JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

İlaç Geliştirme Uygulamaları için Tüm İnsanlardan Oluşan Bir Hepatik Kültür Sistemi

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65992
, , , , ,
1Institute of Regenerative Medicine,LifeNet Health, 2Biologics Division,LifeNet Health, 3LifeSciences Division,LifeNet Health, 4Research and Development,LifeSciences, LifeNet Health

Summary

Son teknik gelişmeler, ilaç metabolizması ve toksisite uygulamaları için bir in vitro platformun ölçekli üretimini mümkün kılmıştır. Tamamen insanlardan oluşan bir 2D+ hepatik sistem (TV2D+), geleneksel iki boyutlu kültür yöntemlerini kullanarak fizyolojik olarak ilgili sonuçlar sağlar. Bu protokol, sistemin kurulumu, bakımı ve uygulanmasında son kullanıcıları destekleyecektir.

Abstract

Farmakolojik ve toksikolojik çalışmalar için birincil insan hepatositleri (PHH’ler) için uzun vadeli, insanla ilgili bir kültür modeli bulmak zor olmaya devam etmektedir. Mevcut in vitro model platformları genellikle elverişsiz ve karmaşıktır, zaman içinde fenotipik stabiliteden yoksundur ve deneysel tekrarlanabilirlik ve esneklikten yoksun çoklu PHH lotlarını desteklemez. Burada, tipik olarak daha karmaşık üç boyutlu (3D) sistemlere eşlik eden zaman içinde uzun ömürlülüğü ve fenotipik kararlılığı korurken, standart iki boyutlu (2D) kültür tekniklerinden ve ekipmanlarından yararlanan, tamamen insan 2D+ hepatik sistemin (TV2D+) çözülmesi, kaplanması ve bakımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Sonuçlar, PHH tohumlama yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak TV2D+’da bağlanma ve yüzde plakalanabilirliğin yanı sıra kültürde en az 2 hafta boyunca stabil işlevselliği göstermektedir. Başarılı bir uzun vadeli kültür elde etmek için bir dizi PHH tohumlama yoğunluğu değerlendirilir. Düzgün bir şekilde kurulduğunda, TV2D+’daki PHH’ler hepatosit kolonileri halinde organize olur, hepatik spesifik bir belirteç ifade eder ve canlılığı, mimari bütünlüğü ve fizyolojik olarak ilgili albümin ve üre seviyelerini korur. Bu benzersiz özellik kombinasyonu, TV2D+ sistemini çeşitli farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için uygun bir hepatik model haline getirir.

Introduction

Terapötik güvenlik ve etkinliğin tahmin edilmesi, klinik öncesi ilaç geliştirmenin önemli bir parçasıdır. Bununla birlikte, konvansiyonel preklinik in vitro hepatik modeller, in vivo karaciğer hücresel mikroçevresini doğru bir şekilde taklit etme ve zaman içinde hepatosit işlevselliğini ve morfolojisini koruma yetenekleri bakımından sınırlıdır. Yavaş döngülü bileşikleri değerlendirmek veya subakut veya kronik maruziyetle ilişkili sonuçları araştırmak için 1 haftadan uzun süre stabil metabolik yeterlilik sağlayan modellere ihtiyaç vardır. İn vivo hayvan testleri, insan hepatik klirens mekanizmalarındaki translasyonel tür farklılıkları nedeniyle ilaç etkinliğini ve riskini tahmin etmekte sıklıkla başarısız olur1. Geleneksel primer insan hepatosit (PHH) monokültürü veya sandviç kültürleri gibi mevcut in vitro 2 boyutlu (2D) hepatik modeller, kültürde fenotipik stabilite ve uzun ömürlülükten yoksundur, bu da zamanla temel hepatoselüler fonksiyonun ve mimari bütünlüğün kaybına yol açar2. Alternatif bir yöntem, 3 boyutlu (3D) hepatosit sferoidlerinin oluşumunu içerir ve 2D kültüre kıyasla daha uygun bir mikro çevre sunar. Bununla birlikte, bu yöntem, hammaddelerin mevcudiyeti, PHH donör lot seçimi, tekrarlanabilirlik ve artan küresel boyut 3,4,5,6 ile canlılık kaybı ile sınırlıdır. PHH’lerin besleyici hücrelerle sabit boyutlu, mikro desenli plakalara ekildiği çok hücreli platformlar tanıtıldı. Bu modeller daha uzun kültür süreleri sağlayabilse de, bu platformlarda kullanılan insan dışı besleyici hücreler, ilaç klirensine ve metabolik profilleredoğuştan gelen arka plan katkısı nedeniyle deneysel sonuçları değiştirebilir ve uygulamalarını sınırlayabilir 1,7. Yakın zamanda Weaver, et al8’de açıklanan TruVivo tamamen insan 2D+ hepatik sistemi (TV2D+), PHH’lerin geleneksel, ortak kültür ve 3D kültür yöntemlerinin bazı sınırlamalarını ele almak için geliştirilmiştir. Karaciğer besleyici olmayan hücreler, metabolizma ve parakrin üretimindeki türler arası farklılıkları azaltır ve primer hepatositler için gerekli desteği, genişleme, fenotip ve performanstaki sınırlamalar nedeniyle tek bir donör lotundan karşılık gelen parankimal olmayan karaciğer hücreleri tarafından sağlanamayan tekrarlanabilir, sağlam bir şekilde sağlar. Seçilen besleyici hücreler, kullanımdan önce tutarlı bir şekilde genişletilebildi ve dönüşüm veya farklılaşma ihtiyacından yoksundu. Glicklis ve ark.4 ve Khetani ve ark.5 tarafından tanımlandığı gibi, hepatosit sferoidleri gibi 3D kültür modelleri, donör değişkenliği ve 200 μm’den büyük sferoidlerde besin difüzyonunu etkileyen, canlılık ve işlevselliğin azalmasına yol açan sferoid boyutunda tutarlılığın korunması nedeniyle tekrarlanabilirlik ile ilgili zorluklara sahiptir. 3D küresel oluşum gibi, TV2D+ sistemi de PHH’lerin kendi kendine montajına dayanır; bununla birlikte, oluşan PHH kolonileri, tek bir agrega halinde sıkıştırılmak yerine, tek hücre derinliğinde kuyu yüzey alanı üzerinde dağılır. Bu kültür yöntemi, PHH’lerin kaplanmasına, kültürlenmesine ve çeşitli tohumlama yoğunluklarında temel işlevselliği sürdürmesine izin vererek donör değişkenliğini ele almak için yararlı olabilir. TV2D+ sistemi, manipülasyon sırasındaki kayıp veya 3D sferoidlerde genişletilmiş kültür gerçekleştirmek için gereken özel ekipman nedeniyle kullanıcı kullanımının sağlamlığını da artırabilir.

