Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Cilde veya kaslar, kemik ve iç organlar dahil olmak üzere diğer vücut yapılarına etki eden mekanik, termal ve kimyasal uyaranların sinirsel kodlaması olan somatosensation, bu yapıları innerve eden birincil afferent nöronlardaki aktivite ile başlar¹. Tek birim tabanlı elektrofizyolojik yaklaşımlar, bu süreçte yer alan afferent alt tipler ve bunların uyaran-tepki özelliklerinin zaman içinde nasıl değişebileceği hakkında zengin bilgiler sağlamıştır ^1,2,3. Bununla birlikte, spesifik duyusal modalitelerin nöronların spesifik alt popülasyonları tarafından taşındığını öne süren etiketli çizgi teorisini destekleyen güçlü kanıtlar olsa da, birçok nöron alt popülasyonunun aynı tür mekanik, termal ve kimyasal uyaranlara yanıt verme yeteneği, somatosensoriyel uyaranların çoğunun nöronların çoklu alt popülasyonları tarafından kodlandığını göstermektedir^{4, 5}. Bu nedenle, somatosensasyonun daha iyi anlaşılması, yalnızca yüzlerce olmasa da 10’larca nöronun aktivitesini aynı anda inceleme yeteneği ile gelecektir.

Konfokal ve daha sonra multifoton ve dijital görüntüleme tekniklerinin nispeten yakın zamanda ortaya çıkmasıyla optik yaklaşımlardaki ilerlemeler, nöronal aktivitenin nispeten invaziv olmayan popülasyon düzeyinde analizlerini gerçekleştirme yeteneğini kolaylaştırmıştır ^6,7. Bu teknolojinin uygulanmasındaki son engellerden biri, nöral aktivitenin optik değerlendirmesini sağlayacak araçların geliştirilmesi olmuştur. Bir milisaniyeden daha kısa sürede başlayıp bitebilen bir aksiyon potansiyelinin hızı göz önüne alındığında, bir aksiyon potansiyeli hızında membran potansiyelindeki değişiklikleri takip etme kapasitesine sahip voltaja duyarlı bir boya bu amaç için ideal bir araç olacaktır. Ancak bu alanda muazzam bir ilerleme kaydedilmiş olsa da 7,8,9,10, bu boyaların çoğu için sinyal-gürültü oranı, tek hücre düzeyinde yüzlerce nöronun popülasyon analizini mümkün kılacak kadar yüksek değildir. Alternatif bir yaklaşım olarak, araştırmacılar hücre içi Ca^{2 +} konsantrasyonundaki ([Ca^{2 +}] _i) değişiklikleri izlemeye yöneldiler. Bu stratejiyle ilgili sınırlamalar en başından beri açıktı ve [Ca^{2 +}] _i’deki bir artışın nöral aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olduğu^{gerçeğini içeriyor 11}; voltaj kapılı Ca 2⁺ kanallarının (VGCC’ler) aktivasyonu ile ilişkili Ca²⁺ akışından bağımsız olarak [Ca^{2 +}] _i’de bir artışın meydana ^{gelebileceğini12,13}; bir Ca²⁺ geçici olayının büyüklüğünün ve süresinin, VGCC aktivitesinden bağımsız süreçler tarafından kontrol edilebileceğini, 11,12,14; ve Ca²⁺ geçici akımlarının zaman seyrinin, bir aksiyon potansiyelininkinden çok daha fazla^{olduğunu 15}. Bununla birlikte, nöral aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olarak Ca^{2 +} kullanımıyla ilişkili bir dizi önemli avantaj vardır. Bunlardan en önemlisi, hem hücre içi^Ca2+’daki değişimin büyüklüğünü hem de sinyalin hücre zarının iki boyutlu uzayından ziyade sitozolün üç boyutlu uzayından kaynaklandığı gerçeğini yansıtan çoğu Ca²⁺ göstergesiyle ilişkili sinyal-gürültü oranıdır. Ayrıca, genetik olarak kodlanmış Ca²⁺ göstergelerinin (GECI’ler) geliştirilmesiyle, hücrelerin belirli alt popülasyonlarında Ca²⁺ göstergelerinin ekspresyonunu yönlendirmek için genetik stratejilerden yararlanmak mümkündür, bu da bozulmamış preparatlarda popülasyon düzeyinde analizleri kolaylaştırır (örneğin, bkz.¹⁶).

