التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات (PRANCE) هو تقنية لتطور البروتين السريع والقوي. تسمح الروبوتات بتوازي التجارب والمراقبة في الوقت الفعلي والتحكم في التغذية الراجعة.
تعمل تقنيات التطور المعجلة بالروبوتات على تحسين موثوقية وسرعة التطور باستخدام التحكم في التغذية المرتدة ، مما يحسن نتائج تجارب تطور البروتين والكائن الحي. في هذه المقالة ، نقدم دليلا لإعداد الأجهزة والبرامج اللازمة لتنفيذ التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات (PRANCE). يجمع PRANCE بين التطور الجزيئي السريع القائم على العاثيات والقدرة على إجراء مئات تجارب التطور المستقلة التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة في وقت واحد. سوف تصف هذه الورقة متطلبات الأجهزة والإعداد ل PRANCE ، بما في ذلك أداة معالجة السوائل ، وقارئ الألواح ، والمضخات المساعدة ، والسخانات ، والحاويات المطبوعة 3D. وصفنا كيفية تكوين روبوت معالجة السوائل ليكون متوافقا مع البرامج مفتوحة المصدر المستندة إلى Python. أخيرا ، نقدم اقتراحات لأول تجربتين يمكن إجراؤهما باستخدام نظام PRANCE الذي تم إنشاؤه حديثا والذي يمارس قدراته ويتحقق من أن النظام جاهز لإجراء تطور متعدد الإرسال. يهدف هذا الدليل إلى أن يكون بمثابة كتيب للتنقل في إعداد المعدات الكبيرة المرتبطة بإجراء التطور المتسارع للروبوتات.
PRANCE هو مزيج من اثنين من تقنيات التطور الموجهة القوية. الأول هو PACE1 ، وهي تقنية جزيئية تجمع بين جولات تنويع الجينات واختيارها بدورة الحياة السريعة للبكتيريا M13 ، مما يتيح حدوث جولات سريعة من التطور بشكل مستمر في ثقافة العاثيات السائلة. هذا الاختيار مدفوع باستخدام دائرة جينية مشفرة بالبلازميد تجمع بين وظيفة البروتين المتطور والتعبير عن pIII ، بروتين معطف الذيل M13 ، وهو ضروري لانتشار العاثيات ، وهذا موضح في الشكل 1. على المستوى التجريبي ، يسمح التخفيف المستمر لثقافة العاثيات السائلة بالاختيار المستمر. وبالتالي يمكن تعديل صرامة الاختيار على مستوى دائرة الجينات وكذلك على المستوى التجريبي من خلال التحكم في معدل تخفيف ثقافة العاثيات. لذلك يمكن تطبيق PACE على أي تحد هندسي للجزيئات الحيوية يوجد له مستشعر جزيئي يمكنه اكتشاف النشاط المطلوب في بكتيريا الإشريكية القولونية للحث على التعبير عن pIII. تشمل التطبيقات تطور ارتباط البروتينوالبروتين 2،3،4 ، وربط البروتين والحمض النووي5 ، وذوبان البروتين6 ، والعديد من الوظائف الأنزيمية المحددة7. والثاني هو التطورالمتسارع بالروبوتات 8,9 ، والذي يستخدم وحدة تحكم في التغذية المرتدة للقضاء على وضعين شائعين للفشل في التطور الموجه: الانقراض ، الذي يحدث عندما تكون البيئة صارمة للغاية ، ونقص التطور ، والذي يحدث عندما تكون البيئة متساهلة للغاية. على عكس المرور التسلسلي للعاثيات كما هو الحال في PANCE (التطور غير المستمر بمساعدة العاثيات)7،10 ، يتضمن التطور “شبه المستمر” المتسارع بالروبوتات سحب سريع يحافظ على الثقافات في مرحلة منتصف السجل ، مما يسمح للسكان بتجربة دورات مستمرة من العدوى والتكاثر. عندما يتم استخدام هاتين التقنيتين معا ، يشار إليهما باسم PRANCE ، للتطور شبه المستمر بمساعدة العاثياتوالروبوتات 8 ، والذي يتيح التطور المستمر القوي والمضاعف والسريع. تم استخدام PRANCE لتطوير البلمرة ، tRNAs ، وتوليفات amino-acyl tRNA والقيام بالتحكم في التغذية المرتدة خلال تلك التطورات لتحسين سرعتها وموثوقيتها8.
