Tiroid hormonunun serebellar fonksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak için çok yönlü, davranışsal bir yöntem
Summary
Burada, yakın zamanda geliştirilen çok yönlü bir davranış testi olan merdiven kirişi testi için bir protokol sunuyoruz. Bu test, motor performansı değerlendiren geleneksel davranış testlerine göre, merkezi sinir sistemindeki tiroid hormonu etkisindeki bir kusurun neden olduğu ince serebellar ataksiyi tespit etme avantajına sahiptir.
Abstract
Tiroid hormonu (TH) etkisi, beyincik de dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin gelişimi sırasında çok önemlidir. Konjenital hipotiroidizm gibi erken yaşamda TH eksikliği durumunda, hastalar kognitif gerilik ve motor defisitler gibi nörolojik bozukluklar gösterirler. TH’nin beyincikteki rolünü araştırmak için doku veya hücreye özgü TH eksikliği olan fare modellerini kullanan çeşitli çalışmalar vardır. Genelleştirilmiş konjenital hipotiroidi farelerle karşılaştırıldığında, serebellar hücreye özgü TH eksikliği olan fareler daha hafif ve daha ince ataksik özellikler gösterir, bu da rotarod testi gibi geleneksel testler kullanılırken motor fonksiyonun değerlendirilmesini zorlaştırır.
TH ile ilişkili hayvan modellerinde motor fonksiyonu değerlendirmek için alternatif bir araca ihtiyaç duyulması nedeniyle, model farelerde ataksinin şiddetine bağlı olarak çeşitli merdiven testlerini tasarlayabileceğimiz “merdiven ışını testi” adı verilen çok yönlü bir davranışsal yöntem geliştirdik. Özellikle serebellar korteks modülasyonlu motor performansında tek bir çıkış nöronu olan serebellar Purkinje hücresinde baskın-negatif bir TH reseptörü eksprese eden transgenik fareler kullandık. Yeni inşa edilen merdiven kirişi testi, transgenik farelerde motor performansındaki sağlam bozuklukları rotarod testine kıyasla daha yüksek bir seviyede başarıyla tespit etti. Motor öğrenmede bozulma da merdiven kirişi testinde tespit edildi, ancak rotarod testinde tespit edilmedi. Bu yeni davranışsal aparatla yapılan protokol, serebellar fonksiyondaki ince değişiklikleri incelemek için hafif ataksik fenotip gösterebilen diğer hayvan modellerine uygulanabilir.
Introduction
Tiroid hormonu (TH) beyin gelişimi için vazgeçilmezdir1. Özellikle, beyincikteki rolü kritiktir, çünkü erken yaşamda TH eksikliği anormal serebellar gelişime neden olur 1,2. Örneğin, konjenital hipotiroidizmde, hastalar bilişsel ve motor eksiklikleri içeren bir dizi nörolojik gerilik gösterirler3. TH’nin serebellar fonksiyonel gelişimdeki rolünü ortaya çıkarmak için, bazı çalışmalar serebellar hücreye özgü bir şekilde TH eksikliğini sınırlamıştır4. Bununla birlikte, tüm doku ve hücrelerin TH eksikliğinden etkilendiği genelleştirilmiş konjenital hipotiroidi farelerle karşılaştırıldığında, bu tür serebellara özgü modeller o kadar ince ataksi gösterir ki, rotarod, ayak izi ve denge kirişi testleri gibi geleneksel davranış testleri farklılıkları zar zor tespit eder. Bu nedenle, SEREBELLAR fonksiyon üzerindeki TH etkilerini tam olarak araştırmak için, model farelerin motor koordinasyonundaki ince bir değişikliği tespit etmek için yeni bir değerlendirme aracına ihtiyaç vardır.
Rotarod testi, başlangıçta Dunham ve Miya5 tarafından geliştirilen ve daha sonra Jones ve Roberts6 tarafından hızlandırıcı bir versiyona uygulanan motor koordinasyonunu değerlendirmek için en yaygın araçtır. Dönen çubuktan düşme gecikmesi, motor koordinasyon testi olarak yorumlanır ve basitliği ve özlülüğü, motor işlevi inceleyen davranışsal araştırmacılar arasında yaygın olarak kullanılmasını sağlar7. Bununla birlikte, bu testin kullanım kolaylığı iki ucu keskin bir kılıçtır. Çubuk otomatik olarak döndüğü için, fareler hareket etmeden dönen çubuğa yapışabilir ve üzerinde kalabilir. Ayrıca, fareler dönen çubuk üzerinde dengede durmaya devam etmek yerine düşmeye niyetli olabilir. Her iki durumda da, testin geçerliliği ve güvenilirliği “saf motor koordinasyonunu” değerlendirmek için sorgulanabilir7. Başka bir deyişle, serebellar fonksiyonu doğru bir şekilde hedeflemez ve kavrama için kas gücü gibi diğer faktörleri içerir.
