T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Bakteriophagen oder Phagen sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und abtöten¹. Phagen spielen eine wichtige Rolle in komplexen Bakteriengemeinschaften wie der Darmmikrobiota, wo sie an der Regulierung der Populationsdynamik und der Förderung der bakteriellen Fitness beteiligt sind². In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung aufgrund des Aufkommens antimikrobiell resistenter Krankheitserreger³ und des Potenzials der Phagentherapie als alternative Behandlungsstrategie wieder gestiegen. In den letzten Jahren wurden lytische Phagencocktails mit einigem Erfolg bei schweren, antibiotikaresistenten bakteriellen septischen Infektionen beim Menschen intravenös eingesetzt ^3,4. Die orale Phagentherapie wurde auch als potenzielle Alternative zu Antibiotika zur Behandlung von Darminfektionen und Entzündungen vorgeschlagen. Darüber hinaus wurden Phagen mit dem Erfolg von fäkalen Filtrattransplantationen (FFT) in Verbindung gebracht, bei denen es sich um fäkale Mikrobiota-Präparate handelt, die gefiltert wurden, um Bakterien zu entfernen, bei der Behandlung von rezidivierenden Clostridioides difficile-Infektionen (rCDI)^5,6, entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)^7,8 und nekrotisierender Enterokolitis bei Frühgeborenen⁹. Angesichts dieser Ergebnisse ist es wichtig, Wechselwirkungen sowohl zwischen Phagen und der Darmmikrobiota als auch zwischen Phagen und dem Säugetierwirt zu berücksichtigen, da die Hinzufügung neuer Phagen in eine bereits bestehende Gemeinschaft indirekte Auswirkungen auf die Gemeinschaft als Ganzes und nicht nur auf ihre Zielbakterien haben kann ^2,10.

Die Untersuchung von Phageninteraktionen mit ihren Zielbakterien in vitro hat sich als nützlich erwiesen, um die Mechanismen und Auswirkungen von Phagen- und Bakterieninteraktionen im Darm zu verstehen. In diesem Setting wurde gezeigt, dass Escherichia coli-spezifische T4-Phagen der Ordnung Caudovirales Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domänen benötigen, die sich in hochantigenen äußeren Kapsidproteinen (Hoc) auf der Virionoberfläche befinden, um am Darmschleim^{zu haften 11}. Darüber hinaus haben Transwell-Assays gezeigt, dass T4-Phagen in der Lage sind, mit Epithelzellkulturen zu interagieren und durch Makropinozytose durch Zellschichten zu translozieren^12,13. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Phagen mit ihrem metazoischen Wirt interagieren können, obwohl sie nicht in der Lage sind, eukaryotische Zellen zu infizieren. Diese Modelle sind zwar nützlich, aber es fehlt ihnen die gesamte Bandbreite komplexer Interaktionen, die in einem Darmökosystem auftreten und für eine umfassende Untersuchung der dreigliedrigen Interaktion zwischen Phagen, Bakterien und dem Metazoenwirt erforderlich sind.

Mausmodelle sind ein wichtiges Werkzeug, um Phagen in komplexen Umgebungen zu untersuchen. Eine wünschenswerte Anwendung der Phagenverabreichung ist eine alternative Strategie zur Behandlung von antibiotikaresistenten Infektionen oder Pathobionten, die mit chronischen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich CED, assoziiert sind. Neue Literatur deutet jedoch darauf hin, dass das Verhalten von Phagen in vitro die Funktionen in vivo nicht vollständig abbildet. Buttimer et ^al.14 zeigten, dass ein Phagencocktail in der Lage war, die Zielbakterien in einem vereinfachten menschlichen Mikrobiota-Konsortium in vitro zu depletieren, aber nicht in vivo in gnotobiotischen Mäusen repliziert werden konnte, die mit demselben Bakterien-Phagen-Konsortium besiedelt waren. Darüber hinaus führte der T7-Phage in einem konventionellen Mausmikrobiom zu einer selektiven Erschöpfung seiner Zieldarmbakterien, obwohl im Laufe der Zeit eine allmähliche Erholung beobachtet wurde, was auf eine entwickelte Resistenz hinweist¹⁵. Andere Studien haben die Koexistenz von oral verabreichten Phagen und ihren Zielbakterienstämmen in vivo nachgewiesen ^2,16. Tatsächlich führte die Phagenverabreichung über die Koexistenz von Phagen und Bakterien hinaus zu weitreichenden Veränderungen in der Gesamtzusammensetzung und -funktion der Mikrobiota-Gemeinschaft ^2,16. Dies ist für Krankheitssituationen relevant, da mehrere Studien Assoziationen zwischen einer erhöhten relativen Abundanz von Caudovirales und IBD gefunden haben ^7,8,17, die unabhängig von Veränderungen der bakteriellen Abundanz waren⁷. Es ist nicht bekannt, ob dies ein Treiber oder eine Folge der Krankheitspathogenese ist.

