironnement plus pertinent par rapport à la culture 2D. Cependant, cette méthode est limitée par la disponibilité des matières premières, la sélection des lots donneurs de PHH, la reproductibilité et la perte de viabilité avec l’augmentation de la taille des sphéroïdes 3,4,5,6. Des plates-formes multicellulaires ont été introduites dans lesquelles les PHH sont ensemencés avec des cellules nourricières sur des plaques de taille fixe et à micromotifs. Bien que ces modèles puissent permettre des temps de culture plus longs, les cellules nourricières non humaines utilisées dans ces plates-formes peuvent altérer les résultats expérimentaux et limiter leur application en raison de la contribution innée de fond à la clairance des médicaments et aux profils métaboliques 1,7. Le système hépatique 2D+ (TV2D+) entièrement humain TruVivo récemment décrit dans Weaver, et al8, a été développé pour remédier à certaines des limites des méthodes traditionnelles, de co-culture et de culture 3D des PHH. Les cellules non hépatiques réduisent les différences interspécifiques dans le métabolisme et la production de paracrines et fournissent le soutien nécessaire aux hépatocytes primaires d’une manière reproductible et robuste qui ne peut pas être fournie par les cellules hépatiques non parenchymateuses correspondantes d’un seul lot donneur en raison de limitations d’expansion, de phénotype et de performance. Les cellules nourricières choisies ont pu être constamment étendues avant utilisation et n’ont pas besoin de transformation ou de différenciation. Comme l’ont décrit Glicklis et al.4 et Khetani et al.5, les modèles de culture 3D tels que les sphéroïdes hépatocytes présentent des problèmes de reproductibilité en raison de la variabilité du donneur et du maintien de la cohérence de la taille des sphéroïdes, ce qui affecte la diffusion des nutriments dans les sphéroïdes supérieurs à 200 μm, entraînant une diminution de la viabilité et de la fonctionnalité. À l’instar de la formation de sphéroïdes 3D, le système TV2D+ repose sur l’auto-assemblage des PHH ; cependant, les colonies de PHH formées sont dispersées sur la surface du puits à une seule cellule de profondeur plutôt que compactées en un seul agrégat. Cette méthode de culture peut être utile pour tenir compte de la variabilité des donneurs, ce qui permet de plaquer les PHH, de les mettre en culture et de maintenir leur fonctionnalité de base à différentes densités de semis. Le système TV2D+ peut également augmenter la robustesse de la manipulation par l’utilisateur en raison de la perte lors de la manipulation ou de l’équipement spécialisé nécessaire pour effectuer une culture prolongée dans des sphéroïdes 3D.

Le système TV2D+ combine la culture 2D standard avec la longévité et la stabilité phénotypique qui accompagnent généralement les systèmes 3D. Le protocole décrit dans le présent document fournit des instructions étape par étape aux utilisateurs ayant des compétences de base en culture tissulaire dans les laboratoires équipés d’équipements standard tels que des postes de sécurité biologique, des centrifugeuses et des incubateurs de CO2 . Chaque étape du processus est décrite en détail, y compris la préparation du milieu, la décongélation, le placage et l’entretien du système de culture résultant. Le protocole contient également une méthode pour déterminer la fonctionnalité de base des hépatocytes, l’albumine et l’urée, ainsi qu’une analyse d’image immunofluorescente pour déterminer la fixation de l’HPH pour la normalisation. Lorsqu’ils sont correctement établis, les PHH de TV2D+ s’organisent en colonies hépatocytes, imitant la morphologie hépatique native, et maintiennent une viabilité prolongée, une intégrité architecturale et des niveaux physiologiquement pertinents d’albumine et d’urée pendant au moins 2 semaines8. Étant donné que le système peut permettre une gamme de densités de semis de PHH, il peut être utile d’accroître la disponibilité de lots de PHH moins plaqueables qui présentent des caractéristiques de donneurs souhaitables. Cette combinaison d’accessibilité et de fonctionnalité fait de TV2D+ un modèle hépatique adapté à une variété d’applications pharmacologiques et toxicologiques.

