약물 개발 응용 분야를 위한 모든 인간 간 배양 시스템

이 프로토콜은 Lifenet Health의 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 원고에는 인간 참가자를 대상으로 한 연구나 저자가 수행한 동물 연구가 포함되어 있지 않습니다. 모든 세포는 Lifenet Health의 연구 목적으로 완전히 동의한 기증자 조직에서 분리되었습니다. 1. 배지 준비 각 피더 셀 해동 배지, 보충제 A, 보충제 B 및 보충제 C( 재료 표 참조)를 37°C 수조 또는 4°C에서 16-24시간 동안 해동합니다. 피더 셀 해동 배지의 전체 병(10mL)을 15mL 또는 50mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.참고: 세포 펠릿의 크기는 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 더 쉽게 볼 수 있습니다. 4.5mL의 보충제 B와 11mL의 보충제 A를 도금 매체(75mL) 한 병에 첨가하여( 재료 표 참조) 완전한 도금 매체를 만듭니다.알림: 완전한 도금 매체의 농도는 FBS <5% v/v입니다. 별도의 병에 배양 배지 100mL( 재료 표 참조), 보충 보충제 C 1mL 및 보충제 A 14mL를 추가하여 완전한 배양 배지를 만듭니다.참고: 완전 배양 배지의 농도는 FBS <1% v/v입니다. 남은 보충제 C와 보충제 A를 -20°C에서 2주차 배지 준비까지 보관합니다.알림: 동결-해동 주기를 반복하면 보충제의 유통 기한이 단축됩니다. 한 번만 동결-해동하는 것이 좋습니다. 사용하기 전에 10mL의 공급세포 해동 배지, 간세포 해동 배지, 완전 도금 배지 및 완전 배양 배지를 37°C 수조에서 20-30분 동안 데우십시오. 2. 인간 공급 세포의 해동, 계수 및 도금(그림 1A) PHH를 파종하기 약 1시간 전에 공급기 세포를 배양합니다. 37°C 수조에서 1-2분 동안 공급기 세포( 재료 표 참조)를 해동합니다.알림: 해동을 모니터링하고 뒤집었을 때 액체가 냉동 비중에서 느슨해질 때 바이알을 제거하여 장기간 노출(예: >2분)을 피하십시오. 해동 직후 피더 셀을 얼음 위에 놓습니다. 무균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛(BSC)에서 갓 해동된 세포를 10mL의 공급 세포 해동 배지에 추가합니다. 1000μL 피펫을 사용하여 1mL의 셀/해동 배지 현탁액으로 바이알을 한 번 세척하고 수집합니다. 실온(RT)에서 400 x g 에서 4분 동안 회전합니다. 피펫팅 또는 진공 흡인으로 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 조심스럽게 폐기하십시오. 세포 펠릿을 1mL의 완전한 도금 매체에 재현탁시키고 공급 세포를 계수합니다.알림: 피더 세포는 자동 세포 카운터에서 acridine orange 및 propidium iodide(AOPI)를 사용하거나 혈구계를 사용하여 trypan blue를 사용하여 계수할 수 있습니다. 세포 수는 기술 및 사용자에 따라 다를 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 중복 샘플을 계수하고 선택한 방법론에서 일관성을 유지하십시오. 전체 도금 배지를 사용하여 셀 현탁액을 100,000 cells/mL로 희석합니다. 희석된 세포 현탁액의 웰당 500μL(50,000세포)를 콜라겐 코팅된 24웰 플레이트에 플레이트합니다( 재료 표 참조). N-S 방향으로 앞뒤로 2회 움직인 후 동일한 동작 E-W를 사용하여 북쪽(N)-남쪽(S)-동쪽(E)-서쪽(W) 동작으로 플레이트를 흔듭니다. 이 흔들기 프로토콜을 2번 더 반복하여 총 3라운드를 진행합니다.알림: 세포 분포를 돕는 동안 플레이트 뚜껑에 튀지 않도록 적당한 힘을 사용하여 흔들기를 수행합니다(비디오 참조). 37 °C/5%CO2 에서 60분 동안 배양합니다. 간세포 해동을 진행하기 전에 feeder cell attachment를 확인합니다.알림: 허용되는 피더 셀 부착은 시각적으로 약 50% 합류합니다. 3. 