Der historische Schwerpunkt der Phagenforschung lag auf der Beziehung zwischen einem Phagen und seinem Zielbakterium. Es ist jedoch auch wichtig, mögliche Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Schleimhaut, dem Epithel und dem Immunsystem des Metazoenwirts zu berücksichtigen. Diese Wechselwirkungen spielen alle eine wichtige Rolle bei der Gesamtreaktion auf Darmphageninfektionen. Um dies zu demonstrieren, wurden Phagen mit keimfreien (GF) Mäusen untersucht, um ihre Auswirkungen auf das Immunsystem ohne Eingriffe der Mikrobiota aufzuklären⁸. In diesem System wurden Phagen-Nukleinsäuren durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) nachgewiesen, die sich in Endosomen phagozytärer Immunzellen (Makrophagen und dendritische Zellen) befinden. Dies aktivierte die nachgeschaltete Signalübertragung und stimulierte die T-Zell-abhängige Produktion von Interferon (IFN)-γ⁸ oder Typ I IFNs¹⁸. Darüber hinaus implizierten Flückiger et ^al.19 Gedächtnis-CD8⁺ T-Zellen bei der Erkennung von Phagen-kodierten (Prophagen-) Antigenen, was zu einer T-Zell-Kreuzreaktivität mit Tumorantigenen führte, was zu einer verringerten Tumorlast führte. Schließlich wurde die Phagen-spezifische Antikörperproduktion in Mausstudien dokumentiert, in denen Phagen kontinuierlich über Trinkwasser ^8,20 oder durch wiederholte orale Sonde über mehrere Monate hinweg an Tiermodelle abgegeben wurden²⁰, was die Fähigkeit von Phagenproteinen zur Förderung humoraler Immunantworten zeigt. Obwohl diese Arten der Phageninokulation eine optimale und kontinuierliche Vorbereitung des Immunsystems ermöglichen, repräsentieren sie möglicherweise nicht die natürlich vorkommenden Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Darmumgebung oder die Kinetik der oral angewendeten Phagentherapie. Bisher hat eine begrenzte Anzahl von Studien die Interaktionen von Phagen mit einer einzigen Bakterienart in monokolonisierten Mausmodellen untersucht²¹. Monokolonisierte Mäuse erwiesen sich jedoch als entscheidend für die Entschlüsselung mikrobenspezifischer Effekte einzelner Spezies auf den Magen-Darm-Trakt und die Immunentwicklung 22,23,24, und sie könnten sich noch als nützlich erweisen, um dreigliedrige Interaktionen zwischen Phagen, ihren Zielbakterien und dem Metazoenwirt zu verstehen.

Spannenderweise gibt es noch viel über die Wechselwirkungen zwischen Darmphagen und Darmkommensalbakterien sowie über die Wechselwirkungen zwischen dem Metazoen-Wirt und den darin befindlichen Phagen zu lernen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung von isolierten T4-Phagen und seinem bakteriellen Gegenstück, E. coli (K-12, BW25113), unter Verwendung eines gnotobiotischen Mausmodells. Diese standardisierten Verfahren bieten auch eine Grundlage für die Optimierung anderer Phagen/Bakterien-Dyaden, indem die Wachstumsparameter an die interessierenden Paare angepasst werden. Die hier beschriebenen Methoden skizzieren: (1) Herstellung von T4-Phagen- und Vehikellysaten für orale Sonden von Mäusen; (2) Orale Verabreichung von T4-Phagen an monokolonisierte gnotobiotische Mäuse von E. coli ; (3) Überwachung der T4-Phagenspiegel in Mäusekot und -gewebe im Laufe der Zeit.

Für die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse wurden gereinigte T4-Phagenlysate aus Phagenbankbeständen des Rohwer Lab vermehrt. Die Phagen-on-Tap-Methode zur Vermehrung von T4-Phagen wurde angepasst²⁵, wie in diesem Protokoll referenziert. Die Methode liefert innerhalb von drei Tagen Phagenbestände mit hohem Titer und niedrigem Endotoxingehalt. Mit diesem Ansatz wurden routinemäßig 10 ml ≥ 10¹⁰ plaquebildende Einheiten (pfu)/ml T4-Phagen mit < 0,5 Endotoxineinheiten (EU)/ml gesammelt. Die empfohlenen Endotoxingehalte für die orale oder intravenöse Verabreichung an Mäuse liegen bei ≤ 20 EU/ml bzw. ≤ 5 EU/kg/h (bzw. 0,1 EU über 1 h für eine 20-g-Maus), was dies zu einer geeigneten Methode der Phagenpräparation für die In-vivo-Inokulation macht. Alle Phagenbestände wurden bei 4 °C in salzhaltigem Magnesium (SM)-Phagenpuffer gelagert (Rezeptur in Schritt 1.1.5.1). E. coli wurde in LB-Medien kultiviert. Für verschiedene Phagen-Bakterien-Paare können verschiedene Nährmedien und Wachstumsbedingungen aus diesem Protokoll angepasst werden. Phagen können auch aus der Umwelt wie Abwasser, Meerwasser, Boden und Darminhalt stammen und können gemäß Sambrook und Russell²⁶ vor der Herstellung unter den geeigneten Wachstums- und Vermehrungsbedingungen für jedes Phagen-Wirt-Paar^{von Interesse 25} isoliert und gereinigt werden. Alternativ können Phagen aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle) oder aus Phagenbanken bezogen werden.