Şu anda farelerde mevcut olan genetik araçların sayısı göz önüne alındığında, GECI’lerin bu türde en yaygın şekilde kullanılması şaşırtıcı olmamalıdır. Duyusal nöronların alt popülasyonlarında yapısal GECI ekspresyonuna sahip fare çizgileri geliştirilmiştir ^7,16,17. Belirli hücre tiplerinde rekombinazları ifade eden fare çizgilerinin geliştirilmesiyle, GECI ekspresyonunu kontrol etmek için daha da karmaşık stratejiler kullanmak mümkündür¹⁵. Bununla birlikte, bu araçlar her zamankinden daha güçlü olsa da, sıçanlar gibi diğer türlerin bazı deneysel sorular için daha uygun olmasının birkaç nedeni vardır. Bunlar, daha küçük farede imkansız olmasa da zor olan bir dizi deneysel manipülasyonu kolaylaştıran daha büyük boyutu içerir; sıçanları nispeten karmaşık davranışsal görevlerde eğitmenin kolaylığı; ve sıçan duyusal nöronlarındaki çeşitli iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerinin ve ekspresyon modellerinin, insan duyusal nöronlarında gözlemlenenlere, insana göre faredeki aynı kanallardan daha benzer olabileceğine dair en azından bazı kanıtlar¹⁸.

Somatosensoriyel uyaranların transdüksiyonu genellikle primer afferentlerin periferik terminallerinde meydana gelirken, periferde başlatılan aksiyon potansiyeli, merkezi sinir sistemine ulaşmadan önce dorsal kök (DRG) veya trigeminal (TG) gangliyonlar olarak adlandırılan primer afferent somataları barındıran yapıdan geçmelidir¹⁹. Birincil afferent akson boyunca yayılan her aksiyon potansiyelinin hücre gövdesini²⁰ istila etmeyeceğine dair kanıtlar olsa da, birincil afferent somatların ana afferent aksona bir T-kavşağı¹⁹ yoluyla bağlanmasının bir sonucu olarak, periferde başlatılan aksiyon potansiyellerinin çoğu soma^21’i istila ediyor gibi görünmektedir. Bu, birincil afferentlerde popülasyon kodlamasını değerlendirmek için GECI’leri kullanırken üç deneysel avantaj sağlar: hücre gövdesinin aksonlara göre büyük boyutu, afferent aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olarak [^Ca2+]_i kullanıldığında sinyalden gürültüye daha da artar; DRG’ye erişim genellikle kolaydır; ve afferent terminallerden uzamsal olarak uzak bir bölgedeki aktivitenin değerlendirilmesi, gangliyonları ortaya çıkarmak için gereken ameliyatın afferent terminallerin uyaran-tepki özellikleri üzerindeki potansiyel etkisini en aza indirir. Bununla birlikte, TG beynin altında (veya paletin üstünde) bulunduğundan, DRG’den çok daha zordur. Ayrıca, DRG ve TG nöronları arasında birçok benzerlik olsa da, büyüyen bir farklılıklar listesi de vardır. Bu, TG^22’deki nöronların kabaca somatotopik organizasyonunu, innerve edilmiş benzersiz yapıları, farklı merkezi terminal sonlandırma modellerini 23,24,25,26 ve şimdi hem gen ekspresyonu ^27,28 hem de fonksiyonel reseptör ekspresyonu^29’daki artan farklılıklar listesini içerir. Ek olarak, periferik ağrı mekanizmalarının tanımlanmasıyla ilgilendiğimiz için, trigeminal sisteme özgü gibi görünen nispeten fazla sayıda ağrı sendromu (örneğin, migren, trigeminal nevralji, ağız yanması sendromu) primer afferentlerde anormal aktivite içeriyor gibi görünen^30,31,32, TG’nin doğrudan incelenmesi gerektiğini düşündürmektedir.

Bu nedenle, TG nöronlarının uyaran-tepki özellikleri farede GECI’lerle çalışılmış olsa da,¹⁶, yukarıda listelenen nedenler sıçanın çeşitli deneysel soruları ele almak için daha uygun bir tür olabileceğini düşündürdüğünden, bu çalışmanın amacı, sıçanlarda TG nöronlarını incelemek için GECI’leri kullanmak için bir yaklaşım geliştirmekti. Bunu başarmak için, periferik sinir sisteminde GECI GCaMP6’ların ekspresyonunu yönlendirmek için viral bir yaklaşım kullandık. Daha sonra TG’ye erişime izin vermek için ön beyni çıkardık. Son olarak, yüze mekanik ve termal uyaranlar uygulanırken, nöronal yanıtlar floresan mikroskobu altında değerlendirildi. Birlikte, bu veriler, birçok eyalette TG’deki değişiklikleri araştırmak için sıçanı kullanma rolünü desteklemekte ve trigeminal sistemdeki duyusal kodlama ile ilgilenen araştırmacılar için araç setini genişletmektedir.