TV2D+ sistemi, standart 2D kültürünü, tipik olarak 3D sistemlere eşlik eden uzun ömürlülük ve fenotipik kararlılıkla birleştirir. Burada açıklanan protokol, biyogüvenlik kabinleri, santrifüjler veCO2 inkübatörleri gibi standart ekipmanlarla donatılmış laboratuvarlarda temel doku kültürü becerilerine sahip kullanıcılar için adım adım yönergeler sağlar. Ortamın hazırlanması, çözülmesi, kaplanması ve elde edilen kültür sisteminin bakımı dahil olmak üzere süreçteki her adım ayrıntılı olarak özetlenmiştir. Protokol ayrıca temel hepatosit işlevsellik çıktılarını, albümini ve üreyi belirlemek için bir yöntemin yanı sıra normalizasyon için PHH ekini belirlemek için immünofloresan görüntü analizi içerir. Düzgün bir şekilde kurulduğunda, TV2D+’daki PHH’ler, doğal hepatik morfolojiyi taklit ederek hepatosit kolonileri halinde organize olur ve en az 2 hafta boyunca genişletilmiş canlılık, mimari bütünlük ve fizyolojik olarak ilgili albümin ve üre seviyelerini korur8. Sistem bir dizi PHH tohumlama yoğunluğuna izin verebildiğinden, arzu edilen donör özelliklerine sahip daha az plakalanabilir PHH lotlarının mevcudiyetini artırmada faydalı olabilir. Bu erişilebilirlik ve işlevsellik kombinasyonu, TV2D+’ı çeşitli farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için uygun bir hepatik model haline getirir.