Protocol

Ce protocole suit les directives du comité d’éthique de Lifenet Health. Le manuscrit ne contient pas d’études avec des participants humains ou d’études animales réalisées par l’un des auteurs. Toutes les cellules ont été isolées à partir de tissus de donneurs pleinement consentis à des fins de recherche par Lifenet Health. 1. Préparation moyenne Décongeler un flacon par cellule nourricière, le supplément A, le supplément B et le supplément C (voir le tableau des matériaux) au bain-marie à 37 °C ou 16-24 h à 4 °C. Aliquote le flacon entier (10 ml) de milieu de décongélation de la cellule nourricière dans un tube conique de 15 mL ou 50 mL.REMARQUE : La taille de la pastille cellulaire sera plus facile à voir à l’aide d’un tube conique de 15 ml. Ajouter 4,5 mL de supplément B et 11 mL de supplément A à une bouteille de médium à plaquer (75 ml) (voir le tableau des matériaux) pour obtenir un médium à assiette complet.REMARQUE : Le milieu de placage complet a une concentration de FBS <5% v/v. Dans un flacon séparé, ajoutez 100 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux), 1 mL de supplément C et 14 mL de supplément A pour obtenir un milieu de culture complet.NOTA : Le milieu de culture complet a une concentration de FBS <1 % v/v Conserver le reste du supplément C et du supplément A à -20 °C jusqu’à la préparation moyenne de la semaine 2.REMARQUE : Des cycles de gel-dégel répétés réduiront la durée de conservation des suppléments. Il est recommandé de ne geler-décongeler qu’une seule fois. Avant utilisation, réchauffer 10 mL de milieu de décongélation de cellules nourricières, de milieu de décongélation hépatocytaire, de milieu de placage complet et de milieu de culture complet pendant 20 à 30 minutes au bain-marie à 37 °C. 2. Décongélation, comptage et placage des cellules nourricières humaines (figure 1A) Cultivez les cellules nourricières environ 1 h avant l’ensemencement des PHH. Décongelez les cellules nourricières (voir le tableau des matériaux) dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes.REMARQUE : Éviter une exposition prolongée (p. ex., >2 min) en surveillant la décongélation et en retirant le flacon lorsque le liquide se détache dans le flacon cryogénique lorsqu’il est retourné. Immédiatement après la décongélation, placez les cellules nourricières sur de la glace. À l’aide de techniques aseptiques, dans une enceinte de sécurité biologique (ESB), ajouter des cellules fraîchement décongelées à 10 mL de milieu de décongélation de cellules nourricières. À l’aide d’une pipette de 1000 μL, laver le flacon une fois avec 1 mL de suspension de milieu cellulaire/décongélation et prélever. Essorer à 400 x g pendant 4 min à température ambiante (RT). Jeter soigneusement le surnageant pour ne pas perturber la pastille cellulaire par pipetage ou aspiration sous vide. Remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 1 mL de milieu de placage complet et compter les cellules nourricières.REMARQUE : Les cellules nourricières peuvent être comptées à l’aide d’orange acridine et d’iodure de propidium (AOPI) sur un compteur cellulaire automatisé ou de bleu trypan à l’aide d’un hémacytomètre. Le nombre de cellules peut varier en fonction de la technologie et de l’utilisateur. Pour de meilleurs résultats, comptez les échantillons en double et restez cohérent dans la méthodologie choisie. Diluer la suspension cellulaire à 100 000 cellules/mL à l’aide du milieu de placage complet. Plaquer 500 μL (50 000 cellules) par puits de la suspension cellulaire diluée sur une plaque à 24 puits recouverte de collagène (voir le tableau des matériaux). Secouez la plaque dans un mouvement Nord (N)-Sud (S)-Est (E)-Ouest (W) en utilisant un mouvement de va-et-vient dans la direction N-S 2 fois suivi du même mouvement E-W. Répétez ce protocole d’agitation 2 fois de plus pour un total de 3 tours.REMARQUE : Secouez en utilisant une force modérée pour éviter les éclaboussures sur le couvercle de la plaque tout en aidant à la distribution des cellules (veuillez vous référer à la vidéo). Incuber à 37 °C/5 % CO2 pendant 60 min. Visualisez l’attachement des cellules nourricières avant de procéder à la décongélation des hépatocytes.NOTA : L’attachement acceptable des cellules nourricières est visuellement confluent à environ 50 %. 3. Décongélation, comptage et placage des hépatocytes humains primaires (Figure 1B) Après 30 minutes de culture de cellules nourricières, filtrer le milieu de décongélation des hépatocytes préchauffé à travers une unité de filtration en polyéthersulfone (PES) de 0,2 μm. Décongeler les PHH dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes.REMARQUE : Éviter une exposition prolongée (p. ex., >2 min) en surveillant la décongélation et en retirant le flacon lorsque le liquide se détache dans le flacon cryogénique lorsqu’il est retourné. Immédiatement après la décongélation, placez les PHH sur de la glace. Dans un BSC, verser la suspension PHH dans le milieu de décongélation hépatocytaire.REMARQUE : Évitez de pipeter les suspensions de cellules PHH dans la mesure du possible. Il est très important de ne pas effectuer de pipetage pendant le transfert des PHH décongelés du milieu cryogénique au milieu de décongélation. À l’aide d’une pipette de 1000 μL, laver le flacon 3 à 4 fois en pipetant doucement 1 mL de suspension de milieu hépatocytaire/décongelant dans le flacon et en recueillant le produit de lavage en le versant dans le milieu de décongélation. Boucher et retourner délicatement la suspension PHH décongelée 5 fois. Tourner à 100 x g pendant 8 min à RT. Jeter soigneusement le surnageant pour ne pas perturber la pastille cellulaire par pipetage ou aspiration sous vide. Sur la paroi du tube conique, ajouter 3 mL de médium de placage