Motor koordinasyon değerlendirmesi için geleneksel araçlar yerine, burada laboratuvarımızda yakın zamanda geliştirilen “merdiven kiriş testi” adı verilen yeni bir davranış testi sunuyoruz. Yatay merdiven yürüme testi, beyincik ile ilgili karmaşık motor yetenekleri değerlendirmek için tasarlanmıştır: ileri besleme tahmini ve hareket8’in entegrasyonu. Test cihazı, delikli dört parça pleksiglastan oluşuyordu (Şekil 1). Dört plaka, plakalar üzerindeki deliklere yerleştirilen vidalar ve çubuklarla paralel olarak bağlandı. Cihazı stabilize etmek için iki dış plaka kullanıldı ve çeşitli merdiven basamaklarını tasarlamak için iki iç plaka kullanıldı (Şekil 2C). Basamağın genişliği, hayvanların geriye doğru hareketini en aza indirmek için hayvan boyutuna bağlı olarak ayarlandı (Şekil 2B). Başlangıç noktasından kaleye olan mesafe 110 cm idi. Cihaz, tezgahın 60 cm yukarısına yerleştirildi ve cihazın altına bir güvenlik yastığı yerleştirildi (Şekil 2A). Karanlık oda, hayvanları hedefe doğru hareket etmeye motive etmek için kalenin yakınına yerleştirildi (Şekil 2A).
Serebellar Purkinje hücrelerinde (Mf-1/FVB fareler) baskın-negatif TH reseptörü (TR) eksprese eden transgenik fareler kullanarak serebellar fonksiyonel gelişim üzerindeki TH etkilerini inceledik. Hem rotarod hem de merdiven ışını testlerinde, Mf-1/FVB farelerde serebellar ataksik fenotip gözlemledik; bununla birlikte, merdiven kiriş testi, rotarod testinden daha önemli farklılıkları tespit etmeyi başardı (Şekil 3). Ek olarak, motor öğrenme yeteneği merdiven kirişi testinde daha ayrıntılı olarak değerlendirilebilir (Şekil 3B,C). Böyle bir davranışsal fenotipin hücresel bir arka planı olarak, uzun süreli depresyonun (LTD) indüksiyonu inhibe edildi ve bunun yerine, Mf-1 / FVB Purkinje hücrelerinde bir LTD indüktif stimülasyonunu takiben uzun vadeli potansiyasyon (LTP) indüklendi9. LTD, beyincikte motor koordinasyon ve motor öğrenme için gereklidir10. Birçok çalışma, serebellar fonksiyondaki anahtar düzenleyici genler için nakavt veya mutasyona uğramış farelerde motor eksiklikler ve LTD inhibisyonu bildirmiştir, ancak hiçbir çalışma, bir LTD indüktif stimülasyonunu takiben LTP’nin indüksiyonunu bildirmemiştir11,12. Birlikte ele alındığında, bu fenomen Mf-1 / FVB farelerine veya TH eksikliği olan farelere özgü olabilir (aynı fenomen yetişkin başlangıçlı hipotiroidi farelerinde de gözlenmiştir), bu da TH’nin serebellar fonksiyonu diğer anahtar proteinlerden farklı şekilde düzenlediğini düşündürmektedir. Eğer öyleyse, anormal TH etkisine sahip farelerin, diğer model farelerle aynı şekilde serebellar ataksi göstermemesi akla yatkındır. Bu, TH’nin serebellar fonksiyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için özel bir yönteme olan ihtiyacı bir kez daha vurgulamaktadır. Bu makale, yeni inşa edilen merdiven kirişi testini kullanarak serebellar fonksiyon üzerindeki TH etkilerini araştırmak için yeni bir protokol sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tasarımımız, “merdiven basamağı yürüme testinin” faydasını bildiren Metz ve Whishaw tarafından yapılan geçmiş çalışmadan yararlandı13,14. Hayvanların yatay bir merdiven üzerinde bir başlangıç noktasından bir hedefe yürümesini gerektirerek, yetenekli yürümeyi değerlendirmek ve hem ön hem de arka uzuv yerleştirme, adım atma ve uzuvlar arası koordinasyonu ölçmek için merdiven basamağı yürüme te…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği KAKENHI tarafından desteklenmiştir (hibe no. 18H03379 N.K.’ye, 21K15340 IA’ya ve 22J11280 A.N.’ye).
Materials
| Air puff | DAISO | ||
| Aluminum sticks | CAINZ | 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval). | |
| Blutack | Bostik | ||
| Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each | |
| Screws | CAINZ |
Referências
- Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
- Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
- Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17 (2010).
- Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342 (2022).
- Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
- Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119 (2022).
- Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
- Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118 (2021).
- Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010 (2022).
- Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
- Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).
