다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편
Summary
우리는 비브라톰과 아가로스 포매된 폐 조직을 활용하여 폐 절편을 생성하는 조직 처리 기술을 개발하여 폐 구조의 고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다. 특정 폐 구조 마커를 사용하여 공간 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다.
Abstract
내재된 구조적 취약성으로 인해 폐는 현미경 판독을 위해 처리하기 어려운 조직 중 하나로 간주됩니다. 절편을 위한 구조적 지지를 추가하기 위해 폐 조직 조각을 파라핀 또는 OCT 화합물에 삽입하고 각각 마이크로톰 또는 저온 유지 장치로 절단합니다. 정밀 절단 폐 절편으로 알려진 최신 기술은 아가로스 침윤을 통해 신선한 폐 조직에 구조적 지지를 추가하고 배양 시 1차 폐 조직을 유지할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 그러나 에피토프 마스킹(epitope masking) 및 조직 왜곡(tissue distortion)으로 인해 이러한 기술 중 어느 것도 여러 항체 및 종에 걸쳐 호환되는 재현 가능한 고급 광 이미징 판독 개발에는 적합하지 않습니다.
이를 위해 우리는 자동화된 비브라톰 절편과 결합된 고정된 폐 조직의 아가로스 임베딩을 활용하는 조직 처리 파이프라인을 개발했습니다. 이를 통해 마우스, 돼지 및 인간의 폐에서 200μm에서 70μm 두께의 폐 절편 생성이 촉진되었으며, 이는 항원 회수가 필요하지 않으며 자연 분리 조직의 가장 적은 “처리된” 버전을 나타냅니다. 이러한 슬라이스를 사용하여 공간 단백질 발현을 사용하여 폐 손상 및 재생의 기전을 정량화하고 더 잘 이해할 수 있는 고해상도 이미지를 생성할 수 있는 다중 이미징 판독값을 공개합니다.
Introduction
생체 외 폐 조직 절편은 폐 질환 연구에 광범위하게 사용됩니다1. 특히 임상 및 중개 대동물 연구에서 현재의 황금 표준은 명시야 현미경 및 관찰자 기반 채점과 함께 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 폐 기능 장애를 평가하고 등급을 매깁니다 2,3. 여전히 가치 있는 기술이지만 공간 해상도와 동시에 이미징할 수 있는 마커의 수 측면에서 한계가 있습니다. 더욱이, 폐 조직은 광범위한 용매 기반 세척을 거쳐야 하며, 이는 최종 이미징 전에 조직의 탈수, 수축 및 재수화를 초래한다4. 이 과정은 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 환경 친화적이지 않고 단백질 에피토프를 가리며 구조적 조직 변화를 유발할 수 있습니다 5,6,7,8. 그러나 폐 조직의 경우 폐의 구조적 취약성으로 인해 절편 전에 파라핀을 삽입하는 것이 필요했습니다. 대조적으로, 뇌와 같은 고형 기관은 진동하는 마이크로톰(vibratome)을 사용하여 고정된 조직과 신선한 조직모두에서 절단할 수 있습니다 9,10,11,12.
폐 조직에서 진동 절편을 가능하게 하기 위해, 기도 또는 혈관을 통해 신선한 폐 조직에 낮은 융점 아가로스를 주입하고13,14를 응고시키기 위해 방치하는 정밀 절단 폐 절편(PCLS)이라는 방법이 확립되었습니다. 기도의 아가로스(agarose)는 비브라톰 절편(vibratome sectioning)을 허용하기에 충분한 구조적 지지를 제공한다 9,14. 설치류에서는, agarose가 기관을 통해 주사될 수 있기 때문에 달성하게 간단하다; 그러나, 돼지 및 인체 조직에서는 주어진 생검 내에서 적절한 기도/혈관을 찾는 것이 어려울 수 있다15,16. 더욱이, 그러한 기도/혈관이 위치하더라도, 아가로스를 주입하기 위해서는 일반적으로 상당한 힘이 필요하며, 이는 후속적인 폐 형태에 영향을 미칠 수 있다17.