1차 인간 간세포의 해동, 계수 및 도금(그림 1B) 30분 동안 공급된 세포 배양 후 0.2μm 폴리에테르설폰(PES) 필터 장치를 통해 예열된 간세포 해동 배지를 여과합니다. PHH를 37°C 수조에서 1-2분 동안 해동합니다.알림: 해동을 모니터링하고 뒤집었을 때 액체가 냉동 비중에서 느슨해질 때 바이알을 제거하여 장기간 노출(예: >2분)을 피하십시오. 해동 직후 PHH를 얼음 위에 놓습니다. BSC에서 PHH 현탁액을 간세포 해동 배지에 붓습니다.참고: 가능하면 PHH 셀 현탁액을 피펫팅하지 마십시오. 해동된 PHH를 극저온 매질에서 해동 매체로 이송하는 동안 피펫팅을 수행하지 않는 것이 가장 중요합니다. 1000μL 피펫을 사용하여 1mL의 간세포/해동 배지 현탁액을 바이알에 다시 부드럽게 피펫팅하고 세척액을 다시 해동 배지에 부어 세척액을 수집하여 바이알을 3-4회 세척합니다. 캡을 씌우고 해동된 PHH 서스펜션을 5회 부드럽게 뒤집습니다. RT에서 100 x g 에서 8분 동안 회전합니다. 피펫팅 또는 진공 흡인으로 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 조심스럽게 폐기하십시오. 원뿔형 튜브의 벽에 3mL의 완전한 도금 매체를 추가합니다. 원뿔형 튜브를 좌우로 흔들어 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 재현탁된 간세포에 5mL의 완전한 도금 배지를 추가합니다. PHH를 계산합니다.참고: PHH는 자동 세포 카운터에서 AOPI를 사용하거나 혈구계를 사용하여 트리판 블루를 사용하여 계수할 수 있습니다. 세포 수는 기술 및 사용자에 따라 다를 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 중복 샘플을 계수하고 선택한 방법론에서 일관성을 유지하십시오. 완전한 도금 배지를 사용하여 셀 현탁액을 원하는 파종 밀도(300,000-600,000PHHs/mL)로 희석합니다.참고: 최적의 간세포 파종 밀도는 로트마다 다를 수 있습니다. 주어진 로트에 대한 권장 파종 밀도는 분석 증명서(COA)에 제공됩니다. 아래 방정식을 사용하여 24웰 플레이트의 간세포/mL를 측정합니다. 도금된 피더 셀에서 피펫팅 또는 진공 흡입을 통해 배지를 제거합니다.알림: 공급 셀의 생존 가능성을 보장하려면 한 번에 3개 이하의 웰을 교체하는 것이 좋습니다. 즉시 희석된 간세포 현탁액의 웰당 500μL(150,000-300,000 세포)를 공급세포가 들어 있는 사전 코팅된 콜라겐 24웰 플레이트에 플레이트합니다. N-S 방향으로 앞뒤로 2회 움직인 후 동일한 동작 E-W를 사용하여 N-S-E-W 동작으로 플레이트를 흔듭니다. 이 흔들기 프로토콜을 2번 더 반복하여 총 3라운드를 진행합니다.알림: 세포 분포를 도우면서 플레이트 뚜껑에 튀지 않도록 적당한 힘을 사용하여 흔들어 주십시오. 37 °C/5% CO2 에서 2-4 시간 동안 배양합니다. 배양의 처음 60분 동안 위의 15단계와 같이 NSEW 동작으로 3.15분마다 접시를 흔듭니다. 배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 BSC에 넣습니다. 플레이트를 흔들고 피펫팅 또는 진공 흡입으로 전체 도금 매체를 제거합니다.참고: 배양액의 생존 가능성을 보장하려면 한 번에 3개 이하의 웰을 교체하는 것이 좋습니다. 즉시 500μL의 예열된 완전 배양 배지를 각 웰에 추가합니다. 4. 유지 보수 분취액 및 37°C 수조에서 20-30분 동안 사전 예열된 완전 배양 배지. 24웰 플레이트 1개에 약 13.5mL의 배지가 필요합니다. 매일 500 μL의 신선하고 예열된 완전 배양 배지를 웰당 배양액에 공급합니다.참고: 배양액의 생존 가능성을 보장하려면 한 번에 3개 이하의 웰을 교체하는 것이 좋습니다. 7일마다 신선한 완전 배양 배지를 준비합니다. 5. 알부민 및 요소 측정을 위한 배양 상청액 샘플 수집 7일, 10일, 14일째에 그림 1C와 같이 원하는 샘플 웰에서 마이크로 원심분리기 튜브로 500μL의 배지를 수집합니다. 샘플을 320 x g 에서 4°C에서 10분 동안 회전시켜 파편을 펠릿으로 만듭니다. 