Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos
Summary
Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.
Abstract
Los astrocitos y la microglía desempeñan un papel fundamental en el desarrollo del sistema nervioso central, las respuestas a lesiones y las enfermedades neurodegenerativas. Estas células altamente dinámicas exhiben respuestas rápidas a los cambios ambientales y muestran una heterogeneidad significativa en términos de morfología, perfiles transcripcionales y funciones. Si bien nuestra comprensión de las funciones de las células gliales en la salud y la enfermedad ha avanzado sustancialmente, sigue siendo necesario realizar análisis in vitro específicos de células en el contexto de lesiones o lesiones para caracterizar de manera exhaustiva las distintas poblaciones celulares. El aislamiento de células del ratón adulto ofrece varias ventajas sobre las líneas celulares o los animales neonatos, ya que permite el análisis de células en condiciones patológicas y en momentos específicos. Además, centrarse en el aislamiento específico de la médula espinal, excluyendo la afectación cerebral, permite investigar patologías de la médula espinal, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental, la lesión de la médula espinal y la esclerosis lateral amiotrófica. Este protocolo presenta un método eficiente para aislar astrocitos y microglía de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita el análisis inmediato o futuro con aplicaciones potenciales en estudios funcionales, moleculares o proteómicos posteriores.
Introduction
Los astrocitos y la microglía son células gliales versátiles que desempeñan funciones vitales en el sistema nervioso central (SNC), abarcando responsabilidades como la regulación de la función neuronal, la contribución al desarrollo del SNC, el mantenimiento de la barrera hematoencefálica y la participación en otros procesos críticos 1,2,3,4 . Además de su papel en el mantenimiento de la homeostasis, estas células gliales también desempeñan un papel fundamental en los mecanismos de lesión y reparación. Las microglías son bien conocidas por sus capacidades fagocíticas, inflamatorias y migratorias después de lesiones o lesiones 5,6,7. Las respuestas de los astrocitos en la enfermedad son igualmente diversas, abarcando contribuciones a la inflamación, la formación de cicatrices gliales y el compromiso de la barrera hematoencefálica 8,9. Aunque nuestra comprensión de las funciones perjudiciales y reparadoras de la microglía y los astrocitos en el SNC ha crecido, la heterogeneidad inherente tanto en su estructura como en su función requiere herramientas sólidas para estudiarlos en diversos contextos.
Obtener más información sobre el papel de la microglía y los astrocitos en la salud y la enfermedad requiere un enfoque combinado de investigaciones in vivo e in vitro . Las técnicas in vivo aprovechan la intrincada diafonía entre las células gliales y las neuronas dentro del SNC, mientras que las metodologías in vitro resultan valiosas a la hora de evaluar las funciones o respuestas de una sola célula bajo estímulos específicos. Cada método ofrece ventajas únicas; Los estudios in vitro son esenciales para comprender las funciones específicas de estos tipos de células sin la entrada directa o indirecta de células vecinas. Además, los ensayos in vitro que utilizan líneas celulares inmortales presentan ciertos beneficios, incluida la capacidad de proliferar indefinidamente, la rentabilidad y la facilidad de mantenimiento. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las células primarias imitan más de cerca las respuestas fisiológicas normales en comparación con las líneas celulares. Esta relevancia fisiológica es crucial en los ensayos funcionales y en los análisis transcriptómicos.
Uno de los retos en la obtención de células primarias, particularmente de la médula espinal de ratones adultos, radica en la cantidad y viabilidad de las muestras. La médula espinal adulta, al ser más pequeña que el cerebro y contener una cantidad significativa de mielina, plantea dificultades únicas. Si bien existen varios protocolos publicados que detallan el aislamiento de células gliales puras y viables de animales neonatos o del cerebro de ratón adulto 10,11,12,13, estas metodologías pueden no ser adecuadas para estudiar enfermedades y lesiones específicas de la médula espinal. En este protocolo, ofrecemos un procedimiento integral para aislar de manera eficiente la microglía y los astrocitos puros y viables de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita las aplicaciones posteriores en cultivos celulares y análisis transcriptómicos. Este protocolo se ha empleado con éxito para aislar estas células de ratones adultos de 10 semanas a 5 meses, lo que demuestra su utilidad en varios contextos, incluidos estudios con ratones knockout condicionales, respuestas a fármacos, investigación del desarrollo y modelos relacionados con la edad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento de células primarias puras y viables es primordial para investigar la estructura y función de tipos celulares específicos. En el ratón adulto, particularmente en la médula espinal, esta tarea plantea desafíos significativos, ya que los protocolos existentes a menudo no se adaptan a la médula espinal adulta10,17. Este protocolo presenta un método eficiente y rentable aplicable a diversas aplicaciones posteriores, incluidos los cultivos celul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Castle Raley, del Centro de Genómica de la Universidad George Washington, por los análisis de ARN y a Q2 Lab Solutions por los análisis de secuenciación de ARN. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares [subvención número F31NS117085] y la Fundación de Investigación Vivian Gill al Dr. Robert H. Miller. La figura 1 se creó con BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Referências
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