Protocol

Bu protokol, Lifenet Health’in etik komitesinin yönergelerini takip eder. Makale, insan katılımcılarla yapılan herhangi bir çalışmayı veya yazarlardan herhangi biri tarafından gerçekleştirilen hayvan çalışmalarını içermemektedir. Tüm hücreler, Lifenet Health tarafından araştırma amacıyla tamamen onaylanan donör dokusundan izole edildi. 1. Orta hazırlık Her besleyici hücre çözdürme ortamı, ek A, ek B ve ek C’yi (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C’lik bir su banyosunda veya 4 ° C’de 16-24 saat çözdürün. Besleyici hücre çözdürme ortamının tüm şişesini (10 mL) 15 mL veya 50 mL’lik konik bir tüpe ayırın.NOT: Hücre peletinin boyutunun 15 mL’lik bir konik tüp kullanılarak görüntülenmesi daha kolay olacaktır. Tam bir kaplama ortamı oluşturmak için bir şişe kaplama ortamına (75 mL) 4.5 mL ek B ve 11 mL ek A ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).NOT: Komple kaplama ortamı, FBS %<5 v/v konsantrasyonuna sahiptir. Ayrı bir şişeye, tam bir kültür ortamı yapmak için 100 mL kültür ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız), 1 mL ek C ve 14 mL ek A ekleyin.NOT: Tam kültür ortamı, FBS konsantrasyonuna sahiptir<%1 v/v Kalan takviye C’yi ve takviye A’yı -20 °C’de 2. haftaya kadar saklayın.NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngüleri, takviyelerin raf ömrünü azaltacaktır. Sadece bir kez dondurulması-çözülmesi önerilir. Kullanmadan önce, 10 mL besleyici hücre çözdürme ortamını, hepatosit çözme ortamını, tam kaplama ortamını ve tam kültür ortamını 37 ° C’lik bir su banyosunda 20-30 dakika ısıtın. 2. İnsan besleyici hücrelerin çözülmesi, sayılması ve kaplanması (Şekil 1A) PHH’leri tohumlamadan yaklaşık 1 saat önce besleyici hücreleri kültürleyin. Besleyici hücreleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C’lik bir su banyosunda 1-2 dakika çözün.NOT: Uzun süreli maruziyetten kaçının (örn., >2 dakika) çözüldüğünü izleyerek ve ters çevrildiğinde kriyoviyalde sıvı gevşediğinde şişeyi çıkararak. Çözüldükten hemen sonra, besleyici hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Aseptik teknikler kullanarak, bir biyogüvenlik kabininde (BSC), 10 mL besleyici hücre çözme ortamına taze çözülmüş hücreler ekleyin. Şişeyi 1 mL hücre/çözdürme ortamı süspansiyonu ile bir kez yıkamak için 1000 μL’lik bir pipet kullanın ve toplayın. Oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca 400 x g’da döndürün. Pipetleme veya vakum aspirasyonu ile hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice atın. Hücre peletini 1 mL tam kaplama ortamında yeniden süspanse edin ve besleyici hücreleri sayın.NOT: Besleyici hücreler, otomatik bir hücre sayacında akridin turuncusu ve propidyum iyodür (AOPI) veya bir hemasitometre kullanılarak tripan mavisi kullanılarak sayılabilir. Hücre sayımları teknolojiye ve kullanıcıya bağlı olarak değişebilir. En iyi sonuçları elde etmek için, yinelenen örnekleri sayın ve seçilen metodolojide tutarlı kalın. Tam kaplama ortamını kullanarak hücre süspansiyonunu 100.000 hücre / mL’ye seyreltin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun oyuğu başına 500 μL (50.000 hücre) kollajen kaplı 24 oyuklu bir plaka üzerine plaka (bkz. NS yönünde 2 kez ileri geri hareket ve ardından aynı E-W hareketi ile plakayı Kuzey (N)-Güney (S)-Doğu (E)-Batı (W) hareketiyle sallayın. Bu sallama protokolünü toplam 3 tur boyunca 2 kez daha tekrarlayın.NOT: Hücre dağılımına yardımcı olmaya devam ederken plaka kapağına sıçramasını önlemek için orta kuvvet kullanarak sallayın (lütfen videoya bakın). 37 °C /% 5 CO2’de 60 dakika inkübe edin. Hepatositleri çözmeye devam etmeden önce besleyici hücre ekini görüntüleyin.NOT: Kabul edilebilir besleyici hücre bağlantısı görsel olarak yaklaşık% 50 birleşiktir. 3. Birincil insan hepatositlerinin çözülmesi, sayılması ve kaplanması (Şekil 1B) 30 dakikalık besleyici hücre kültürünü takiben, önceden ısıtılmış hepatosit çözme ortamını 0.2 μm polietersülfon (PES) filtre ünitesinden süzün. PHH’leri 37 ° C’lik bir su banyosunda 1-2 dakika çözdürün.NOT: Uzun süreli maruziyetten kaçının (örn., >2 dakika) çözüldüğünü izleyerek ve ters çevrildiğinde kriyoviyalde sıvı gevşediğinde şişeyi çıkararak. Çözüldükten hemen sonra PHH’leri buzun üzerine yerleştirin. Bir BSC’de, PHH süspansiyonunu hepatosit çözme ortamına dökün.NOT: Mümkün olduğunda PHH hücresi süspansiyonlarını pipetlemekten kaçının. Çözülmüş PHH’lerin kriyoviyalden çözdürme ortamına transferi sırasında pipetleme yapılmaması çok önemlidir. Şişeyi 3-4 kez yıkamak için 1000 μL’lik bir pipet kullanın, 1 mL hepatosit/çözülme ortamı süspansiyonunu şişeye hafifçe pipetleyin ve yıkamayı tekrar çözdürme ortamına dökerek toplayın. Çözülmüş PHH süspansiyonunu 5 kez kapatın ve hafifçe ters çevirin. RT’de 8 dakika boyunca 100 x g’da döndürün. Pipetleme veya vakum aspirasyonu ile hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice atın. Konik borunun duvarına 3 mL tam kaplama ortamı ekleyin. Hücre peletini yeniden süspanse etmek için konik boruyu yan yana sallayın. Yeniden süspanse edilen hepatositlere ilave 5 mL tam kaplama ortamı ekleyin. PHH’leri sayın.NOT: PHH’ler, otomatik bir hücre sayacında AOPI veya bir hemasitometre kullanılarak tripan mavisi kullanılarak sayılabilir. Hücre sayımları teknolojiye ve kullanıcıya bağlı olarak değişebilir. En iyi sonuçları elde etmek için, yinelenen örnekleri sayın ve seçilen metodolojide tutarlı kalın. Tam kaplama ortamını kullanarak hücre süspansiyonunu istenen tohumlama yoğunluğuna (300.000-600.000 PHH/mL) seyreltin.NOT: Optimal hepatosit tohumlama yoğunluğu partiden partiye değişebilir. Belirli bir parti için önerilen tohumlama yoğunluğu, analiz sertifikasında (COA) sağlanacaktır. 24 oyuklu bir plaka için hepatositleri / mL’yi belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın. Plakalı besleyici hücrelerden, pipetleme veya vakum aspirasyonu ile ortamı çıkarın.NOT: Besleyici hücrelerin canlılığını sağlamak için, bir seferde en fazla 3 kuyu değiştirilmesi önerilir. Seyreltilmiş hepatosit süspansiyonunun oyuğu başına 500 μL (150.000-300.000 hücre), besleyici hücreler içeren önceden kaplanmış kollajen 24 oyuklu plaka üzerine hemen plakalayın. NS yönünde 2 kez ileri geri hareket ederek ve ardından aynı E-W hareketini yaparak plakayı NSEW hareketiyle sallayın. Bu sallama protokolünü toplam 3 tur boyunca 2 kez daha tekrarlayın.NOT: Hücre dağılımına yardımcı olurken plaka kapağına sıçramasını önlemek için orta kuvvet kullanarak sallayın. 37 °C/O2’de 2-4 saat inkübe edin. Kültürün ilk 60 dakikası için, yukarıdaki 3.15 adımında olduğu gibi her 15 dakikada bir N-S-E-W hareketiyle plakayı sallayın. İnkübasyonun ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve BSC’ye yerleştirin. Plakayı sallayın ve pipetleme veya vakum aspirasyonu ile tüm kaplama ortamını çıkarın.NOT: Kültürün yaşayabilirliğini sağlamak için, bir seferde en fazla 3 kuyu değiştirilmesi önerilir. Hemen her bir oyuğa 500 μL önceden ısıtılmış tam kültür ortamı ekleyin. 4. Bakım 20-30 dakika boyunca 37 ° C’lik bir su banyosunda alikot ve önceden ısıtılmış tam kültür ortamı. 24 oyuklu bir plaka için yaklaşık 13,5 mL ortam gereklidir. Kültürleri günlük olarak taze, önceden ısıtılmış tam kültür ortamı başına 500 μL ile besleyin.NOT: Kültürün yaşayabilirliğini sağlamak için, bir seferde en fazla 3 kuyu değiştirilmesi önerilir. Her 7 günde bir taze tam kültür ortamı hazırlayın. 