Hibridación Reacción en cadena ARN Fluorescencia de montaje completo Hibridación in situ de genes quimiosensoriales en apéndices olfativos de mosquitos

Los mosquitos vectores como Anopheles gambiae dependen de un rico repertorio de genes quimiosensoriales expresados en sus apéndices olfativos periféricos para prosperar en un mundo químico complejo e identificar olores relevantes para el comportamiento que emanan de huéspedes humanos, detectar fuentes de néctar y^{localizar sitios de} oviposición. La antena del mosquito y el palpo maxilar están enriquecidos con genes quimiosensoriales que impulsan la detección de olores en estos apéndices olfativos. Tres clases principales de canales iónicos activados por ligandos impulsan la detección de olores en los apéndices olfativos de los mosquitos: los receptores de olores (OR), que funcionan con un correceptor de olores obligado (Orco); los receptores ionotrópicos (IR), que interactúan con uno o más correceptores IR (IR8a, IR25a e IR76b); los receptores gustativos quimiosensoriales (GR), que funcionan como un complejo de tres proteínas para detectar el dióxido de carbono (CO₂)^1,2.

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN es una poderosa herramienta para detectar la expresión de ARNm endógeno³. En general, este método utiliza una sonda de ácido nucleico monocatenario marcada con fluoróforos con secuencia complementaria a un ARNm diana. La unión de la sonda de ARN fluorescente al ARN diana permite la identificación de células que expresan una transcripción de interés. Los avances recientes permiten ahora la detección de transcripciones en tejidos de mosquitos de monte entero ^4,5. La primera generación de tecnología de reacción en cadena de hibridación (HCR) utilizaba un amplificador HCR basado en ARN; esto se mejoró en un método de segunda generación que, en cambio, utilizó ADN diseñado para el amplificador HCR ^6,7. Esta actualización dio como resultado un aumento de 10 veces en la señal, una disminución drástica en el costo de producción y una mejora significativa en la durabilidad de los reactivos ^6,7.

En el protocolo, describimos la utilización de un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN de montaje completo HCR de tercera generación (HCR RNA WM-FISH) diseñado para detectar la localización espacial y la expresión de cualquier gen ^8,9. Este método de dos pasos utiliza primero sondas de ácido nucleico específicas para el ARNm de interés, pero que también contienen una secuencia de reconocimiento del iniciador; el segundo paso utiliza horquillas marcadas con fluoróforos que se unen a la secuencia del iniciador para amplificar la señal fluorescente (Figura 1). Este método también permite la multiplexación de dos o más sondas de ARN y la amplificación de las señales de la sonda para facilitar la detección y cuantificación del ARN⁸. La visualización de la abundancia de transcripciones y los patrones de localización del ARN de los genes quimiosensoriales expresados en los apéndices olfativos ofrece la primera línea de información sobre las funciones de los genes quimiosensoriales y la codificación de los olores.