피펫을 사용하여 시료 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 펠릿이 파손되지 않도록 합니다. 알부민 및/또는 요소 분석에서 샘플을 실행합니다(각각 섹션 10 및 11 참조).참고: 샘플은 -20 °C에서 -80 °C까지 2주 동안 보관할 수 있습니다. 6. 염색일 I 주의: 고정 버퍼에는 파라포름알데히드가 포함되어 있습니다. 파라포름알데히드는 눈 손상, 피부 자극 및 장기 독성을 유발할 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 14일째에 배지 샘플을 채취한 후 그림 1C와 같이 염색할 각 웰에 300μL의 고정 완충액(재료 표 참조)을 추가합니다. 최소 2개의 웰을 염색합니다. 4 °C에서 20-60분 동안 배양합니다. 1x PBS 45mL에 5mL의 10x 원액을 첨가하여 1x 투과화 완충액( 재료 표 참조)을 준비합니다( 재료 표 참조).참고: 1x 투과화 버퍼는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 얼음 위에서 300μL의 1x 투과화 완충액으로 2회 세척합니다. 얼음 위의 1x 투과화 완충액에 1:1000 희석을 사용하여 300μL의 1차 항체 사이토케라틴 18( 재료 표 참조)을 추가합니다.NOTE: 최소한으로, 2차 항체 전용 대조군을 위해서만 1x 투과화 완충액으로 웰 하나를 배양합니다. 4 °C에서 16-24 시간 배양합니다. 7. 염색일 II 다음 날, 피펫팅 또는 진공 흡인으로 1차 항체를 제거합니다. 얼음 위에서 1x 투과화 완충액의 웰당 300μL로 2회 세척합니다. 1x 투과화 완충액에 1:500 희석을 사용하여 300μL의 형광 2차 항체( 재료 표 참조)를 추가합니다(2차 전용 대조군 포함).알림: 형광 항체를 사용할 때는 빛을 피하십시오. 어두운 곳에서 4 °C에서 30-45분 동안 배양합니다. 피펫팅 또는 진공 흡인으로 2차 항체를 제거합니다. 얼음 위에서 1x 투과화 완충액의 웰당 300μL로 2회 세척합니다. 1x PBS의 웰당 300μL로 1회 세척합니다. 150μL의 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 장착 배지( 재료 표 참조)를 각 웰에 추가하고 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 배양합니다.알림: 플레이트는 파라필름으로 싸서 어두운 곳에서 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 형광 현미경으로 본 모습. 10x 대물 렌즈를 사용하여 각 웰에 대한 각 특정 형광 채널의 이미지 5개를 캡처합니다(하나의 이미지에 스케일 바가 있는지 확인).참고: DAPI의 여기/방출은 358nm/461nm입니다. DAPI와 2차 항체 형광단 모두에 적합한 검출 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하십시오. 8. ImageJ 분석(그림 2) 참고: ImageJ 버전 1.52a 이상을 사용하는 것이 좋습니다. ImageJ에서 축척 막대가 포함된 이미지를 엽니다. 직선 아이콘을 클릭하고 축척 막대의 정확한 길이까지 선을 그립니다[그림 2 (1)]참고: 필요한 경우 확대 유리 아이콘을 클릭하여 확대 또는 축소합니다. 분석 탭을 클릭합니다. 강조 표시하고 배율 설정을 클릭합니다. 알려진 거리를 축척 막대의 거리로 변경합니다. 길이 단위를 축척 막대의 단위로 변경합니다. Global(전역)을 선택하여 설정을 전역으로 적용합니다. 확인을 클릭하여 축척을 설정합니다.알림: 이 설정이 적용되면 열린 모든 이미지에 필드의 계산된 영역이 표시됩니다.view 사용자가 입력한 단위로. ImageJ에서 DAPI 전용 이미지를 엽니다. 프로세스(Process ) 탭을 클릭하고 배경 빼기(Subtract Background)를 강조 표시합니다. 얼룩지지 않은 영역이 검은색이 될 때까지 배경을 한 번에 50픽셀씩 제거합니다.참고: 이미지에 배경이 포함되어 있지 않으면 이 단계가 필요하지 않습니다. 이미지(Image) 탭을 클릭하고 유형(Type)을 강조 표시합니다. 8비트를 클릭하여 이미지를 회색조로 만듭니다[그림 2(2)]. 