5. Albümin ve üre ölçümü için kültür süpernatan örneklerinin toplanması 7, 10 ve 14. günlerde, Şekil 1C’de gösterildiği gibi, istenen numune kuyucuğundan/kuyucuklarından 500 μL ortamı bir mikrosantrifüj tüpüne/tüplerine toplayın. Numuneyi/numuneleri 320 x g’da 10 °C’de 4 dakika boyunca döküntüleri pelet haline getirin. Numune süpernatan(lar)ını yeni mikrosantrifüj tüp(ler)ine aktarmak için bir pipet kullanın ve peletin bozulmasını önleyin. Örnekleri albümin ve/veya üre tahlili üzerinde çalıştırın (sırasıyla bölüm 10 ve 11’e bakınız).NOT: Numuneler -20 °C ila -80 °C’de 2 hafta saklanabilir. 6. Boyama günü I DİKKAT: Fiksasyon tamponu Paraformaldehit içerir. Paraformaldehit göz hasarına, cilt tahrişine ve organ toksisitesine neden olabilir. İyi havalandırılan bir alanda çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. 14. günde ortam numunelerinin toplanmasını takiben, Şekil 1C’de gösterildiği gibi, boyanacak her bir oyuğa 300 μL fiksasyon tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. En az 2 kuyu boyayın. 4 °C’de 20-60 dakika inkübe edin. 45 mL 1x PBS’ye 5 mL 10x stok çözeltisi ekleyerek 1x geçirgenleştirme tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).NOT: 1x geçirgenlik tamponu 4°C’de 1 ay saklanabilir. Buz üzerinde 300 μL 1x geçirgenlik tamponu ile 2 kez yıkayınız. Buz üzerinde 1x geçirgenleştirme tamponunda 1:1000 seyreltme kullanarak 300 μL primer antikor sitokeratin 18 ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).NOT: Minimal olarak, yalnızca ikincil bir antikor kontrolü için 1x geçirgenlik tamponu ile bir kuyu inkübe edin. 4 °C’de 16-24 saat inkübe edin. 7. Boyama günü II Ertesi gün, birincil antikoru pipetleme veya vakum aspirasyonu ile çıkarın. Buz üzerinde 1x geçirgenlik tamponu kuyusu başına 300 μL ile 2 kez yıkayın. 1x geçirgenleştirme tamponunda 1:500 seyreltme kullanarak 300 μL floresan ikincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (yalnızca ikincil kontrol dahil).NOT: Floresan antikorları kullanırken ışıktan kaçının. Karanlıkta 4 °C’de 30-45 dakika inkübe edin. İkincil antikoru pipetleme veya vakum aspirasyonu ile çıkarın. Buz üzerinde 1x geçirgenlik tamponu kuyusu başına 300 μL ile 2 kez yıkayın. 1x PBS’nin kuyusu başına 300 μL ile 1 kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 150 μL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) montaj ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karanlıkta RT’de 15 dakika inkübe edin.NOT: Plaka parafilme sarılabilir ve 4 °C’de karanlıkta 1 hafta saklanabilir. Floresan mikroskop altında görüntüleyin. 10x objektif lensi kullanarak her bir kuyucuk için her bir floresan kanalın 5 görüntüsünü yakalayın (bir görüntünün ölçek çubuğuna sahip olduğundan emin olun).NOT: DAPI, 358 nm/461 nm’lik bir uyarma/emisyona sahiptir. Hem DAPI hem de ikincil antikor floroforu için uygun algılama filtreleriyle donatılmış bir floresan mikroskobu kullanın. 8. ImageJ analizi (Şekil 2) NOT: ImageJ Sürüm 1.52a veya üzerinin kullanılması önerilir. ImageJ’de ölçek çubuğu içeren bir görüntü açın. Düz Çizgi simgesine tıklayın ve ölçek çubuğunun tam uzunluğuna bir çizgi çizin [Şekil 2 (1)]NOT: Gerekirse, yakınlaştırmak veya uzaklaştırmak için Camı Büyüt simgesine tıklayın. Analiz sekmesine tıklayın. Ölçeği Ayarla’yı vurgulayın ve tıklayın. Bilinen Uzaklık’ı ölçek çubuğunun uzaklığına değiştirin. Uzunluk Birimleri’ni ölçek çubuğunun birimleriyle değiştirin. Global’i işaretleyerek ayarları genel olarak uygulayın. Ölçeği ayarlamak için Tamam’ı tıklatın.NOT: Bu ayar uygulandıktan sonra, açılan her görüntü, kullanıcı tarafından girilen birimlerde görüş alanının hesaplanan alanını gösterecektir. ImageJ’de yalnızca DAPI görüntüsü açın. İşlem sekmesine tıklayın ve Arka Planı Çıkar’ı vurgulayın. Lekelenmemiş alanlar siyah olana kadar arka planı bir seferde 50 piksel kaldırın.NOT: Görüntü arka plan içermiyorsa, bu adım gerekli değildir. Görüntü sekmesine tıklayın ve Tür’ü vurgulayın. Görüntüyü gri tonlamalı yapmak için 8 bit’e tıklayın [Şekil 2 (2)]. Tüm DAPI parçacıklarını dahil etmek için görüntüyü manuel veya otomatik olarak eşikleyin (eşiği manuel olarak aşmamaya dikkat edin) [Şekil 2 (3)]. Image ( Görüntü ) sekmesini tıklatın ve Adjust (Ayarla) seçeneğini vurgulayın. Eşik’i tıklayın. Tamamlandığında Uygula’yı tıklayın. İşlem sekmesine tıklayın ve İkili’yi vurgulayın. Watershed’i tıklayın. Analiz sekmesine tıklayın ve Parçacıkları Analiz Et’i vurgulayın /tıklayın [Şekil 2 (4)]. Boyutu 5-Sonsuz ve Daireselliği 0,00-1,00 olarak ayarlayın. Göster açılır sekmesinde Anahatlar’ı seçin. Sonuçları Görüntüle, Özetle ve Delikleri Dahil Et işaretli olduğundan emin olun. Tamam’a tıklayın.NOT: Eşikleme arka plan pikselleri veriyorsa, istenen parçacık aralığı ayarlanabilir. Sayım sonucunu TOPLAM DAPI olarak kaydedin. ImageJ’de birleştirilmiş bir Cytokeratin 18/DAPI görüntüsü açın. Sitokeratin 18 için boyanmamış tüm DAPI parçacıklarını manuel olarak saymak için Çok Noktalı [Şekil 2 (5)] simgesini kullanın. Sonucu BESLEYİCİ HÜCRELERİ olarak kaydedin. Hepatosit DAPI’yi belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın.Hepatosit DAPI = Toplam DAPI – Besleyici Hücre DAPI 9. Toplam bağlı hepatositlerin kantitasyonu ve bağlanma yüzdesi (Plateabilite) Aşağıdaki denklemi kullanarak 24 oyuklu kültür alanı için bir ölçek faktörü oluşturun. Görüş alanı ölçümleri, açılan her görüntünün üst kısmında bulunabilir [Şekil 2 (2), yeşil kutu]. Aşağıdaki denklemi kullanarak toplam bağlı hepatositleri hesaplayın.Bağlı Hepatositler = Ölçek faktörü × Hepatosit DAPI Aşağıdaki denklemi kullanarak hepatositlerin bağlanma yüzdesini hesaplayın. 10. Albümin tahlili 1:200’de seyreltilmiş numuneler üzerinde bir sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak albümin üretimini ölçün.NOT: Doğruluk için kullanıcı, numunelerin standart eğri doğrusal aralığına düştüğünü onaylar. Belirtilen kit, testi gerçekleştirmek için tüm malzemeleri ve talimatları sağlar. Aşağıdaki denklemi kullanarak numune konsantrasyonlarını bağlı hepatositlere normalleştirin. 11. Üre testi DİKKAT: Kan üre azotu (BUN) asit reaktifi sülfürik asit içerir. BUN asit reaktifindeki sülfürik asit konsantrasyonu aşındırıcı olarak kabul edilir. Yutmayın. İyi havalandırılan bir alanda çalışın ve uygun KKD giyin. Üre sentezi, modifiye edilmiş bir diasetil monoksim yöntemi kullanılarak ölçülür (bkz. Malzeme Tablosu). Standart #1 (100 μg / mL) yapmak için 53.3 μL 75 mg / dL üre 346.7 μL tam kültür ortamına seyreltin Tüpleri 2-8 olarak etiketleyin ve üre tahlili standartlarını oluşturmak için 1:2 seri seyreltme kullanın (Tablo 1). Siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 10 μL numune veya standart ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Numune içeren her bir kuyucuğa 150 μL BUN reaktifi ekleyin. BUN renk reaktifinin 1/3’ünü 2/3 BUN asit reaktifi ile karıştırarak BUN reaktifini hazırlayın. Hesaplamalara yardımcı olması için aşağıdaki denklemi kullanın.BUN renk reaktifi (mL) = Toplam BUN Reaktifi Gereken × 0.333BUN asit reaktifi (mL) = Gereken Toplam BUN Reaktifi × 0.667 Plakayı 60 °C’de bir fırında veya inkübatörde 90 dakika inkübe edin. Plaka absorbansını hemen 540 nm ve 650 nm’de okuyun. Tüm örneklerden ve standartlardan boşluk ve arka plan absorbansını (650 nm) çıkararak standart bir eğri oluşturun. Doğrusal regresyon analizi ile en uygun çizgiyi oluşturun. Standart eğriden bilinmeyen numune konsantrasyonunu belirleyin. Aşağıdaki denklemi kullanarak numune konsantrasyonlarını bağlı hepatositlere normalleştirin.