complet. Basculez le tube conique d’un côté à l’autre pour remettre en suspension la pastille cellulaire. Ajouter 5 mL supplémentaires de milieu de placage complet aux hépatocytes remis en suspension. Comptez les PHH.REMARQUE : Les PHH peuvent être comptés à l’aide de l’AOPI sur un compteur de cellules automatisé ou du bleu trypan à l’aide d’un hémacytomètre. Le nombre de cellules peut varier en fonction de la technologie et de l’utilisateur. Pour de meilleurs résultats, comptez les échantillons en double et restez cohérent dans la méthodologie choisie. Diluer la suspension cellulaire à la densité de semis désirée (300 000-600 000 PHHs/mL) à l’aide du milieu de placage complet.REMARQUE : La densité optimale de semis des hépatocytes peut varier d’un lot à l’autre. La densité de semis recommandée pour un lot donné sera fournie dans le certificat d’analyse (COA). Utilisez l’équation ci-dessous pour déterminer les hépatocytes/mL pour une plaque à 24 puits. Des cellules d’alimentation plaquées, retirez le milieu par pipetage ou aspiration sous vide.REMARQUE : Pour assurer la viabilité des cellules d’alimentation, il est recommandé de ne pas changer plus de 3 puits à la fois. Plaquer immédiatement 500 μL (150 000 à 300 000 cellules) par puits de la suspension hépatocytaire diluée sur la plaque de collagène pré-enrobée à 24 puits contenant des cellules nourricières. Secouez la plaque dans un mouvement N-S-E-W en utilisant un mouvement de va-et-vient dans la direction N-S 2 fois suivi du même mouvement E-W. Répétez ce protocole d’agitation 2 fois de plus pour un total de 3 tours.REMARQUE : Secouez en utilisant une force modérée pour éviter les éclaboussures sur le couvercle de la plaque tout en aidant à la distribution des cellules. Incuber à 37 °C/5 % de CO2 pendant 2 à 4 h. Pendant les 60 premières minutes de culture, secouez la plaque toutes les 15 minutes en mouvement N-S-E-W comme à l’étape 3.15 ci-dessus. Après l’incubation, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la dans la BSC. Secouez la plaque et retirez le milieu de placage complet par pipetage ou aspiration sous vide.REMARQUE : Pour assurer la viabilité de la culture, il est recommandé de ne pas changer plus de 3 puits à la fois. Ajouter immédiatement 500 μL de milieu de culture complet préchauffé dans chaque puits. 4. Entretien Aliquote et préchauffer le milieu de culture complet au bain-marie à 37 °C pendant 20 à 30 min. Environ 13,5 mL de milieu sont nécessaires pour une plaque de 24 puits. Nourrir les cultures quotidiennement avec 500 μL par puits de milieu de culture complet frais et préchauffé.REMARQUE : Pour assurer la viabilité de la culture, il est recommandé de ne pas changer plus de 3 puits à la fois. Préparez un milieu de culture complet frais tous les 7 jours. 5. Prélèvement d’échantillons de surnageant de culture pour la mesure de l’albumine et de l’urée Aux jours 7, 10 et 14, prélever 500 μL de milieu dans le ou les puits d’échantillonnage souhaités dans un ou plusieurs tubes de microcentrifugation, comme le montre la figure 1C. Essorer l’échantillon à 320 x g pendant 10 min à 4 °C jusqu’à ce qu’il obtienne des débris. À l’aide d’une pipette, transférez le ou les surnageants de l’échantillon dans un ou plusieurs nouveaux tubes de microcentrifugation, en évitant de perturber la pastille. Effectuer les prélèvements sur le dosage de l’albumine et/ou de l’urée (voir rubriques 10 et 11, respectivement).REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés entre -20 °C et -80 °C pendant 2 semaines. 6. Jour de coloration I ATTENTION : Le tampon de fixation contient du paraformaldéhyde. Le paraformaldéhyde peut causer des lésions oculaires, une irritation de la peau et une toxicité pour les organes. Travaillez dans un endroit bien ventilé et portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié. Après le prélèvement d’échantillons de milieu au jour 14, ajouter 300 μL de tampon de fixation (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits à colorer, comme le montre la figure 1C. Teindre un minimum de 2 puits. Incuber à 4 °C pendant 20-60 min. Préparer 1x tampon de perméabilisation (voir le tableau des matériaux) en ajoutant 5 mL de solution mère 10x à 45 mL de PBS 1x (voir le tableau des matériaux).REMARQUE : Le tampon de perméabilisation 1x peut être stocké à 4° C pendant 1 mois. Laver 2 fois avec 300 μL de tampon de perméabilisation 1x sur glace. Ajouter 300 μL d’anticorps primaire, la cytokératine 18 (voir le tableau des matériaux) en utilisant une dilution de 1 :1000 dans 1x tampon de perméabilisation sur glace.REMARQUE : Au minimum, incuber un puits avec un tampon de perméabilisation 1x uniquement pour un contrôle secondaire des anticorps uniquement. Incuber 16-24 h à 4 °C. 7. Jour de coloration II Le lendemain, retirez l’anticorps primaire par pipetage ou aspiration intra-utérine. Laver 2 fois avec 300 μL par puits de 1x tampon de perméabilisation sur glace. Ajouter 300 μL d’anticorps secondaire fluorescent (voir le tableau des matériaux) en utilisant une dilution de 1 :500 dans un tampon de perméabilisation 1x (inclure le contrôle secondaire uniquement).REMARQUE : Évitez la lumière lors de l’utilisation d’anticorps fluorescents. Incuber pendant 30-45 min à 4 °C dans l’obscurité. Retirer l’anticorps secondaire par pipetage ou aspiration intra-utérine. Laver 2 fois avec 300 μL par puits de 1x tampon de perméabilisation sur glace. Laver 1 fois avec 300 μL par puits de 1x PBS. Ajouter 150 μL de milieu de montage 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber pendant 15 minutes à RT dans l’obscurité.REMARQUE : La plaque peut être enveloppée dans du parafilm et conservée à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 semaine. Vue au microscope fluorescent. Capturez 5 images de chaque canal fluorescent spécifique pour chaque puits à l’aide de l’objectif 10x (assurez-vous qu’une image a une barre d’échelle).REMARQUE : Le DAPI a une excitation/émission de 358 nm/461 nm. Utiliser un microscope à fluorescence équipé des filtres de détection appropriés pour le DAPI et l’anticorps fluorophore secondaire. 