모든 DAPI 입자를 포함하도록 이미지를 수동 또는 자동으로 임계값으로 설정합니다(임계값을 수동으로 초과하지 않도록 주의). 이미지(Image) 탭을 클릭하고 조정(Adjust)을 선택합니다. 임계값을 클릭합니다. 완료되면 Apply(적용)를 클릭합니다. 프로세스( Process ) 탭을 클릭하고 바이너리(Binary)를 강조 표시합니다. 유역을 클릭합니다. Analyze( 분석 ) 탭을 클릭하고 Analyze Particles(입자 분석 )를 강조 표시/클릭합니다[그림 2 (4)]. 크기( Size ) 를 5-무한대(5-infinity ) 로, 원형도(Circularity ) 를 0.00-1.00 으로 설정합니다. 표시( Show ) 드롭다운 탭에서 윤곽선(Outlines)을 선택합니다. 결과 표시(Display Results), 요약(Summarize) 및 구멍 포함(Include Holes) 이 선택되어 있는지 확인합니다. 확인을 클릭합니다.참고: 임계값 설정이 배경 픽셀을 생성하는 경우 원하는 입자 범위를 조정할 수 있습니다. 카운트 결과를 TOTAL DAPI로 기록합니다. ImageJ에서 병합된 Cytokeratin 18/DAPI 이미지를 엽니다. Multi-Point [그림 2 (5)] 아이콘을 사용하여 Cytokeratin 18에 대해 염색되지 않은 모든 DAPI 입자를 수동으로 계수합니다. 결과를 FEEDER CELLS로 기록합니다. 아래 방정식을 사용하여 간세포 DAPI를 결정합니다.간세포 DAPI = 총 DAPI – 피더 셀 DAPI 9. 총 부착 간세포의 정량 및 부착률(Plateability) 아래 방정식을 사용하여 24웰 배양 영역에 대한 축척 계수를 생성합니다. 시야 측정은 열린 각 이미지의 상단에서 찾을 수 있습니다[그림 2 (2), 녹색 상자]. 아래 방정식을 사용하여 부착된 총 간세포를 계산합니다.부착된 간세포 = 배율 계수 × 간세포 DAPI 아래 방정식을 사용하여 간세포의 부착률을 계산합니다. 10. 알부민 분석 1:200으로 희석된 샘플에서 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)( 재료 표 참조)을 사용하여 알부민 생산을 측정합니다.알림: 정확도를 위해 사용자는 샘플이 표준 곡선 선형 범위 내에 있는지 확인합니다. 지정된 키트는 분석을 수행하기 위한 모든 재료와 지침을 제공합니다. 아래 방정식을 사용하여 부착된 간세포에 대한 샘플 농도를 정규화합니다. 11. 우레아 분석 주의: 혈액 요소 질소(BUN) 산 시약에는 황산이 포함되어 있습니다. BUN 산 시약의 황산 농도는 부식성으로 간주됩니다. 섭취하지 마십시오. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고 적절한 PPE를 착용하십시오. 요소 합성은 변형된 디아세틸 모노심 방법을 사용하여 측정됩니다( 재료 표 참조). 75mg/dL 요소 53.3μL를 346.7μL의 완전 배양 배지에 희석하여 표준 #1(100μg/mL)을 만듭니다. 튜브 2-8에 라벨을 붙이고 1:2 연속 희석을 사용하여 요소 분석 표준물질을 만듭니다(표 1). 10μL의 시료 또는 표준물질을 검은색 벽의 투명한 바닥 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다( 재료 표 참조). 샘플이 들어 있는 각 웰에 150μL의 BUN 시약을 추가합니다. BUN 컬러 시약 1/3과 BUN 산 시약 2/3을 혼합하여 BUN 시약을 준비합니다. 아래 방정식을 사용하여 계산을 지원합니다.BUN 색상 시약 (mL) = 필요한 총 BUN 시약 × 0.333BUN 산 시약 (mL) = 필요한 총 BUN 시약 × 0.667 60°C의 오븐 또는 인큐베이터에서 90분 동안 플레이트를 배양합니다. 540 nm 및 650 nm에서 플레이트 흡광도를 즉시 판독합니다. 모든 샘플과 표준물질에서 블랭크 흡광도와 배경 흡광도(650nm)를 빼서 표준 곡선을 만듭니다. 선형 회귀 분석을 통해 최적선을 생성합니다. 표준 곡선에서 알려지지 않은 시료 농도를 측정합니다. 아래 방정식을 사용하여 부착된 간세포에 대한 샘플 농도를 정규화합니다.