אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

בקטריופאג’ים, או פאגים, הם וירוסים שמדביקים והורגים חיידקים עם מינים וספציפיות ברמת הזן¹. פאגים ממלאים תפקידים חשובים בקהילות חיידקים מורכבות כמו מיקרוביוטת המעיים, שם הם היו מעורבים בוויסות דינמיקת האוכלוסייה ובהנעת כושר חיידקי². במהלך העשור האחרון, התעורר עניין מחודש במחקר פאגים עקב עלייתם של פתוגנים עמידים אנטי-מיקרוביאליים³, והפוטנציאל לטיפול בפאגים כאסטרטגיית טיפול אלטרנטיבית. בשנים האחרונות נעשה שימוש בקוקטיילים של פאגים ליטיים דרך הווריד בהצלחה מסוימת בזיהומים ספטיים חיידקיים חמורים ועמידים לאנטיביוטיקה בבני אדם ^3,4. טיפול בפאגים דרך הפה הוצע גם כחלופה פוטנציאלית לאנטיביוטיקה לטיפול בדלקות מעיים ודלקות. יתר על כן, פאגים היו מעורבים בהצלחה של השתלות תסנין צואה (FFT), שהם תכשירי מיקרוביוטה צואתיים שסוננו לסילוק חיידקים, בטיפול בזיהום חוזר של Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, הפרעות מעי דלקתיות (IBD)^7,8 ודלקת מעיים נמקית בפגים⁹. בהתחשב בתוצאות אלה, חשוב לקחת בחשבון אינטראקציות הן בין פאגים ומיקרוביוטת המעיים, והן בין פאגים לבין פונדקאי היונקים, שכן להוספת פאגים חדשים לקהילה קיימת עשויות להיות השפעות עקיפות על הקהילה כולה, ולא רק על חיידקי המטרה שלה ^2,10.

המחקר של אינטראקציות פאגים עם חיידקי המטרה שלהם במבחנה הוכח כיעיל להבנת המנגנונים וההשפעות של אינטראקציות פאגים וחיידקים במעיים. במסגרת זו, הוכח כי פאגים T4 ספציפיים ל- Escherichia coli מסדר Caudovirales דורשים תחומים דמויי אימונוגלובולין (Ig) הממוקמים בתוך חלבוני קפסיד חיצוני אנטיגני מאוד (Hoc) על פני השטח של הנגיפים כדי להיצמד לליחה במעי¹¹. בנוסף, מבחני טרנסוול הראו כי פאגים מסוג T4 מסוגלים לקיים אינטראקציה עם תרביות תאי אפיתל ולבצע טרנסלוקציה דרך שכבות התא על ידי מקרופינוציטוזה^12,13. תוצאות אלה תומכות בהשערה שפאגים יכולים לתקשר עם הפונדקאי המטזואני שלהם, אף על פי שהם אינם מסוגלים להדביק תאים איקריוטים. מודלים אלה, למרות שהם שימושיים, חסרים את כל טווח האינטראקציות המורכבות המתרחשות במערכת האקולוגית של המעיים הדרושות לחקירה מקיפה של האינטראקציה המשולשת בין פאגים, חיידקים והפונדקאי המטזואני.

מודלים של עכברים הם כלי חשוב לחקר פאגים בסביבות מורכבות. יישום רצוי של מתן פאגים הוא כאסטרטגיה חלופית לטיפול בזיהומים עמידים מיקרוביאליים או פתוביונטים הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות, כולל IBD. עם זאת, ספרות חדשה מציעה כי התנהגות פאגים במבחנה אינה מייצגת באופן מלא פונקציות in vivo. Buttimer et ^al.14 הראו כי קוקטייל פאגים היה מסוגל לרוקן את חיידקי המטרה בקונסורציום מיקרוביוטה אנושית פשוטה במבחנה, אך לא ניתן היה לשכפל אותו in vivo בעכברים גנוטוביוטיים שהתיישבו באותו קונסורציום חיידקים-פאגים. יתר על כן, במיקרוביום עכבר קונבנציונלי, פאג T7 הוביל לדלדול סלקטיבי של חיידקי המעיים שלו, אם כי נצפתה התאוששות הדרגתית לאורך זמן, המעידה על עמידות מפותחת¹⁵. מחקרים אחרים הוכיחו דו-קיום של פאגים הניתנים דרך הפה וזני חיידקי המטרה שלהם in vivo ^2,16. ואכן, מעבר לדו-קיום של פאגים/חיידקים, מתן פאגים הוביל לשינויים נרחבים בהרכב ובתפקוד הכולל של קהילת המיקרוביוטה ^2,16. זה רלוונטי במצבי מחלה, שכן מספר מחקרים מצאו קשרים בין שפע יחסי מוגבר של Caudovirales ו- IBD ^7,8,17 שהיו בלתי תלויים בשינויים בשפע חיידקים⁷. עדיין לא ידוע אם זהו מניע או תוצאה של פתוגנזה של המחלה.