8. Analyse ImageJ (Figure 2) REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser ImageJ version 1.52a ou supérieure. Ouvrez une image contenant une barre d’échelle dans ImageJ. Cliquez sur l’icône Ligne droite et tracez une ligne à la longueur exacte de la barre d’échelle [Figure 2 (1)]REMARQUE : Si nécessaire, cliquez sur l’icône Loupe pour effectuer un zoom avant ou arrière. Cliquez sur l’onglet Analyser . Mettez en surbrillance et cliquez sur Définir l’échelle. Remplacez Distance connue par la distance de la barre d’échelle. Remplacez Units of Length (Unités de longueur ) par les unités de la barre d’échelle. Appliquez globalement les paramètres en cochant la case Global. Cliquez sur OK pour définir l’échelle.REMARQUE : Une fois ce paramètre appliqué, chaque image ouverte affichera la zone calculée du champ de vision en unités saisies par l’utilisateur. Ouvrez une image DAPI uniquement dans ImageJ. Cliquez sur l’onglet Processus et mettez en surbrillance Soustraire l’arrière-plan. Supprimez l’arrière-plan de 50 pixels à la fois jusqu’à ce que les zones non tachées soient noires.REMARQUE : Si l’image ne contient pas d’arrière-plan, cette étape n’est pas requise. Cliquez sur l’onglet Image et mettez en surbrillance Type. Cliquez sur 8 bits pour rendre l’image en niveaux de gris [Figure 2 (2)]. Mettez l’image au seuil manuellement ou automatiquement pour inclure toutes les particules DAPI (veillez à ne pas dépasser manuellement le seuil) [Figure 2 (3)]. Cliquez sur l’onglet Image et mettez en surbrillance Ajuster. Cliquez sur Seuil. Cliquez sur Appliquer lorsque vous avez terminé. Cliquez sur l’onglet Process (Processus ) et sélectionnez Binary (Binaire). Cliquez sur Bassin versant. Cliquez sur l’onglet Analyze (Analyser) et mettez en surbrillance/cliquez sur Analyze Particles (Analyser les particules) [Figure 2 (4)]. Définissez la taille sur 5-infini et la circularité sur 0,00-1,00. Dans l’onglet déroulant Afficher, sélectionnez Contours. Assurez-vous que les options Afficher les résultats, Synthétiser et Inclure les trous sont cochées. Cliquez sur OK.REMARQUE : La plage de particules souhaitée peut être ajustée si le seuillage produit des pixels d’arrière-plan. Enregistrez le résultat du comptage sous la forme TOTAL DAPI. Ouvrez une image fusionnée de cytokératine 18/DAPI dans ImageJ. Utilisez l’icône Multipoint [Figure 2 (5)] pour compter manuellement toutes les particules DAPI non colorées pour la cytokératine 18. Enregistrez le résultat sous forme de CELLULES FEEDER. Utilisez l’équation ci-dessous pour déterminer le DAPI des hépatocytes.DAPI hépatocytaire = DAPI total – DAPI de la cellule nourricière 9. Quantification du total des hépatocytes attachés et du pourcentage d’attachement (Plaqueability) Créez un facteur d’échelle pour la zone de culture à 24 puits à l’aide de l’équation ci-dessous. Les mesures du champ de vision se trouvent en haut de chaque image ouverte [Figure 2 (2), encadré vert]. Calculez le nombre total d’hépatocytes attachés à l’aide de l’équation ci-dessous.Hépatocytes attachés = Facteur d’échelle × DAPI hépatocytaire Calculez le pourcentage d’attachement des hépatocytes à l’aide de l’équation ci-dessous. 10. Dosage de l’albumine Mesurer la production d’albumine à l’aide d’un test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) (voir tableau des matériaux) sur des échantillons dilués à 1 :200.REMARQUE : Pour plus de précision, l’utilisateur confirme que les échantillons se situent dans la plage linéaire de courbe standard. Le kit spécifié fournit tout le matériel et les instructions nécessaires pour effectuer le test. Normalisez les concentrations de l’échantillon dans les hépatocytes attachés à l’aide de l’équation ci-dessous. 11. Dosage de l’urée ATTENTION : Le réactif acide à l’azote uréique sanguin (BUN) contient de l’acide sulfurique. La concentration d’acide sulfurique dans le réactif acide BUN est considérée comme corrosive. Ne pas ingérer. Travaillez dans un endroit bien ventilé et portez un EPI approprié. La synthèse de l’urée est mesurée à l’aide d’une méthode de monoxyme de diacétyle modifiée (voir le tableau des matériaux). Diluer 53,3 μL d’urée à 75 mg/dL dans 346,7 μL de milieu de culture complet pour obtenir l’étalon #1 (100 μg/mL) Étiqueter les tubes 2 à 8 et utiliser une dilution en série 1 :2 pour obtenir les étalons d’analyse de l’urée (tableau 1). Ajouter 10 μL d’échantillon ou d’étalon dans les puits d’une plaque à 96 puits à fond transparent à paroi noire (voir le tableau des matériaux). Ajouter 150 μL de réactif BUN dans chaque puits contenant l’échantillon. Préparez le réactif BUN en mélangeant 1/3 du réactif de couleur BUN avec 2/3 de réactif acide BUN. Utilisez l’équation ci-dessous pour vous aider dans vos calculs.Réactif de couleur BUN (mL) = Réactif BUN total nécessaire × 0,333Réactif acide BUN (mL) = Réactif BUN total nécessaire × 0,667 Incuber l’assiette pendant 90 min dans un four ou un incubateur à 60 °C. Lecture immédiate de l’absorbance de la plaque à 540 nm et 650 nm. Créez une courbe standard en soustrayant l’absorbance du blanc et de l’arrière-plan (650 nm) de tous les échantillons et étalons. Générez une droite la mieux ajustée par analyse de régression linéaire. Déterminer la concentration inconnue de l’échantillon à partir de la courbe standard. Normalisez les concentrations de l’échantillon aux hépatocytes attachés à l’aide de l’équation ci-dessous.