파라핀 포매/절편/염색 및 PCLS 워크플로우에서 발생하는 문제를 극복하기 위해 당사는 고정된 폐 조직을 위한 새로운 처리 파이프라인을 구축했습니다. 이 워크플로우를 통해 절편에 진동을 사용할 수 있고, PCLS보다 더 얇은 슬라이스를 생성할 수 있으며, 다중 형광 이미징을 위해 항원 검색이 필요하지 않은 슬라이스를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 고급 광학 현미경 검사에 사용할 수 있는 폐 절편을 생성하기 위한 “최소 처리” 수단을 제공합니다. 더욱이, 이미징 판독은 조직 18,19,20,21의 체적 구조를 캡처하여 폐 조직 내의 세포 및 해부학적 구조의 공간적 관계를 입증하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문은 이러한 폐 절편을 생성하는 프로토콜을 설명하고 이러한 각 조직에 적용되는 다중 염색과 이러한 고급 이미징 데이터를 정량화에 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 폐 절편을 생성하기 위한 개선된 비브라톰 기반 방법을 제시합니다. 파라핀 기반 처리 기술과 비교했을 때, 이 방법은 더 비용 효율적이고, 시간 효율적이며, 환경에 더 좋다22. 또한 이 방법은 폐 조직 절편의 구조적 무결성을 유지하는 데 도움이 되며 항원 검색 없이 고급 면역형광 이미징을 가능하게 합니다. 그러나 실험 중에 이 워크플로에 대한 특정 제한 사항도 발견했습니다. 병든 폐는 병리학적 변화로 인한 조직 파괴로 인해 절단 과정을 방해할 수 있습니다. 절개에 비브라톰을 사용하는 동안 기도 폐쇄 및 심각한 섬유화 폐 조직은 칼날을 방해하여 이러한 조직을 절단하는 과정을 더 어렵게 만들 수 있습니다. 그러나 이것은 칼날 속도를 줄이고 가는 붓으로 조직을 지지함으로써 극복할 수 있습니다. 늑막염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 특발성 폐섬유증(IPF)에서 흔히 발생하는 흉막의 비후로 인해 유사한 문제가 발생합니다.23,24,25. 흉막이 실험에 적합하지 않은 경우, 절개하기 전에 흉막을 제거하거나 흉막에서 폐 용적을 분리하는 것이 좋습니다. 흉막이 필요한 경우 위와 유사한 조작을 사용하여 슬라이스할 수 있으며, 블레이드 속도를 늦추고 미세한 브러시로 슬라이스를 지지합니다.
정밀하게 절단된 폐 절편은 폐의 3차원 구조와 본래의 환경을 보존할 수 있지만(26), PCLS를 생성하는 것은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 과정이라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 폐 조직 절편 생성의 성공 여부는 아가로스 충전의 효율성에 크게 좌우되며, 이는 다시 얻어진 조직에 온전한 흉막과 생존 가능한 주사 부위의 존재에 의해 영향을 받습니다. 이것은 설치류에서 달성하기가 간단한데, 아가로스가 기관을 통해 온전한 폐 내로 쉽게 유입될 수 있기 때문이다(27,28,29). 그러나 대형 동물 연구에서 실험에서 취한 생검은 일반적으로30,31을 캐뉼레이션할 수 있을 만큼 충분히 큰 기도가 없는 원위 폐 분절에서 이루어집니다. 따라서 기관지나 혈관에 아가로스를 주입하는 대신, 원산지 종이나 샘플 부피에 관계없이 폐 조직을 저융점 아가로스에 삽입하여 폐 조직 절편을 생성하는 이 방법을 채택합니다. 이 접근 방식은 기술적으로 더 쉬우며 가능한 한 조직 손상을 최소화하는 것을 목표로 합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이 방법은 폐 조직 절편을 생성하는 데 더 높은 효율성과 용이성을 입증했습니다. 허파꽈리의 형태를 효과적으로 보존하고 특히 폐 조직 절단에 적합하여 반복 가능한 고해상도 다중 형광 이미징을 생성할 수 있습니다.
이 연구에서는 생성된 이미징 데이터에 대한 두 가지 샘플 기반 정량화를 추가로 보여줍니다. 첫 번째는 이미지 추적을 활용하여 종 샘플에 따른 폐포 크기의 차이를 평가했습니다. 당연히 쥐의 허파꽈리가 가장 작았고, 돼지와 인간의 허파꽈리는 크기가 비슷했기 때문에 돼지는 폐 연구를 위한 흥미로운 중개 모델로 부각되었습니다.