Representative Results

Hepatik kültür sisteminin genel kaplama, kültürleme ve temel işlevsellik testi yöntemi, Şekil 1’de gösterildiği gibi ortak birincil hücre kültürü tekniklerini ve analizini içerir. Hepatosit bağlanması ve yüzde plateabilite, 14. günde, Sitokeratin 18 ve DAPI boyamanın en az beş görüntüsünün ImageJ analizi kullanılarak hesaplandı (Şekil 2). Besleyici hücrelerle kültürlenen PHH’lerin temsili görüntüleri Şekil 3’te gösterilmektedir. Çeşitli hepatik tohumlama yoğunlukları, tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak görsel birleşme farklılıkları gösterdi ve 14 günlük kültür için tipik hepatik, küboidal morfolojiyi korudu. Test edilen her tohumlama yoğunluğu için hepatosit donör lotları A ve B’nin görüntüleri yakalandı (Şekil 4A). Donör B için ortalama yüzde plateabilite (.04 ± %3.99, 198.552 ± 49.885 PHH), kullanılan tüm tohumlama yoğunluklarında donör A’dan (.08 ± %6.67, 146.128 ± 33.063 PHH) daha yüksekti (Şekil 4B). Donör A, 250.000-300.000 PHH/kuyu (.75 ± %9.64) ile karşılaştırıldığında 150.000 PHH/kuyu (.07 ± .87) kullanarak önemli ölçüde daha yüksek yüzde plateabiliteye sahipti. Donör B, hepatosit yüzdesi plakalanabilirliğinde anlamlı bir fark göstermedi. Donör B, en yüksek tohumlama yoğunluğu olan 300.000 PHH/kuyuda en düşük hepatosit plakalanabilirliğine (.78 ± .25) sahipti. Donör A’ya benzer şekilde, 150.000 PHH / kuyuda tohumlama donörü B, hepatositlerin en yüksek yüzde plakalanabilirliğine sahipti (% 94.75 ±% 15.07). Albümin üretimi ve üre sentezi, 14 günlük kültür periyodu boyunca üç zaman noktasında ölçüldü ve hesaplanan bağlı hepatositlere normalleştirildi. Genel olarak, donör A, donör B’ye kıyasla albümin üretimini artırmıştır (41.32 ± 4.58 μg alb / gün / 106 PHH’ye karşı 34.66 ± 10.03 μg alb / gün / 106 PHH) (Şekil 5). Donör A ve B, sırasıyla 150.000 PHH / kuyu, 45.91 ± 5.96 μg alb / gün / 106 PHH ve 48.67 ± 20.44 μg alb / gün / 106 PHH ile hepatosit tohumlayan en yüksek albümin üretimine sahipti. Kullanılan tohumlama yoğunluklarında albümin üretiminde önemli bir fark görülmedi. Baudy ve ark.3 tarafından belirtildiği gibi, karaciğer mikrofizyolojik sistemlerinin 14 günlük kültürde ‘den daha az değişiklikle tutarlı albümin üretimini ve üre sentezini sürdürmesi arzu edilir. Varyasyon katsayısı (CV), 7, 10 ve 14. günler için ortalamanın standart sapmaya bölünmesiyle hesaplandı. Tüm örnekler kopyalar halinde çalıştırıldı. 150.000 PHH / kuyuda 14 günlük kültür periyodu boyunca albümin çıktısı için CV, donör A için% 12.24 ve donör B için% 37.97 idi, bu da istenen kriterinin altındaydı. 250.000 ve 300.000 PHH/kuyucukta tohumlandığında hem donör A’da hem de donör B’de albümin üretiminde yüksek bir varyans görülmüştür. Bu tohumlama yoğunluklarında, her iki donör de kültürün 7, 10 ve 14. günleri arasında albümin üretiminde keskin bir düşüş yaşar (CV donörü A, .49 ve donör B, .07). Donör B üre sentezi (95.09 ± 18.91 μg üre/gün/106), 7, 10 ± 14. günlerin ortalaması alındığında donör A’ya (64.92 4.66 μg üre/gün/106 PHH) kıyasla artmıştır (Şekil 6). Donör B (113.49 ± 37.34 μg üre/gün/106 PHH) ve donör A (69.12 ± 17.06 μg üre/gün/106 PHH) sırasıyla 150.000 PHH/kuyu ve 200.000 PHH/kuyu yoğunluğunda tohumlama 14 günlük bir kültür periyodu boyunca en büyük üre sentezine sahipti. Her iki donör lotu da 300.000 PHH / kuyuda en düşük üre çıkışına ve en yüksek CV’ye sahipti. Kullanılan tohumlama yoğunluklarında üre sentezinde önemli bir fark görülmemiştir. Donör A için üre sentezi için en düşük CV, donör B için 250.000 PPH / kuyu (% 23.11) ve 200.000 PHH / kuyu (% 28.26) kültürlendiğinde görülmüştür. Bu sonuçlarla vurgulandığı gibi, belirli bir PHH lotu için optimal tohumlama yoğunluğu, test sırasında istenen birleşme seviyesine ve ölçülen sonuçların doğasına bağlıdır; Daha yüksek tohumlama yoğunluğu her zaman daha yüksek sinyal veya dinamik aralık ile ilişkili olmayabilir. Şekil 1: Besleyici hücrelerle hepatositlerin kaplanması, kültürlenmesi ve fonksiyonel testinin akış şeması. (A) Besleyici hücreler belirli bir çözdürme ortamında çözülür (bkz. Malzeme Tablosu), tam bir kaplama ortamında yeniden süspanse edilir (bkz. Malzeme Tablosu) ve hücreler sayılır. Hücreler seyreltilir, kaplanır ve 37 °C /% 5 CO2’de 60 dakika inkübe edilir. (B) Hepatositler, belirli bir çözdürme ortamında çözülür (Malzeme Tablosuna bakınız), tam bir kaplama ortamında yeniden süspanse edilir ve hücreler sayılır. Hepatositler seyreltilir ve besleyici hücrelerle kaplanır. Hücreler, 37 °C /% 5 CO2’de 2-4 saat inkübe edilir ve kültürün ilk 60 dakikası boyunca her 15 dakikada bir NSEW hareketiyle çalkalanır. Kaplama ortamı, kültürün bakımı için önceden ısıtılmış tam bir kültür ortamı ile değiştirilir (bkz. Kültürler günlük olarak beslenir. (C) 7, 10 ve 14. günlerde, albümin ve üre testi için orta numuneler toplanır. 14. günde numunelerin toplanmasını takiben, hücreler sabitlenir ve 4 ° C’de 16-24 saat Sitokeratin 18 (Malzeme Tablosuna bakınız) antikoru ile boyanır. Ayrıca, uygun bir ikincil antikor içinde inkübe edilirler, yıkanırlar ve yakalama ve görüntü analizi için DAPI ile monte edilirler (bkz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: ImageJ yazılımı kullanılarak görüntü analizi. Yakalanan görüntülerin ImageJ ile işlenmesi. Adım 1: Mikroskoba özgü ölçek çubuğuna dayalı olarak tüm görüntülere bir ölçek uygulanır. Adım 2: görüntü türü değiştirilir. Adım 3: DAPI parçacıklarını seçmek için bir eşik sınırı uygulanır. Adım 4: Partikül analizi yapılır ve sayım kaydedilir. Adım 5: Bağlı besleyici hücrelerin sayısını belirlemek için, çok noktalı araç kullanılarak birleştirilmiş bir görüntü sayılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Besleyici hücrelerle kültürlenen çeşitli hepatik tohumlama yoğunluklarının morfolojisi. 150.000, 200.000, 250.000 ve 300.000 PHH/kuyu hepatik tohumlama yoğunluklarında besleyici hücrelerle (50.000 hücre/kuyu) kültürlenen PHH’lerin 7. ve 14. günlerinde temsili görüntüler. Görüntüler, ters faz kontrast mikroskobu üzerinde 10x objektif lens kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Besleyici hücrelerle kültürlenmiş çeşitli hepatik tohumlama yoğunluklarının Floresan İmmünositokimyası. (A) 150.000, 200.000, 250.000 ve 300.000 PHH/kuyu hepatik tohumlama yoğunluklarında 14. günde Sitokeratin 18 (kırmızı) boyamanın temsili görüntüleri. Her tohumlama yoğunluğu için iki kuyucuk 4 °C’de 30 dakika sabitlendi. Kuyular 16-24 saat 4 ° C’de 1: 1000’de primer antikor ile inkübe edildi. İkincil bir antikor 1:500’de karanlıkta 4 °C’de 30 dakika kullanıldı. DAPI (mavi) nükleer lekesi, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuyulara ilave edildi. Görüntüler, ters çevrilmiş bir floresan mikroskopta 10X objektif lens kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) ImageJ kullanılarak hesaplanan çeşitli hepatik tohumlama yoğunluklarının hesaplanan bağlı hepatositleri ve yüzde plakalanabilirliği. * p ≤ 0.05, 200.000, 250.000 ve 300.000 PHH / kuyu için yüzde plakalanabilirlik. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder (koşul başına n ≥ 5 görüntü). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Besleyici hücrelerle kültürlenen hepatositlerin albümin üretimi. 150.000, 200.000, 250.000 ve 300.000 PHH/kuyuda hepatik tohumlama yoğunluklarından albümin üretimi. Sütunlar, toplam bağlı hepatositlere normalize edilmiş 14 günlük mikrogram albümin / gün ortalamasını temsil eder. Bir satır, 7, 10 ve 14. günler arasındaki CV’yi temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder (kopyalarla koşul başına n ≥ 2 kuyucuk). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Besleyici hücrelerle kültürlenen hepatositlerin üre sentezi. 150.000, 200.000, 250.000 ve 300.000 PHH/kuyuda hepatik tohumlama yoğunluklarından üre sentezi. Sütunlar, toplam bağlı hepatositlere normalize edilmiş 14 günlük ortalama μg üre/günü temsil eder. Bir satır, 7, 10 ve 14. günler arasındaki %CV’yi temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder (kopyalarla koşul başına n ≥ 2 kuyucuk). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Standart (S) # Konsantrasyon (μg/mL) Üre Çözeltisi (μL) Tam Kültür (μL) 1 100 53.375 mg/dL stok 346.7 2 50 100(S1 çözümü) 100 3 25 100(S2 çözümü) 100 4 12.5 100(S3 çözümü) 100 5 6.26 100(S4 çözümü) 100 6 3.125 100(S5 Çözümü) 100 7 1.5625 100(S6 Çözümü) 100 Boş 0 0 100 Tablo 1: Üre standart numune hazırlama. 75 mg/dL stok üre kullanarak 100 μg/mL’lik bir üre çözeltisi hazırlayın. Standart eğri için nihai konsantrasyona ulaşmak için önerilen hacimleri ayırın.