Representative Results

La méthode globale de placage, de culture et de test de fonctionnalité de base du système de culture hépatique implique des techniques et des analyses de culture de cellules primaires courantes, comme illustré à la figure 1. La fixation des hépatocytes et le pourcentage de plaqueabilité ont été calculés au jour 14 à l’aide de l’analyse ImageJ d’au moins cinq images de coloration à la cytokératine 18 et au DAPI par puits (Figure 2). La figure 3 présente des images représentatives de PHH cultivées avec des cellules nourricières. Les différentes densités de semis hépatiques ont montré des différences visuelles de confluence en fonction de la densité de semis et ont maintenu une morphologie hépatique et cuboïdale typique pendant 14 jours de culture. Des images des lots donneurs d’hépatocytes A et B ont été capturées pour chaque densité de semis testée (figure 4A). Le pourcentage moyen de plaqueabilité du donneur B (89,04 % ± 3,99 %, 198 552 ± 49 885 PHH) était supérieur à celui du donneur A (66,08 % ± 6,67 %, 146 128 ± 33 063 PHH) pour toutes les densités de semis utilisées (figure 4B). Le donneur A avait un pourcentage significativement plus élevé de plaqueabilité en utilisant 150 000 PHH/puits (76,07 % ± 12,87 %) par rapport à 250 000 à 300 000 PHH/puits (62,75 % ± 9,64 %). Le donneur B n’a montré aucune différence significative dans le pourcentage de plaqueabilité des hépatocytes. Le donneur B présentait la plus faible plaqueabilité des hépatocytes (85,78 % ± 13,25 %) à la densité de semis la plus élevée, soit 300 000 PHH/puits. À l’instar du donneur A, l’ensemencement du donneur B à 150 000 PHH/puits présentait le pourcentage le plus élevé de plaqueabilité des hépatocytes (94,75 % ± 15,07 %). La production d’albumine et la synthèse de l’urée ont été mesurées à trois moments au cours de la période de culture de 14 jours et normalisées en fonction des hépatocytes attachés calculés. Dans l’ensemble, le donneur A présentait une production d’albumine accrue par rapport au donneur B (41,32 ± 4,58 μg alb/jour/106 PHH contre 34,66 ± 10,03 μg alb/jour/106 PHH) (Figure 5). Les donneurs A et B avaient la production d’albumine la plus élevée pour l’ensemencement des hépatocytes, soit 150 000 PHH/puits, 45,91 ± 5,96 μg alb/jour/106 PHHs et 48,67 ± 20,44 μg alb/jour/106 PHH, respectivement. Aucune différence significative dans la production d’albumine n’a été observée dans les densités de semis utilisées. Comme l’indiquent Baudy et al.3, il est souhaitable que les systèmes microphysiologiques du foie maintiennent une production constante d’albumine et une synthèse de l’urée avec moins de 50 % de changement en 14 jours de culture. Le coefficient de variation (CV) a été calculé en divisant la moyenne par l’écart-type pour les jours 7, 10 et 14. Tous les échantillons ont été exécutés en double. Le CV de la production d’albumine au cours de la période de culture de 14 jours à 150 000 PHH/puits était de 12,24 % pour le donneur A et de 37,97 % pour le donneur B, ce qui est inférieur au critère de 50 % souhaité. Une forte variance dans la production d’albumine a été observée chez le donneur A et le donneur B lorsqu’ils ont été ensemencés à 250 000 et 300 000 PHH/puits. À ces densités de semis, les deux donneurs connaissent une forte diminution de la production d’albumine entre les jours 7, 10 et 14 de la culture (donneur CV A, 22,49 % et donneur B, 45,07 %). La synthèse de l’urée du donneur B (95,09 ± 18,91 μg d’urée/jour/106) a été augmentée par rapport à celle du donneur A (64,92 ± 4,66 μg d’urée/jour/106 PHH) lors de la moyenne des données spécifiques au lot de PHH aux jours 7, 10 et 14 (Figure 6). Le donneur B (113,49 ± 37,34 μg d’urée/jour/106 PHHs) et le donneur A (69,12 ± 17,06 μg d’urée/jour/106 PHHs) ont eu la plus grande synthèse d’urée au cours d’une période de culture de 14 jours à une densité de 150 000 PHH/puits et 200 000 PHH/puits, respectivement. Les deux lots donneurs présentaient la plus faible production d’urée et le CV le plus élevé, soit 300 000 PHH/puits. Aucune différence significative dans la synthèse de l’urée n’a été observée dans les densités de semis utilisées. Le CV le plus faible pour la synthèse de l’urée chez le donneur A a été observé lors de la culture à 250 000 PPH/puits (23,11 %) et à 200 000 PHH/puits pour le donneur B (28,26 %). Comme le soulignent ces résultats, la densité de semis optimale pour un lot donné de PHH dépend du niveau de confluence souhaité au moment de l’essai et de la nature des résultats mesurés ; Une densité de semis plus élevée n’est pas toujours corrélée à un signal ou à une plage dynamique plus élevée. Figure 1 : Organigramme du placage, de la culture et des tests fonctionnels des hépatocytes avec des cellules nourricières. (A) Les cellules nourricières sont décongelées dans un milieu de décongélation spécifique (voir le tableau des matériaux), remises en suspension dans un milieu de placage complet (voir le tableau des matériaux), et les cellules sont comptées. Les cellules sont diluées, plaquées et incubées pendant 60 min à 37 °C/5 % de CO2. (B) Les hépatocytes sont décongelés dans un milieu de décongélation spécifique (voir le tableau des matériaux), remis en suspension dans un milieu de placage complet, et les cellules sont comptées. Les hépatocytes sont dilués et plaqués avec des cellules nourricières. Les cellules sont incubées pendant 2 à 4 h à 37 °C/5 % de CO2, en agitant dans un mouvement N-S-E-W toutes les 15 min pendant les 60 premières minutes de culture. Le milieu de placage est remplacé par un milieu de culture complet préchauffé pour l’entretien de la culture (voir le tableau des matériaux). Les cultures sont nourries quotidiennement. (C) Les jours 7, 10 et 14, des échantillons de milieu sont prélevés pour les tests d’albumine et d’urée. Après le prélèvement des échantillons au jour 14, les cellules sont fixées et colorées avec l’anticorps Cytokératine 18 (voir Tableau des matériaux) 16-24 h à 4 °C. De plus, ils sont incubés dans un anticorps secondaire approprié, lavés et montés avec du DAPI (voir le tableau des matériaux) pour la capture et l’analyse d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Analyse d’images à l’aide du logiciel ImageJ. Traitement ImageJ des images capturées. Étape 1 : une échelle est appliquée à toutes les images en fonction de la barre d’échelle spécifique au microscope. Étape 2 : le type d’image est modifié. Etape 3 : une limite de seuil est appliquée à certaines particules DAPI. Étape 4 : une analyse des particules est effectuée et le comptage est enregistré. Étape 5 : pour déterminer le nombre de cellules d’alimentation attachées, une image fusionnée est comptée à l’aide de l’outil multipoint. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Morphologie de différentes densités de semis hépatiques cultivées avec des cellules nourricières. Images représentatives aux jours 7 et 14 de PHH cultivées avec des cellules nourricières (50 000 cellules/puits) à des densités de semis hépatiques de 150 000, 200 000, 250 000 et 300 000 PHH/puits. Les images ont été prises à l’aide d’un objectif 10x sur un microscope à contraste de phase inversée. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Immunocytochimie fluorescente de diverses densités de semis hépatiques cultivées avec des cellules nourricières. (A) Images représentatives de la coloration de la cytokératine 18 (rouge) au jour 14 à des densités de semis hépatiques de 150 000, 200 000, 250 000 et 300 000 PHH/puits. Deux puits pour chaque densité de semis ont été fixés pendant 30 min à 4 °C. Les puits ont été incubés 16 à 24 h à 4 °C avec des anticorps primaires à 1 :1000. Un anticorps secondaire a été utilisé à 1 :500 pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité. La coloration nucléaire DAPI (bleue) a été ajoutée aux puits pendant 15 minutes à température ambiante. Les images ont été prises à l’aide d’un objectif 10X sur un microscope fluorescent inversé. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Calcul des hépatocytes attachés et du pourcentage de plaqueabilité des différentes densités d’ensemencement hépatique calculées à l’aide d’ImageJ. *p ≤ 0,05, au pourcentage de plaqueabilité pour 200 000, 250 000 et 300 000 PHH/puits. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (n ≥ 5 images par condition). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Production d’albumine d’hépatocytes cultivés avec des cellules nourricières. Production d’albumine à partir de densités de semis hépatiques à 150 000, 200 000, 250 000 et 300 000 PHH/puits. Les colonnes représentent la moyenne sur 14 jours des microgrammes d’albumine/jour normalisés par rapport au total des hépatocytes attachés. Une ligne représente le CV entre les jours 7, 10 et 14. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (n ≥ 2 puits par condition avec répétitions). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Synthèse d’urée d’hépatocytes cultivés avec des cellules nourricières. Synthèse de l’urée à partir de densités de semis hépatiques à 150 000, 200 000, 250 000 et 300 000 PHH/puits. Les colonnes représentent la moyenne sur 14 jours de μg d’urée/jour normalisée par rapport au total des hépatocytes attachés. Une ligne représente %CV entre les jours 7, 10 et 14. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (n ≥ 2 puits par condition avec répétitions). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Norme (S) # Concentration (μg/mL) Solution d’urée (μL) Culture complète (μL) 1 100 53.375 mg/dL de bouillon 346.7 2 50 100(Solution S1) 100 3 25 100(Solution S2) 100 4 12.5 100(Solution S3) 100 5 6.26 100(Solution S4) 100 6 3.125 100(Solution S5) 100 7 1.5625 100(Solution S6) 100 Blanc 0 0 100 Tableau 1 : Préparation de l’échantillon standard d’urée. À l’aide de 75 mg/dL d’urée mère, préparer une solution d’urée à 100 μg/mL. Aliquote les volumes suggérés pour atteindre la concentration finale de la courbe standard.

Discussion

Le système de culture hépatique décrit peut être établi dans des laboratoires équipés d’instruments standard de culture tissulaire. Composé de PHH cultivés avec des cellules nourricières, le système permet à l’utilisateur de cultiver des PHH pendant au moins deux semaines avec une production d’albumine stable et une synthèse d’urée. En raison de la variabilité des lots donneurs de PHH, il est recommandé d’utiliser dans le système uniquement des PHH présélectionnés et qualifiés. Bien que le nombre de PHH attachés varie en fonction du lot donneur et de la densité de semis, la plaqueabilité relative reste similaire au sein de chaque lot donneur. Bien que les densités de semis recommandées soient recommandées, les données ci-dessus suggèrent que la densité de semis des hépatocytes peut être ajustée en fonction de différents besoins expérimentaux ; cependant, il convient de noter que l’ensemencement d’un plus grand nombre de PHH peut ne pas fournir des résultats fonctionnels plus élevés ou plus constants. L’analyse des lots de PHH évalués a montré le CV le plus bas pour la production d’albumine et la synthèse de l’urée en utilisant des densités de semis plus faibles de 150 000 PHH/puits et de 200 000 PHH/puits ; Cependant, aucune différence significative n’a été constatée entre l’albumine et l’urée, quelle que soit la densité de semis. Des densités de semis plus élevées de 250 000 PHH/puits et de 300 000 PHH/puits montrent une diminution plus importante de l’albumine et de l’urée au cours de la période de culture de 14 jours. La variabilité inhérente de la plaqueabilité des donneurs peut affecter la constance de la production d’albumine et de la synthèse de l’urée à 250 000 PHH/puits et à 300 000 PHH/puits pour les lots donneurs testés. À l’instar des sphéroïdes des grands hépatocytes, le sursemis des PHH dans le système TV2D+ peut avoir des effets négatifs sur la culture et la fonctionnalité à long terme des PHH.