המוקד ההיסטורי של חקר הפאגים היה סביב הקשר בין פאג לבין חיידק המטרה שלו. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון אינטראקציות אפשריות בין פאגים לבין הרירית, האפיתל ומערכת החיסון של הפונדקאי המטזואני. כל האינטראקציות האלה ממלאות תפקיד חשוב בתגובה הכוללת לזיהום פאגים במעי. כדי להדגים זאת, פאגים נחקרו באמצעות עכברים נטולי חיידקים (GF) כדי להבהיר את השפעתם על מערכת החיסון ללא הפרעה של המיקרוביוטה⁸. במערכת זו, חומצות גרעין פאגים זוהו על ידי קולטנים דמויי טול (TLR) הממוקמים בתוך אנדוזומים של תאי חיסון פגוציטיים (מקרופאגים ותאים דנדריטיים). זה הפעיל איתות במורד הזרם ועורר ייצור תלוי תאי T של אינטרפרון (IFN)-γ⁸ או סוג I IFNs¹⁸. יתר על כן, Fluckiger et ^al.19 עירבו תאי זיכרון CD8⁺ T בזיהוי אנטיגנים מקודדי פאגים (פרופאג’ים), מה שהביא לתגובתיות צולבת של תאי T עם אנטיגנים סרטניים, וכתוצאה מכך נטל הגידול מופחת. לבסוף, ייצור נוגדנים ספציפיים לפאגים תועד במחקרי עכברים שבהם פאגים הועברו למודלים של בעלי חיים באופן מתמשך באמצעות מי שתייה ^8,20, או על ידי גאגים פומיים חוזרים ונשנים במשך מספר חודשים²⁰, מה שמדגים את יכולתם של חלבוני פאגים לקדם תגובות חיסוניות הומורליות. אף על פי ששיטות אלה של חיסון פאגים מאפשרות הכנה אופטימלית ומתמשכת של מערכת החיסון, ייתכן שהן אינן מייצגות את האינטראקציות הטבעיות בין פאגים לסביבת המעי, וגם לא את הקינטיקה של טיפול בפאגים המיושמים דרך הפה. עד כה, מספר מצומצם של מחקרים בחנו את יחסי הגומלין של פאגים עם מין חיידק יחיד במודלים של עכברים חד-מושבתיים²¹. עם זאת, עכברים חד-מושבתיים הוכיחו את עצמם כקריטיים בפענוח השפעות ספציפיות של חיידקים של מינים בודדים על מערכת העיכול (GI) ועל התפתחות מערכת החיסון 22,23,24, והם עדיין עשויים להיות שימושיים בהבנת אינטראקציות משולשות בין פאגים, חיידקי המטרה שלהם והפונדקאי המטזואני.

באופן מלהיב, יש עדיין הרבה מה ללמוד על יחסי הגומלין בין פאגים במעיים לבין חיידקי מעיים, כמו גם על יחסי הגומלין המתרחשים בין המאכסן המטזואני לבין הפאגים השוכנים בתוכו. פרוטוקול זה מספק סדרה של הליכים לחקר פאג T4 מבודד ומקבילו החיידקי, E. coli (K-12, BW25113), באמצעות מודל עכבר גנוטוביוטי. נהלים סטנדרטיים אלה מספקים גם בסיס לאופטימיזציה של דיאדות פאגים/חיידקים אחרות על ידי התאמת פרמטרי הגידול לזוגות המעניינים. השיטות המתוארות כאן מתארות: (1) הכנת פאגים מסוג T4 וליזאטים של כלי רכב לגידול אוראלי של עכברים; (2) מתן פומי של פאג T4 לעכברים גנוטוביוטיים חד-מושבתיים מסוג E. coli ; (3) ניטור רמות הפאגים מסוג T4 בצואת עכברים וברקמות לאורך זמן.

עבור התוצאות המייצגות שהוצגו כאן, ליזטים מטוהרים של פאגים מסוג T4 הופצו ממניות בנק פאגים שהוחזקו על ידי מעבדת רוהוור. שיטת פאג-און-ברז להפצת פאג T4 הותאמה²⁵, כפי שמוזכר בפרוטוקול זה. השיטה מניבה מלאי פאגים גבוה ואנדוטוקסין נמוך תוך שלושה ימים. באמצעות גישה זו, 10 מ”ל של ≥ 10¹⁰ יחידות יוצרות פלאק (pfu)/מ”ל של פאג T4 עם < 0.5 יחידות אנדוטוקסין (EU)/מ"ל נאספו באופן שגרתי. רמות האנדוטוקסין המומלצות למתן פומי או תוך ורידי בעכברים הן ≤ 20 EU/מ"ל ו-≤ 5 EU/kg/h (או 0.1 EU מנוהל מעל שעה אחת עבור עכבר במשקל 20 גרם), בהתאמה, מה שהופך זאת לשיטה מתאימה להכנת פאגים לחיסון in vivo . כל מלאי הפאגים אוחסן בטמפרטורה של 4°C במאגר פאגים של מגנזיום מלוחים (SM) (מתכון סופק בשלב 1.1.5.1). E. coli טופח במדיה LB. עבור זוגות שונים של חיידקי פאג’ים, ניתן להתאים מצעי תרבית ותנאי גדילה מגוונים מפרוטוקול זה. פאגים יכולים גם להיות מופקים מהסביבה, כגון שפכים, מים ימיים, קרקע ותכולת מעיים, וניתן לבודד ולטהר אותם לפי סמברוק וראסל²⁶ לפני ההכנה תוך שימוש בתנאי הגידול והריבוי המתאימים לכל זוג פאגים-פונדקאים²⁵ . לחלופין, ניתן לקבל פאגים ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) או מבנקי פאגים.