Discussion

Tarif edilen hepatik kültür sistemi, standart doku kültürü enstrümantasyonu ile donatılmış laboratuvarlarda kurulabilir. Besleyici hücrelerle kültürlenen PHH’lerden oluşan sistem, kullanıcının stabil albümin üretimi ve üre sentezi ile en az iki hafta boyunca PHH’leri kültürlemesine izin verir. PHH donör lot değişkenliği nedeniyle, sistemde kullanılmak üzere yalnızca önceden taranmış ve nitelikli PHH’lerin kullanılması önerilir. Bağlı PHH’lerin sayısı donör lotuna ve tohumlama yoğunluğuna göre değişse de, nispi plakalanabilirlik her donör lotunda benzer kalır. Önerilen tohumlama yoğunlukları tavsiye edilirken, yukarıdaki veriler hepatosit tohumlama yoğunluğunun farklı deneysel ihtiyaçlar için ayarlanabileceğini göstermektedir; bununla birlikte, daha fazla sayıda PHH’nin tohumlanmasının daha yüksek veya daha tutarlı fonksiyonel çıktılar sağlamayabileceğine dikkat edilmelidir. Değerlendirilen PHH lotlarının analizi, 150.000 PHH / kuyu ve 200.000 PHH / kuyu daha düşük tohumlama yoğunlukları kullanılarak albümin üretimi ve üre sentezi için en düşük CV’yi gösterdi; Bununla birlikte, herhangi bir tohumlama yoğunluğunda albümin ve üre arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. 250.000 PHH / kuyu ve 300.000 PHH / kuyu daha yüksek tohumlama yoğunlukları, 14 günlük kültür periyodu boyunca albümin ve ürede daha büyük bir azalma gösterir. Plakabilitedeki doğal donör değişkenliği, test edilen donör lotları için 250.000 PHH / kuyu ve 300.000 PHH / kuyuda albümin üretimi ve üre sentezinin tutarlılığını etkileyebilir. Büyük hepatosit sferoidlerine benzer şekilde, TV2D+ sisteminde PHH’lerin aşırı tohumlanması, PHH’lerin uzun vadeli kültürü ve işlevselliği üzerinde olumsuz etkilere sahip olabilir.

