Imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans des coupes de cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne
Summary
L’enquête préliminaire confirme que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) provoque la mort du péricyte cérébral. L’évaluation de la contractilité des péricytes après l’HSA nécessite de différencier les péricytes cérébraux viables et non viables. Par conséquent, une procédure a été mise au point pour marquer simultanément les péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes cérébrales, facilitant ainsi l’observation à l’aide d’un microscope confocal à haute résolution.
Abstract
Les péricytes sont des cellules murales cruciales situées dans la microcirculation cérébrale, essentielles à la modulation active du flux sanguin cérébral via des ajustements de la contractilité. Classiquement, leur contractilité est mesurée en observant les changements morphologiques et les changements de diamètre capillaire à proximité dans des circonstances spécifiques. Pourtant, la fixation post-tissulaire, l’évaluation de la vitalité et la contractilité péricytaire qui en résulte des péricytes cérébraux imagés sont compromises. De même, le marquage génétique des péricytes cérébraux ne permet pas de distinguer les péricytes viables des péricytes non viables, en particulier dans les affections neurologiques telles que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA), où notre enquête préliminaire valide la mort des péricytes cérébraux. Un protocole fiable a été mis au point pour surmonter ces contraintes, permettant le marquage simultané par fluorescence des péricytes cérébraux fonctionnels et non fonctionnels dans les coupes cérébrales. Cette méthode de marquage permet une visualisation au microscope confocal à haute résolution, marquant simultanément la microvascularisation de la tranche de cerveau. Ce protocole innovant permet d’évaluer la contractilité des péricytes cérébraux, son impact sur le diamètre capillaire et la structure des péricytes. L’étude de la contractilité des péricytes cérébraux dans le contexte de l’HSA permet de mieux comprendre ses effets sur la microcirculation cérébrale.
Introduction
Les péricytes cérébraux, qui se distinguent par leurs protubérances minces et leurs corps cellulaires saillants, entourent la microcirculation 1,2. Alors que l’augmentation du flux sanguin cérébral est principalement entraînée par la dilatation capillaire, les artères plus petites présentent des taux de dilatation plus lents3. La contractilité des péricytes exerce une influence sur le diamètre capillaire et la morphologie des péricytes, ce qui a un impact sur la dynamique vasculaire4. La contraction des péricytes cérébraux entraîne une constriction capillaire et, dans les scénarios pathologiques, une contraction excessive peut entraver l’écoulement des érythrocytes5. Divers facteurs, y compris la noradrénaline libérée par le locus coeruleus, peuvent induire une contraction du péricyte cérébral dans les capillaires6. Jouant un rôle régulateur dans le flux sanguin cérébral, les péricytes présentent une synthèse de 20-HETE, servant de capteur d’oxygène pendant l’hyperoxie7. La contraction des péricytes cérébraux déclenchée par le stress oxydatif-nitritif affecte négativement les capillaires5. Malgré des études in vivo et ex vivo sur la contraction des péricytes cérébraux8, les connaissances persistent concernant l’imagerie des péricytes cérébraux viables et non viables dans les coupes de cerveau.
De manière cruciale, l’imagerie post-fixation tissulaire des péricytes cérébraux compromet leur vitalité et l’évaluation ultérieure de la contractilité. De plus, dans des scénarios tels que les troubles neurologiques (par exemple, l’hémorragie sous-arachnoïdienne – SAH), le marquage transgénique des péricytes cérébraux ne parvient pas à différencier les péricytes viables et non viables, comme le confirme notre étude préliminaire sur la mort des péricytes cérébraux induite par la SAH9.
Pour surmonter ces défis, nous avons utilisé TO-PRO-3 pour marquer les péricytes vivants, tandis que les péricytes décédés ont été colorés avec de l’iodure de propidium (IP). Nous avons utilisé des technologies d’imagerie confocale à haute résolution pour visualiser les péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes de cerveau tout en préservant l’activité des tranches pendant l’imagerie. Cet article vise à présenter une méthode reproductible d’imagerie des péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes de cerveau, servant d’outil précieux pour sonder l’impact des péricytes cérébraux sur la microcirculation cérébrale après l’HSA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des techniques d’imagerie confocale à haute résolution ont été mises au point pour visualiser les péricytes cérébraux vitaux, les péricytes cérébraux non vitaux et la microvascularisation dans les coupes de cerveau. Dans les coupes aiguës de cerveau de rat, le processus implique un marquage initial des péricytes avec TO-PRO-311, suivi des cellules endothéliales microvasculaires avec IB412 ; par la suite, l’identification des péricytes décédés est effect…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81960226,81760223) ; la Fondation des sciences naturelles de la province du Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
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