Toutes les étapes de la décongélation, du placage et de l’entretien sont essentielles à la réussite de la culture et de la génération de données. Cependant, il existe plusieurs erreurs courantes que les utilisateurs inexpérimentés peuvent éviter. Les PHH sont très sensibles aux dommages secondaires aux fluctuations de température, aux contraintes de cisaillement et à l’exposition à l’air 9,10. Des précautions doivent être prises lors de la décongélation des PHH afin d’éviter des délais de décongélation prolongés et un pipetage excessif. L’utilisation d’une méthode de coulée manuelle, d’une minuterie et d’un transfert immédiat du bain-marie à la glace réduira ces erreurs courantes qui peuvent affecter la viabilité et la plaqueabilité des PHH. De plus, les problèmes de chaîne d’approvisionnement devenant de plus en plus courants, il peut être difficile d’obtenir des plaques enrobées de collagène. Le revêtement manuel des plaques traitées par culture tissulaire à l’aide de solutions commerciales de collagène de type I (5-10 μg/cm2) peut être utilisé pour surmonter ce problème ; Cependant, pour des performances et une cohérence optimales, il est recommandé d’utiliser des plaques de collagène pré-enrobées. Dans le processus de transition de la culture de cellules nourricières uniquement à l’introduction de PHH, il est essentiel d’empêcher la couche de cellules nourricières de se dessécher. Ne laissez jamais l’air exposer les cellules d’alimentation. Toute période d’exposition à l’air peut entraîner une mauvaise qualité de la couche cellulaire nourricière, ce qui aura un impact négatif sur la culture à long terme des PHH. Il est recommandé de laisser une petite quantité de milieu résiduel entre les changements de milieu. À l’occasion, les PHH peuvent contenir un excès de débris provenant de l’isolement, ce qui peut rendre difficile l’observation de la morphologie. Pour résoudre ce problème, secouez la plaque avant de changer de milieu et utilisez l’aspiration sous vide. Enfin, lors d’un changement de milieu, aspirez soigneusement le milieu épuisé en prenant soin de ne pas perturber les cellules en culture. Pipeter le volume moyen frais sur le côté du puits pour éviter de pipeter directement sur la couche cellulaire. L’utilisateur doit également éviter l’exposition à l’air à chaque changement de milieu, en utilisant le changement recommandé à 3 puits (sections 3 et 4). Il convient également de noter qu’un changement quotidien de support est idéal mais pas obligatoire.

Bien que les microscopes fluorescents soient devenus courants dans la plupart des laboratoires, les logiciels nécessaires pour effectuer une analyse d’image spécifique peuvent entraîner des dépenses supplémentaires. ImageJ peut être téléchargé gratuitement, ce qui en fait un outil d’analyse d’images facilement accessible. Les étapes du protocole fournissent une base à laquelle l’utilisateur peut avoir besoin d’optimiser, en particulier l’analyse des particules de coloration DAPI ; toutefois, en l’absence d’une capacité d’imagerie par fluorescence, les valeurs de fixation de l’HPH au jour 14 sont fournies sur les certificats d’analyse propres à chaque lot. Un mauvais seuillage entraînera un comptage inexact des particules DAPI. Il est également recommandé de vérifier la surface de chaque particule DAPI avant de définir une exclusion de taille. Pour ce faire, utilisez l’icône Ovale [Figure 2 (1), icône en forme de cercle sous l’onglet Modifier ] et dessinez un cercle qui englobe la particule DAPI. L’onglet Analyser peut ensuite être utilisé pour mesurer la surface de la particule DAPI sélectionnée. Des mesures spécifiques peuvent être sélectionnées à l’aide de l’option Définir les mesures sous l’onglet Analyser [étape 8.9 et Figure 2 (4)].

Les méthodes actuelles de culture des PHH impliquent l’utilisation d’enrobages tels que le collagène-I pour augmenter l’attachement cellulaire dans la monoculture bidimensionnelle traditionnelle11 ou la superposition d’une matrice extracellulaire, comme le Matrigel à base de murine, une technique communément appelée « culture sandwich »12,13,14,15. Bien que la technique de culture en sandwich améliore la morphologie et la polarité du PHH au fil du temps par rapport à la monoculture traditionnelle, les deux approches manquent encore de stabilité phénotypique à long terme en culture pour la plupart des lots de PHH plaqueables. Une autre méthode utilisée pour cultiver les PHH consiste à fabriquer des sphéroïdes 3D ; cependant, comme l’ont déjà indiqué Glicklis et al.4, la reproductibilité de la taille des sphéroïdes peut poser des problèmes techniques en raison de la variabilité du donneur. Dans le but de créer un modèle hépatique plus pertinent sur le plan physiologique, des modèles multicellulaires ont été développés. Comme décrit par Ware et al.7, l’utilisation de micropatterns, de fibroblastes murins et de cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie humain entourées de PHH a permis d’allonger les temps de culture in vitro. Cependant, la microstructuration peut être un processus complexe et chronophage, et les cellules nourricières non humaines peuvent contribuer à l’arrière-plan des signaux métaboliques, ce qui limite l’utilité de cette plate-forme dans certaines applications. L’utilisation de diverses cellules non hépatiques, y compris des fibroblastes dermiques humains et rats et des cellules endothéliales de l’aorte bovine comme cellules nourricières pour la co-culture d’hépatocytes, a montré une sécrétion d’albumine et une formation de jonctions serrées similaires aux co-cultures de cellules nourricières d’origine hépatique16. Cependant, le mécanisme des interactions entre les cellules TV2D+ non hépatiques et les PHH en culture doit être étudié plus en profondeur pour mieux comprendre l’influence sur la stabilité et la fonctionnalité des PHH dans ce système. Le système de culture décrit précédemment par Weaver et al.8 permet de cultiver avec succès des PHH dans des colonies hépatiques pendant une période allant jusqu’à 42 jours, formant de vastes réseaux canaliculaires biliaires. Les PHH cultivés dans ce système ont maintenu une fonctionnalité hépatique clé, y compris l’activité des cytochromes 1A2, 2B6 et 3A4 et l’activité enzymatique à base d’uridine 5′-diphospho-glucuronosyltransférase (UGT), la formation de métabolites de phase I et II, la production d’albumine et la synthèse d’urée pendant au moins 22 jours in vitro sans Matrigel. Ce système de culture produit des résultats stables et physiologiquement pertinents qui sont facilement adaptables à n’importe quel laboratoire pour des applications pharmacologiques et toxicologiques. Bien que les fonctions PHH clés soient conservées dans le système TV2D+, aucune comparaison directe n’a été faite avec le modèle sphéroïde 3D ; cependant, les travaux futurs comparant les mêmes donneurs de PHH entre les systèmes de culture s’avéreront utiles pour déterminer les limites et les avantages des deux méthodes.