Çözdürme, kaplama ve bakımdaki tüm adımlar, başarılı kültür ve veri üretimi için kritik öneme sahiptir; Ancak, deneyimsiz kullanıcıların kaçınabileceği birkaç yaygın hata vardır. PHH’ler, sıcaklık dalgalanması, kayma gerilimi ve havaya maruz kalma 9,10’a bağlı hasara karşı oldukça hassastır. Uzun süreli çözdürme sürelerinden ve aşırı pipetlemeden kaçınmak için PHH’ler çözülürken önlemler alınmalıdır. Bir el dökme yönteminin, bir zamanlayıcının ve su banyosundan buza anında transferin kullanılması, PHH’lerin canlılığını ve plakalanabilirliğini etkileyebilecek bu yaygın hataları azaltacaktır. Ek olarak, tedarik zinciri sorunlarının daha yaygın hale gelmesiyle birlikte, kolajen kaplı plakalar elde etmek zor olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için kollajen tip I (5-10 μg/cm2) ticari solüsyonlar kullanılarak doku kültürü ile muamele edilmiş plakaların manuel olarak kaplanması kullanılabilir; Bununla birlikte, optimum performans ve tutarlılık için önceden kaplanmış kollajen plakaların kullanılması önerilir. Yalnızca besleyici hücre kültüründen PHH’lerin eklenmesine geçiş sürecinde, besleyici hücre tabakasının kurumasını önlemek kritik öneme sahiptir. Besleyici hücrelerin havaya maruz kalmasına asla izin vermeyin. Herhangi bir havaya maruz kalma süresi, uzun vadeli PHH kültürünü olumsuz yönde etkileyecek olan düşük besleyici hücre katmanı kalitesine yol açabilir. Ortam değişiklikleri arasında az miktarda artık ortamın kalmasına izin vermek en iyi uygulamadır. Bazen, PHH’ler izolasyondan kaynaklanan aşırı kalıntılar içerebilir ve bu da morfolojinin görüntülenmesini zorlaştırabilir. Bu soruna yardımcı olmak için, orta bir değişiklikten önce plakayı sallayın ve vakum aspirasyonu kullanın. Son olarak, bir ortam değişikliği gerçekleştirirken, kültürlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek harcanan ortamı dikkatlice aspire edin. Doğrudan hücre katmanına pipetlemeyi önlemek için kuyunun kenarından aşağı doğru taze orta hacimde pipetleyin. Kullanıcı ayrıca önerilen 3 kuyulu değişimi kullanarak her ortam değişiminde havaya maruz kalmaktan kaçınmalıdır (Bölüm 3 ve 4). Ayrıca günlük bir ortam değişikliğinin ideal olduğu ancak gerekli olmadığı da unutulmamalıdır.

Floresan mikroskoplar çoğu laboratuvarda yaygın hale gelse de, belirli görüntü analizi yapmak için gereken yazılım ek masraflara neden olabilir. ImageJ ücretsiz olarak indirilebilir, bu da onu kolay erişilebilir bir görüntü analiz aracı haline getirir. Protokoldeki adımlar, kullanıcının özellikle DAPI boyamanın partikül analizini optimize etmesi gerekebilecek bir temel sağlar; bununla birlikte, floresan görüntüleme yeteneğinin yokluğunda, 14. gündeki PHH bağlantı değerleri, partiye özgü analiz sertifikalarında sağlanır. Zayıf eşikleme, DAPI parçacıklarının yanlış sayılmasına neden olacaktır. Ayrıca, bir boyut hariç tutma ayarlamadan önce tek tek DAPI parçacıklarının yüzey alanını kontrol etmeniz önerilir. Bu, Oval simgesi [Şekil 2 (1), Düzenle sekmesinin altındaki daire simgesi] kullanılarak ve DAPI parçacığını kapsayan bir daire çizilerek elde edilebilir. Analiz sekmesi daha sonra seçilen DAPI parçacığının alanını ölçmek için kullanılabilir. Belirli ölçümler, Analiz sekmesi altındaki Ölçümleri Ayarla kullanılarak seçilebilir [adım 8.9 ve Şekil 2 (4)].

PHH’lerin kültürlenmesine yönelik mevcut yöntemler, geleneksel 2 boyutlu monokültürde hücre bağlanmasını artırmak için kolajen-I gibi kaplamalarınkullanılmasını içerir 11 veya yaygın olarak “sandviç kültürü” olarak adlandırılan bir teknik olan murin bazlı Matrigel gibi hücre dışı bir matris ile kaplamayı içerir12,13,14,15. Sandviç kültürü tekniği, geleneksel monokültüre kıyasla zaman içinde PHH morfolojisini ve polaritesini geliştirirken, her iki yaklaşım da çoğu kaplanabilir PHH için kültürde uzun vadeli fenotipik stabiliteden yoksundur. PHH’leri kültürlemek için kullanılan başka bir yöntem de 3D sferoidler yapmaktır; bununla birlikte, Glicklis ve ark.4 tarafından daha önce belirtildiği gibi, donör değişkenliği nedeniyle sferoid boyutunun tekrarlanabilirliği ile ilgili teknik zorluklar olabilir. Fizyolojik olarak daha uygun bir karaciğer modeli yapmak için çok hücreli modeller geliştirilmiştir. Ware ve ark.7 tarafından tanımlandığı gibi, mikropaternleme, murin fibroblastları ve PHH’lerle çevrili primer insan karaciğer sinüzoid endotel hücrelerinin kullanılması, daha uzun in vitro kültür sürelerini mümkün kılmıştır. Bununla birlikte, mikro modelleme karmaşık ve zaman alıcı bir süreç olabilir ve insan olmayan besleyici hücreler, metabolik sinyallerde arka plana katkıda bulunabilir ve bu platformun belirli uygulamalarda kullanımını sınırlayabilir. Hepatositlerin ko-kültürü için besleyici hücreler olarak insan ve sıçan dermal fibroblastları ve sığır aort endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli karaciğer dışı hücrelerin kullanımı, karaciğer kökenli besleyici hücrelerin ko-kültürlerine benzer albümin sekresyonu ve sıkı bağlantı oluşumu göstermiştir16. Bununla birlikte, bu sistemdeki PHH’lerin stabilitesi ve işlevselliği üzerindeki etkiyi daha iyi anlamak için TV2D+ karaciğer olmayan besleyici hücreler ile kültürdeki PHH’ler arasındaki etkileşim mekanizmasının daha fazla araştırılması gerekmektedir. Daha önce Weaver ve ark.8 tarafından tarif edilen kültür sistemi, hepatik kolonilerde PHH’leri 42 güne kadar başarılı bir şekilde kültürleyebilir ve geniş safra kanalı ağları oluşturabilir. Bu sistemde kültürlenen PHH’ler, Sitokrom 1A2, 2B6 ve 3A4 aktivitesi ve Üridin 5′-difosfo-glukuronosiltransferaz (UGT) bazlı enzim aktivitesi, faz I ve II metabolit oluşumu, albümin üretimi ve üre sentezi dahil olmak üzere temel hepatik işlevselliği korudu in vitro Matrigel olmadan en az 22 gün. Bu kültür sistemi, farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için herhangi bir laboratuvara kolayca uyarlanabilen kararlı, fizyolojik olarak ilgili çıktılar üretir. TV2D+ sisteminde temel PHH işlevleri korunsa da, 3D küresel modelle doğrudan bir karşılaştırma yapılmamıştır; bununla birlikte, aynı PHH donörlerini kültür sistemleri arasında karşılaştıran gelecekteki çalışmalar, her iki yöntemin sınırlarını ve avantajlarını belirlemede değerli olacaktır.