هناك العديد من التفاصيل حول إعداد الأجهزة والبرامج ل PRANCE التي تمكن من استخدام البكتيريا على روبوت معالجة السوائل. بدلا من استخدام البرامج الافتراضية التي توفرها الشركة المصنعة للروبوت ، نستخدم حزمة برامج مفتوحة المصدر قائمة على Python11 ، والتي تتيح التنفيذ السريع والمتزامن وبالتالي القدرة على الحفاظ على المفاعلات الحيوية شبه المستمرة في مرحلة منتصف السجل. يمكن تمديد وقت عدم تدخل الباحث إلى عدة أيام من خلال وجود العديد من المكونات الموجودة على سطح السفينة بشكل روتيني ، ويتم تحقيق ذلك من خلال التحكم التلقائي في المضخات التي يمكنها تبييض هذه المكونات وشطفها. يمكن القضاء على التلوث المتبادل للعاثيات عن طريق استخدام روبوت مناولة السوائل الذي لا يستخدم نصائح ملائمة للقوة وتعديل دقيق لإعدادات معالجة السوائل.
على الرغم من الجهود المبذولة لتوحيد المعدات ، من الناحية العملية ، سيكون كل إعداد PRANCE مختلفا بسبب التغييرات في توريد المعدات والأجهزة وإصدار البرامج. نتيجة لذلك ، يظهر كل إعداد PRANCE تحديات إعداد فريدة ، مما يتطلب فهما شاملا للغرض من كل مكون لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها المعيارية الفعالة.
تحدد هذه الطريقة بروتوكولا خطوة بخطوة لإعداد واختبار نظام PRANCE المعمول به. نركز أولا على العناصر الحاسمة للأجهزة والبرامج ثم نفصل الخطوات الأساسية للتحضير وإجراء سلسلة من عمليات الاختبار ، والتي تثبت أن النظام جاهز ل PRANCE.
تتمثل إحدى الميزات الأساسية للأجهزة في التحسين لتقليل مخاطر التلوث المتبادل للعينة أثناء التجارب المتعددة باستخدام البكتيريا. يوصى باستخدام أطراف تمت تصفيتها حصريا مع تقنية طرف الروبوت المتوافقة مع إعادة استخدام الطرف ويعتقد أنها تقلل من الهباء الجوي الناتج أثناء طرد الطرف عن طريق تجنب الأطراف المناسبة. يسمح غسل الأطراف القوي وفقا لهذا البروتوكول بإعادة استخدام الطرف على الرغم من أنه يجب التحقق من كفاية ذلك كجزء من اختبار العدوى على كل نظام. يعتمد التعقيم الذاتي أيضا على إمدادات ثابتة من الماء والتبييض للنظام. يتم تخزينها في خزانات / دلاء وإذا استنفدت ستؤدي إلى ضعف التعقيم الذاتي والتلوث المتبادل السريع. يمكن التقاط صور للخزانات / الدلاء التي تم التقاطها قبل وبعد تشغيل البرنامج لقياس معدل استهلاك معدات الغسيل للمياه والمبيض بالنظر إلى إعداد مضخة معين.
عنصر رئيسي آخر في النظام هو الحفاظ على مرحلة نمو البكتيريا ودرجة الحرارة. يتم إجراء تجارب PRANCE باستخدام سلالة بكتيريا S2060 E. coli (Addgene: # 105064). هذه سلالة تحتوي على بلازميد F مشتقة من K12 محسنة لتقليل الأغشية الحيوية7. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحرير F-plasmid في هذه السلالة بإضافة كاسيت مقاوم للتتراسيكلين لصيانة البلازميد ، luxCDE و luxR لاستكمال مراقبة التلألؤ بوساطة luxAB ، بالإضافة إلى lacZ تحت محفز صدمة العاثية للسماح بالتصور اللوني للويحات. يعد F-pilus المشفر بالبلازميد F ضروريا لعدوى العاثية M13. لذلك يجب استزراع البكتيريا المستخدمة في PACE عند 37 درجة مئوية وفي مرحلة منتصف السجل عندما يتم التعبير عن F-pilus12 وتكون عدوى العاثية M13 وانتشارها وتطورها ممكنة. لتنظيم درجة الحرارة الساكنة ، يمكن استخدام حامل لوحة ساخنة جاهزة. البديل هو ببساطة تسخين الهواء الداخل إلى مرشح HEPA باستخدام سخانات غير مكلفة ، على الرغم من أن هذا غير مستحسن لأنه قد يؤدي إلى تسارع التآكل والتلف على الأجهزة. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي ذلك إلى تسريع تبخر السوائل المساعدة على سطح السفينة ، مثل دلاء التبييض / الماء والمحفز ، عند استخدامها.