Les applications potentielles de la TV2D+ comprennent l’évaluation de la clairance métabolique et des interactions médicamenteuses de composés à faible renouvellement, les lésions hépatiques induites par les médicaments et l’évaluation des risques des produits agrochimiques. La prédiction précise de la clairance hépatique des médicaments nouveaux et émergents repose sur une culture de PHH stable et prolongée avec conservation de la fonctionnalité hépatocellulaire clé, ce qui est particulièrement difficile lors de l’évaluation de composés à faible renouvellement. De plus, l’évaluation des risques et la toxicité hépatique induite par les produits chimiques sont des préoccupations majeures pour la santé, et les modèles actuels n’offrent pas la stabilité et la fonctionnalité à long terme de la culture pour évaluer avec précision la toxicité chimique chronique potentielle qui peut être secondaire à une exposition aiguë. Des PHH sains et malades cultivés en TV2D+ ont montré des différences caractéristiques dans la fonction et la disposition des lipides qui ont été conservées au fil du temps17. Ces études confirment que TV2D+ est un outil prometteur pour une variété d’applications pharmacologiques et toxicologiques.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Mellissa Keller et Wendy Hetman pour leur aide dans la révision des manuscrits et des figures.

Materials

0.2 µm PES  filter unit  Thermo Fisher Scientific  565-0020 User preference 
15 mL or 50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific  352196 or 352070 User preference 
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific  A-21428 Other secondary antibodies can work
Anti-Cytokeratin 18 antibody  abcam ab24561 Necessary using same dilution
AOPI  Nexcelom  CS2-0106-5mL Used for Cellometer counting 
Biosafety cabinet  Labconoco 3460801 User preference 
Black-walled, clear bottom, 96-well plate  Thermo Fisher Scientific  165305 User preference 
Centrifuge Thermo Fisher Scientific  Sorvall X4R Capable of speeds up to 400 x g
Collagen coated plate, 24-well Greiner Bio-One 662950 Rat tail collagen coating
Counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002 Used for Cellometer counting 
Culture medium  LifeNet Health  MED-TCCM
Culture supplement  LifeNet Health  MED-TCSC
DAPI  Thermo Fisher Scientific  00-4959-52 Contains mounting medium
DPBS (-Ca, -Mg) Thermo Fisher Scientific  14190250 User preference 
Feeder cell supplement  LifeNet Health  MED-TCSA
Feeder cell thawing medium LifeNet Health  MED-FCTM
Fluorescent microscope  Zeiss AxioObserver Z1 Equipped with user specific filters 
Hepatocyte thawing medium LifeNet Health  MED-HHTM4C-50ML
Human albumin ELISA kit  abcam ab108788 Necessary if using same dilution
Human feeder cells LifeNet Health  PHFC24
Humidified incubator  VWR 97025-842 Capable of 5% CO2 
IC Fixation buffer Thermo Fisher Scientific  00-8222-49 Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used
ImageJ National Insitute of Health  Version 1.52a  1.52a or higher 
Inverted phase contrast microscope  Olympus CK40-F100 User preference 
Microcentrifuge tubes VWR 20170-022 User preference 
Micropipettes (various sizes) USA Scientific  ErgoOne User preference 
Permeabilization buffer (10x) Thermo Fisher Scientific  00-8333-56 Other permeabilization buffers can work
Plate reader  BMG Labtech CLARIOstar Capable of reading absorbance 450-640 nm
Plating medium  LifeNet Health  MED-TCPM
Plating supplement  LifeNet Health  MED-TCSB
Primary human hepatocytes  LifeNet Health  various  Catalog number may vary based on lot number
Secondary antibody  Thermo Fisher Scientific  A-21428 User preference 
Serological pipet controller Gilson  F110120 User preference 
Storage bottle 100–500 mL  VWR 76311-770 User preference 
Urea Nitrogen (BUN) Test  Stanbio 0580-250
Water bath PolyScience WBE05 Capable for use at 37 °C
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Referências

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Odanga, J. J., Gianulis, E., Whaley, L., LeCluyse, E. L., Presnell, S., Weaver, J. R. An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications. J. Vis. Exp. (200), e65992, doi:10.3791/65992 (2023).
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