TV2D+’nın potansiyel uygulamaları arasında düşük cirolu bileşiklerin metabolik klerensinin ve ilaç-ilaç etkileşimlerinin değerlendirilmesi, ilaca bağlı karaciğer hasarı ve zirai kimyasalların risk değerlendirmesi yer alır. Yeni ve gelişmekte olan ilaçların hepatik klerensini doğru bir şekilde tahmin etmek, düşük cirolu bileşikleri değerlendirirken özellikle zor olan temel hepatoselüler işlevselliğin korunması ile stabil ve uzun süreli bir PHH kültürüne dayanır. Ek olarak, risk değerlendirmesi ve kimyasal kaynaklı karaciğer toksisitesi önemli sağlık sorunlarıdır ve mevcut modeller, akut maruziyete ikincil olabilecek potansiyel kronik kimyasal toksisiteyi doğru bir şekilde değerlendirmek için kültürde uzun vadeli stabilite ve işlevsellik sağlamamaktadır. TV2D + ‘da kültürlenen sağlıklı ve hastalıklı PHH’ler, zaman içinde korunan fonksiyon ve lipid eğiliminde karakteristik farklılıklar gösterdi17. Bu çalışmalar, TV2D+’ı çeşitli farmakolojik ve toksikolojik uygulamalar için umut verici bir araç olarak desteklemektedir.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Mellissa Keller ve Wendy Hetman’a el yazması ve şekil incelemesi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

0.2 µm PES  filter unit  Thermo Fisher Scientific  565-0020 User preference 
15 mL or 50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific  352196 or 352070 User preference 
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific  A-21428 Other secondary antibodies can work
Anti-Cytokeratin 18 antibody  abcam ab24561 Necessary using same dilution
AOPI  Nexcelom  CS2-0106-5mL Used for Cellometer counting 
Biosafety cabinet  Labconoco 3460801 User preference 
Black-walled, clear bottom, 96-well plate  Thermo Fisher Scientific  165305 User preference 
Centrifuge Thermo Fisher Scientific  Sorvall X4R Capable of speeds up to 400 x g
Collagen coated plate, 24-well Greiner Bio-One 662950 Rat tail collagen coating
Counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002 Used for Cellometer counting 
Culture medium  LifeNet Health  MED-TCCM
Culture supplement  LifeNet Health  MED-TCSC
DAPI  Thermo Fisher Scientific  00-4959-52 Contains mounting medium
DPBS (-Ca, -Mg) Thermo Fisher Scientific  14190250 User preference 
Feeder cell supplement  LifeNet Health  MED-TCSA
Feeder cell thawing medium LifeNet Health  MED-FCTM
Fluorescent microscope  Zeiss AxioObserver Z1 Equipped with user specific filters 
Hepatocyte thawing medium LifeNet Health  MED-HHTM4C-50ML
Human albumin ELISA kit  abcam ab108788 Necessary if using same dilution
Human feeder cells LifeNet Health  PHFC24
Humidified incubator  VWR 97025-842 Capable of 5% CO2 
IC Fixation buffer Thermo Fisher Scientific  00-8222-49 Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used
ImageJ National Insitute of Health  Version 1.52a  1.52a or higher 
Inverted phase contrast microscope  Olympus CK40-F100 User preference 
Microcentrifuge tubes VWR 20170-022 User preference 
Micropipettes (various sizes) USA Scientific  ErgoOne User preference 
Permeabilization buffer (10x) Thermo Fisher Scientific  00-8333-56 Other permeabilization buffers can work
Plate reader  BMG Labtech CLARIOstar Capable of reading absorbance 450-640 nm
Plating medium  LifeNet Health  MED-TCPM
Plating supplement  LifeNet Health  MED-TCSB
Primary human hepatocytes  LifeNet Health  various  Catalog number may vary based on lot number
Secondary antibody  Thermo Fisher Scientific  A-21428 User preference 
Serological pipet controller Gilson  F110120 User preference 
Storage bottle 100–500 mL  VWR 76311-770 User preference 
Urea Nitrogen (BUN) Test  Stanbio 0580-250
Water bath PolyScience WBE05 Capable for use at 37 °C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  2. Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity. Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).
  3. Baudy, A. R., et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).
  4. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  5. Khetani, S. R., et al. Microengineered liver tissues for drug testing. Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).
  6. Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. Latest impact of engineered human liver platforms on drug development. APL Bioengineering. 5 (3), 031506 (2021).
  7. Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).
  8. Weaver, J. R., et al. The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system. Toxicology In Vitro. 86, 105504 (2023).
  9. Li, W., et al. Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).
  10. Thompson, S. M., et al. Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study. Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).
  11. Mooney, D., et al. Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix. Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).
  12. Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).
  13. Hamilton, G. A., et al. Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions. Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).
  14. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  15. Sivaraman, A., et al. A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  16. Goulet, F., Normand, C., Morin, O. Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes. Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).
  17. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. , 4283 (2023).

Tags

Hepatic Culture SystemPrimary Human HepatocytesIn Vitro PlatformDrug DevelopmentPharmacokineticsMetabolic ClearancePhenotypic StabilityReproducibilityTruVivo2D+ Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Odanga, J. J., Gianulis, E., Whaley, L., LeCluyse, E. L., Presnell, S., Weaver, J. R. An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications. J. Vis. Exp. (200), e65992, doi:10.3791/65992 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image