Monitorização da aprendizagem motora fina e associativa em ratinhos utilizando a escada Erasmus
Summary
Este artigo apresenta um protocolo que permite uma avaliação não invasiva e automatizada do desempenho motor fino, bem como da aprendizagem motora adaptativa e associativa frente a desafios, utilizando um aparelho denominado Escada Erasmus. A dificuldade da tarefa pode ser titulada para detectar comprometimento motor que varia de graus maiores a sutis.
Abstract
O comportamento é moldado por ações, e as ações requerem habilidades motoras, como força, coordenação e aprendizagem. Nenhum dos comportamentos essenciais para sustentar a vida seria possível sem a capacidade de transição de uma posição para outra. Infelizmente, as habilidades motoras podem ser comprometidas em uma ampla gama de doenças. Portanto, investigar os mecanismos das funções motoras nos níveis celular, molecular e circuital, bem como compreender os sintomas, as causas e a progressão dos distúrbios motores, é crucial para o desenvolvimento de tratamentos eficazes. Modelos de camundongos são frequentemente empregados para esse fim.
Este artigo descreve um protocolo que permite o monitoramento de vários aspectos do desempenho motor e aprendizagem em camundongos usando uma ferramenta automatizada chamada Erasmus Ladder. O ensaio envolve duas fases: uma fase inicial onde os ratos são treinados para navegar em uma escada horizontal construída de degraus irregulares (“aprendizagem motora fina”), e uma segunda fase onde um obstáculo é apresentado no caminho do animal em movimento. A perturbação pode ser inesperada (“aprendizagem motora desafiada”) ou precedida por um tom auditivo (“aprendizagem motora associativa”). A tarefa é fácil de realizar e é totalmente suportada por software automatizado.
Este relatório mostra como leituras diferentes do teste, quando analisadas com métodos estatísticos sensíveis, permitem o monitoramento fino das habilidades motoras de camundongos usando uma pequena coorte de camundongos. Propomos que o método será altamente sensível para avaliar adaptações motoras impulsionadas por modificações ambientais, bem como déficits motores sutis em estágio inicial em camundongos mutantes com funções motoras comprometidas.
Introduction
Uma variedade de testes tem sido desenvolvida para avaliar fenótipos motores em camundongos. Cada teste fornece informações sobre um aspecto específico do comportamento motor1. Por exemplo, o teste de campo aberto informa sobre locomoção geral e estado de ansiedade; os testes de rotarod e walking beam sobre coordenação e equilíbrio; a análise das pegadas das pegadas diz respeito à marcha; esteira ou roda de corrida em exercício físico forçado ou voluntário; e a roda complexa é sobre aprendizagem de habilidades motoras. Para analisar os fenótipos motores de camundongos, os pesquisadores devem realizar esses testes sequencialmente, o que envolve muito tempo e esforço e, muitas vezes, várias coortes de animais. Se houver informação a nível celular ou de circuito, o investigador normalmente opta por um teste que monitora um aspecto relacionado e segue a partir daí. No entanto, faltam paradigmas que discriminem diferentes aspectos do comportamento motor de forma automatizada.
Este artigo descreve um protocolo para o uso da Escada Erasmus 2,3, um sistema que permite uma avaliação abrangente de uma variedade de características de aprendizagem motora em camundongos. As principais vantagens são a reprodutibilidade e a sensibilidade do método, juntamente com a capacidade de titular a dificuldade motora e separar déficits no desempenho motor de aprendizagem motora associativa prejudicada. O componente principal consiste em uma escada horizontal com degraus alternados altos (H) e baixos (L) equipados com sensores sensíveis ao toque que detectam a posição do mouse na escada. A escada é feita de 2 x 37 degraus (L, 6 mm; H, 12 mm) espaçados 15 mm entre si e posicionados em um padrão alternado esquerda-direita com intervalos de 30 mm (Figura 1A). Os degraus podem ser movidos individualmente para gerar vários níveis de dificuldade, ou seja, criar um obstáculo (elevar os degraus altos em 18 mm). Juntamente com um sistema de registro automatizado e associando modificações do padrão do degrau com estímulos sensoriais, a escada Erasmus testa a aprendizagem motora fina e a adaptação do desempenho motor em resposta a desafios ambientais (aparecimento de um degrau mais alto para simular um obstáculo, um estímulo incondicionado [US]) ou associação com estímulos sensoriais (um tom, um estímulo condicionado [CS]). Os testes envolvem duas fases distintas, cada uma avaliando a melhora no desempenho motor ao longo de 4 dias, durante os quais os camundongos passam por uma sessão de 42 testes consecutivos por dia. Na fase inicial, os ratos são treinados para navegar na escada para avaliar o aprendizado motor “fino” ou “habilidoso”. A segunda fase consiste em ensaios intercalados onde um obstáculo na forma de um degrau mais alto é apresentado no caminho do animal em movimento. A perturbação pode ser inesperada para avaliar a aprendizagem motora “desafiada” (ensaios somente nos EUA) ou anunciada por um tom auditivo para avaliar a aprendizagem motora “associativa” (ensaios pareados).