تعد معايرة حزم البرامج ضرورية أيضا لوظيفة النظام المناسبة. الاختلافات بين تخطيط سطح البرنامج ومجموعة الروبوت الفعلية هي السبب الأكثر شيوعا لفشل النظام أثناء التشغيل. تعد المعايرة المنتظمة للمضخات المساعدة التي تزود الثقافة البكتيرية والتبييض واستنزاف النظام أمرا حيويا لأن استخدام المضخة التمعجية يمكن أن يؤدي إلى تآكل الأنابيب وتغيرات حجم السوائل.
سيكشف اختبار تشغيل المياه بسرعة عن عدد من مشكلات الإعداد الشائعة ، بما في ذلك إعدادات معالجة السوائل غير الصحيحة ، وتسريبات السوائل / التوصيلات الخاطئة ، وعدم استقرار البرامج. لن يظهر تشغيل المياه الناجح أي تسرب سائل غير متوقع ويعمل بثبات دون أخطاء بين عشية وضحاها. هناك عدد من المشكلات الشائعة التي قد تنشأ أثناء تشغيل المياه مثل الفشل في تنفيذ بعض خطوات معالجة السوائل ، والتقطير من الماصات ، وتوقف البروتوكول في منتصف التشغيل. في حالة الفشل في تنفيذ بعض خطوات معالجة السوائل ، تأكد من تركيب جميع فئات السوائل. تسرد هذه اللزوجة وسرعات السحب المناسبة ويتم ضبطها في برنامج التحكم في الروبوت الذي توفره الشركة المصنعة. إذا كان هناك تقطير من الماصات ، فمن المهم أن تكون إعدادات ذراع سحب الروبوت صحيحة لتمكين السحب النظيف والقضاء على التلوث المتبادل للعاثيات. يتطلب السحب الروبوتي الناجح ، بالإضافة إلى فئات السوائل الصحيحة ، ارتفاعات تخطيط سطح السفينة الصحيحة لجميع أدوات المختبر ، وإزاحات ارتفاع السحب المناسبة المحددة في برنامج طريقة الروبوت PRANCE. قد تتطلب إزاحات الارتفاع هذه ضبطا مباشرا. إذا توقف البروتوكول في منتصف التشغيل ، فغالبا ما يتم إنشاء ذلك بواسطة مجموعة واسعة من الأخطاء التي تشير إلى أن ملف تخطيط سطح السفينة قد لا يتطابق مع تكوين سطح السفينة الفعلي.
سيكشف اختبار التشغيل البكتيري فقط عن مشكلات في إعدادات قارئ الألواح وتصور البيانات في الوقت الفعلي ، ومشاكل التركيز المفرط للتبييض أو الشطف غير الكافي ، واستقرار درجة الحرارة. سيظهر الجري الناجح للبكتيريا فقط توازنا في امتصاص البحيرة خلال الدورات الثلاث الأولى ، يليه امتصاص مستقر طوال مدة الجري. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكشف عن العديد من المشكلات الشائعة. هذه هي الخطوة الأولى حيث يتم رسم البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ اللوحة. قد لا يتم حفظ البيانات الموجودة في قاعدة بيانات قارئ اللوحات بشكل صحيح أو رسمها بشكل صحيح. إذا فشلت البكتيريا في التوازن في امتصاصها ، فقد يشير ذلك إلى أن تركيز التبييض مرتفع للغاية. يمكن أن يؤدي التبييض المفرط أو الغسيل غير الكافي إلى تعقيم التجربة بأكملها ، بدلا من مجرد قطعة من أدوات المختبر. في حالة الاشتباه في ذلك ، يمكن استخدام شرائط الكشف عن المبيض لاختبار البحيرة. يمكن التحقق من استقرار درجة حرارة الثقافة باستخدام مسدس ميزان الحرارة.