두 번째 정량화를 위해 성인과 유아 폐 샘플 간의 HTII 분포를 비교했습니다. 제2형 폐렴구는 원위 폐 상피의 구조에서 중요한 역할을 합니다. TII의 이러한 독특한 능력은 폐포 상피(32)의 복구 및 재생에 기여한다. 건강한 성인 인간의 폐에서 TII는 전체 세포 집단의 약 15%를 차지하는 반면, 폐포 표면적은 약 5%로 추정됩니다33. HTII-280은 폐포 상피세포의 발달 및 손상에 대한 반응을 연구하기 위해 널리 알려진 폐 특이적 마커이며, 특히 TII의 정점 원형질막에 국한되어 있습니다. 실험에서 성인 조직은 뇌내 출혈로 사망하고 동시에 폐 손상을 입은 기증 환자로부터 얻은 반면, 유아 샘플은 질식 관련 사망에서 얻은 것입니다. 연구 결과에 따르면 HTII-280의 발현은 유아 샘플보다 성인 폐 샘플에서 현저히 낮았습니다. 흥미롭게도, HTII-280은 대부분의 HTII에서 발현되지만, 그 발현은 조직의 질에 의해서도 영향을 받을 수 있으며, 손상된 인간 폐 조직에서는 현저하게 감소된다34. 노화된 폐 조직은 젊은 조직에 비해 TII의 수와 분비 활성이 현저히 감소하며, 노인 개인은 젊은 조직에 비해 TII의 증식, 분비 및 항세포사멸 활성이 상당히 낮다35. 이에 따라, 인간 TII에 특이적인 세포 표면 단백질의 식별 및 검출은 폐 손상의 중증도를 평가하고 폐 복구를 향상시키는 것을 목표로 하는 치료 접근법을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다36,37. 따라서 이 파이프라인을 활용하여 건강 및 질병의 더 큰 인간 코호트에서 폐포 TII 연구를 수행하는 것이 큰 관심사가 될 것입니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 폐 조직을 절단하는 더 빠르고 쉬운 접근 방식을 제시합니다. 이 방법은 폐 조직 준비, 절단 및 염색에 대한 자세한 지침을 제공하여 온전한 폐 조직 구조를 보존합니다. 건강한 폐 구조와 병든 폐 구조를 모두 연구하기 위한 모델을 최적화하여 실험 효율성을 향상시킵니다. 전반적으로, 이 연구는 종 전반에 걸친 폐 조직 병태생리학에서 복잡한 공간 생물학을 조사하기 위한 유망한 접근 방식을 도입하여 질병 및 복구에 작용하는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 발렌베리 분자 의학 재단(Wallenberg Molecular Medicine Foundation)과 룬드 대학교(Lund University)의 줄기 세포 센터(Stem Cell Center)로부터 받은 자금 지원에 감사하며, 니콘 A1RHD에 대한 접근을 위해 룬드 대학교 바이오이미징 센터(LBIC)에 감사를 표합니다.
Materials
| 24 well tissue culture inserts | SARSTEDT | 83.3932.300 | |
| 4% paraformaldehyde | SOLVECO | 6095714 | |
| 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher scientific | D1306 | |
| 50 mL Falcon tube | SARSTEDT | 2045221 | |
| Cluster of differentiation 31 (CD31) | Abcam | ab28364 | |
| Confocal microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Elastin | Abcam | ab23747 | |
| Epredia X1000 Coverslip | Thermo Fisher scientific | 10318963 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher scientific | 10149870 | |
| Forceps | AESCULAP | FB395R | |
| Goat anti-mouse 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-rabbit 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Human type II cells | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | |
| Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher scientific | E41473 | |
| Low gelling temperature Agarose | Sigma-Aldrich | 1003467046 | |
| Lycopersicon Esculentum lectin | Thermo Fisher scientific | 2531965 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher scientific | 50-100-8798 | |
| Plastic cup | kontorsgiganten | 885221 | |
| Scissors | STILLE | 101-8380-18 | |
| Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | K54329188239 | |
| Super glue | LOCTITE | 2721643 | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200S |
Referências
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
- Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
- Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
- Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
- Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
- Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
- Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
- Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
- Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
- Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
- Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Biologia do Desenvolvimento. 409 (2), 429-441 (2016).
- Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
- Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
- Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
- Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
- Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
- Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
- Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
- Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
- Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
- Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
- Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
- Evans, K. V., Lee, J. -. H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
- Chen, J. -. X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
- Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