A escada Erasmus foi desenvolvida há relativamente pouco tempo 2,3. Não tem sido extensivamente utilizado porque a configuração e otimização do protocolo requer esforço concentrado e foi projetado especificamente para avaliar a aprendizagem associativa dependente de cerebelo, sem explorar em detalhes seu potencial para revelar outros déficits motores. Até o momento, foi validado por sua capacidade de desvendar sutis comprometimentos motores ligados à disfunção cerebelar em camundongos3,4,5,6,7,8. Por exemplo, camundongos knockout de conexina36 (Cx36), onde as junções comunicantes estão prejudicadas em neurônios olivares, exibem déficits de disparo devido à falta de acoplamento eletrotônico, mas o fenótipo motor tem sido difícil de identificar. Testes com a escada de Erasmus sugeriram que o papel dos neurônios olivares inferiores em uma tarefa de aprendizagem motora cerebelar é codificar a codificação temporal precisa dos estímulos e facilitar respostas dependentes da aprendizagem a eventos inesperados 3,4. O camundongo knockout Ribonucleoprotein 1 (Fmr1) do Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1, um modelo para a Síndrome do X Frágil (SXF), exibe um comprometimento cognitivo bem conhecido, juntamente com defeitos mais leves na formação da memória de procedimento. Os nocautes Fmr1 não mostraram diferenças significativas nos tempos de passo, erros por tentativa ou melhora do desempenho motor ao longo das sessões na Escada Erasmus, mas falharam em ajustar seu padrão de caminhada ao obstáculo que aparece repentinamente em comparação com seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (WT), confirmando déficits específicos de memória de procedimento e associativa 3,5. Além disso, linhagens mutantes de camundongos específicas para células com defeitos na função cerebelar, incluindo produção de células de Purkinje prejudicada, potencialização e saída de interneurônios ou células de grânulos da camada molecular, exibiram problemas na coordenação motora com aquisição alterada de padrões eficientes de degraus e no número de passos dados para cruzar a escada6. A lesão cerebral neonatal causa déficits de aprendizado cerebelar e disfunção das células de Purkinje, que também podem ser detectados com a Escada de Erasmus 7,8.
Neste vídeo, apresentamos um guia passo a passo abrangente, que detalha a configuração da sala comportamental, o protocolo de teste comportamental e a análise de dados subsequente. Este relatório foi concebido para ser acessível e de fácil utilização e foi concebido especificamente para ajudar os recém-chegados. Este protocolo fornece informações sobre as diferentes fases do treinamento motor e os padrões motores esperados que os camundongos adotam. Finalmente, o artigo propõe um fluxo de trabalho sistemático para a análise dos dados usando uma poderosa abordagem de regressão não-linear, completa com recomendações e sugestões valiosas para adaptar e aplicar o protocolo em outros contextos de pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
A Escada Erasmus apresenta grandes vantagens para a avaliação do fenótipo motor para além das abordagens atuais. O teste é fácil de conduzir, automatizado, reprodutível e permite que os pesquisadores avaliem vários aspectos do comportamento motor separadamente usando uma única coorte de camundongos. No presente estudo, a reprodutibilidade permitiu a geração de dados robustos com um pequeno número de camundongos WT aproveitando as características do dispositivo, o planejamento experimental e os métodos de an…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à técnica audiovisual e produtora de vídeo Rebeca De las Heras Ponce, bem como ao veterinário chefe Gonzalo Moreno del Val, pela supervisão das boas práticas durante a experimentação com camundongos. O trabalho foi financiado por bolsas do Programa de Excelência GVA (2022/8) e da Agência Espanhola de Pesquisa (PID2022143237OB-I00) para Isabel Pérez-Otaño.
Materials
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
Referências
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- . Available from: https://www.noldus.com/erasmusladder (2023)
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