يشير اختبار العدوى الناجح إلى أن النظام جاهز لتشغيل PRANCE. يمكن إجراء اختبار العدوى عن طريق تلقيح مجموعة فرعية من البحيرات التي تحتوي على ثقافة بكتيرية. ستعبر هذه البكتيريا عن pIII عند الإصابة بالعاثية المناسبة التي تفتقر إلى جين pIII (ΔgIII) ، مما يسمح بانتشار العاثيات. أحد التوليفات الممكنة للاختبار هو استخدام بكتيريا S2060 المحولة باستخدام بلازميد يعبر عن pIII تحت محفز صدمة العاثية مع أي عاثية ΔgIII. نوصي باستخدام العاثية ΔgIII التي تحمل بوليميراز T7 RNA من النوع البري مع بكتيريا S2060 المحولة ببلازميد ملحق ، حيث يتم تشغيل pIII و luxAB بواسطة مروج T7 (Plasmid pJC173b13) ، كما هو موضح في الشكل 1. يسمح هذا أيضا بمراقبة العدوى بوساطة قارئ اللوحة أثناء تشغيل الاختبار. سيأتي الدليل القاطع على نجاح اختبار العدوى وعدم وجود تلوث متبادل من معايرة العاثيات لبحيرات الاختبار والتحكم. عند استخدام مراسل لوسيفيراز ، فإن زيادة التلألؤ في آبار الاختبار فقط ، كما هو موضح في الشكل 3 ، هي أيضا مؤشر على نجاح عدوى العاثيات وانتشارها. المعيار الذهبي لقياس عيار العاثيات هو مقايسةالبلاك 7. هناك أيضا بروتوكول للقياس الكمي M13 بواسطة qPCR7 قد يكون أسرع ، على الرغم من أن هذا لا يميز بين جزيئات العاثيات المعدية وغير المعدية وبالتالي قد يبالغ في تقدير التتر.
يشير البرنامج الرئيسي إلى ملف بيان ، وهو ملف قاعدة بيانات نص عادي ، والذي يملي حجم التخفيف لكل دورة لكل مزرعة تكاثر بالإضافة إلى اختيار أي عدد من المواد الأولية المحتملة للثقافة البكتيرية ، والتي قد تختلف في صرامة الاختيار. بهذه الطريقة ، يحدد ملف البيان العديد من معلمات تشغيل PRANCE. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تحرير هذا الملف أثناء التشغيل إما بواسطة المشغل أو النظام ، مما يعني أنه يمكن إجراء التحكم اليدوي أو التلقائي في التغذية المرتدة.
تكمن فائدة إعداد PRANCE الذي يعمل بكامل طاقته في قدرته على التطور السريع لعدد كبير من السكان في بيئة يتم مراقبتها والتحكم فيها بعناية. يميز التنسيق القائم على اللوحة PRANCE عن التقنيات الأخرى ، مثل استخدام أنظمة أصغر قائمة على التوربيداتالجاهزة 14,15. لا يسهل الإعداد القائم على اللوحة التكامل السهل مع خطوات المعالجة الروبوتية الإضافية فحسب ، بل يسهل أيضا التوافق مع الأدوات المختبرية الأخرى مثل أجهزة الطرد المركزي. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على إجراء التطور المتسارع بشكل متزامن عبر حالات متعددة تقدم بعدا إضافيا للتجربة ، مما يعزز احتمال تحقيق نتائج متنوعة وقوية. يعزز نظام التحكم والتغذية المرتدة الحبيبي المتكامل في PRANCE إمكانية التنبؤ وموثوقية التجربة ، مما يمثل تقدما كبيرا في مجال تقنيات التطور الموجه. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية محدودة في عدد التجارب الموازية التي يمكن أن تجريها. اعتمادا على التكوين ، عادة ما تكون إعدادات PRANCE محدودة إما بسرعة سحب الروبوت أو من خلال مساحة سطح السفينة المتاحة.
يمكن أيضا تطبيق نفس الأجهزة والبرامج المستخدمة في PRANCE على طرق التطور التي لا تتضمن البكتيريا. كما هو موضح في طريقة multi-turbidostats11 ، يمكن استخدام هذه الأداة نفسها حصريا مع البكتيريا ، مما يتيح تجارب التطور التكيفي للجينوم الكامل. هذه القدرة على التكيف توسع نطاق هذه الأداة ، مما يمهد الطريق لأشكال جديدة من التطور المتسارع بالروبوتات.
The authors have nothing to disclose.
نشكر إيما تشوري وكيفن إسفلت على مساعدتهما ونصائحهما في إعداد الأجهزة والبرامج. يتم دعم سمير أودجان وأوسعيد أثير وإريكا ديبينيديكتيس من قبل منحة الباحث المبكر في ستيل بيرلوت. تم دعم هذا العمل من قبل معهد فرانسيس كريك الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (CC2239) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (CC2239) ، وصندوق ويلكوم (CC2239).
3D printed bacterial reservoir "waffle" | – | – | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
Magnetic stir plate | Camlab | SKU – 1189930 | For Auxiliary Fridge |
Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
Suggested pump manufacturers | |||
Company | Catalog number | Notes | Documentation |
Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |