הערכת רעילות עצבית אצל מבוגרים Danio rerio באמצעות סוללה של מבחנים התנהגותיים במיכל יחיד
Summary
כאן, אנו מציגים סוללת בדיקות התנהגותית מקיפה, כולל מיכל חדשני, Shoaling ומבחני העדפה חברתית, כדי לקבוע ביעילות את ההשפעות הנוירוטוקסיות האפשריות של כימיקלים (למשל, מתאמפטמין וגלייפוסט) על דגי זברה בוגרים באמצעות מכל יחיד. שיטה זו רלוונטית לנוירוטוקסיות ולמחקר סביבתי.
Abstract
נוכחותן של השפעות נוירופתולוגיות הוכיחה את עצמה, במשך שנים רבות, כנקודת הקצה העיקרית להערכת הרעילות העצבית של חומר כימי. עם זאת, ב -50 השנים האחרונות, ההשפעות של כימיקלים על ההתנהגות של מיני מודל נחקרו באופן פעיל. בהדרגה, נקודות קצה התנהגותיות שולבו בפרוטוקולי סינון נוירוטוקסיקולוגיים, ותוצאות תפקודיות אלה משמשות כיום באופן שגרתי כדי לזהות ולקבוע את הרעילות העצבית הפוטנציאלית של כימיקלים. בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים מספקות אמצעי סטנדרטי ואמין לחקר מגוון רחב של התנהגויות, כולל חרדה, אינטראקציה חברתית, למידה, זיכרון והתמכרות. בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים כוללות בדרך כלל הצבת הדגים בזירת ניסוי והקלטה וניתוח של התנהגותם באמצעות תוכנת מעקב וידאו. דגים יכולים להיחשף לגירויים שונים, וניתן לכמת את התנהגותם באמצעות מגוון מדדים. מבחן המיכל החדשני הוא אחד המבחנים המקובלים והנפוצים ביותר לחקר התנהגות דמוית חרדה בדגים. מבחני הצליפה וההעדפה החברתית שימושיים בחקר ההתנהגות החברתית של דגי זברה. בדיקה זו מעניינת במיוחד מכיוון שנלמדת התנהגותו של השואל כולו. בדיקות אלה הוכיחו את עצמן כניתנות לשחזור ורגישות למניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות, מה שהופך אותן לכלים רבי ערך לחקר המעגלים העצביים והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתנהגות. בנוסף, בדיקות אלה יכולות לשמש בסינון סמים כדי לזהות תרכובות שעשויות להיות מודולטורים פוטנציאליים של התנהגות.
בעבודה זו נראה כיצד ליישם כלים התנהגותיים בנוירוטוקסיקולוגיה של דגים, תוך ניתוח ההשפעה של מתאמפטמין, סם פנאי, וגלייפוסט, מזהם סביבתי. התוצאות מדגימות את התרומה המשמעותית של בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים להבנת ההשפעות הנוירוטוקסיקולוגיות של מזהמים סביבתיים ותרופות, בנוסף למתן תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים שעשויים לשנות את התפקוד העצבי.
Introduction
דג הזברה (שם מדעי: Danio rerio) הוא מין של חולייתני מודל פופולרי לאקוטוקסיקולוגיה, גילוי תרופות ומחקרי פרמקולוגיה בטיחותית. עלותו הנמוכה, הכלים הגנטיים המולקולריים המבוססים היטב ושימור תהליכים פיזיולוגיים מרכזיים המעורבים במורפוגנזה ובתחזוקה של מערכת העצבים הופכים את דגי הזברה למודל אידיאלי של בעלי חיים למחקר מדעי המוח, כולל טוקסיקולוגיה נוירו-התנהגותית 1,2. נקודת הקצה העיקרית להערכת הרעילות העצבית של כימיקל הייתה, עד לאחרונה, נוכחות של השפעות נוירופתולוגיות. לאחרונה, עם זאת, נקודות קצה התנהגותיות שולבו בפרוטוקולי סינון נוירוטוקסיקולוגיים, ותוצאות תפקודיות אלה משמשות כיום בדרך כלל כדי לזהות ולקבוע את הרעילות העצבית הפוטנציאלית של כימיקלים 3,4. יתר על כן, נקודות קצה התנהגותיות רלוונטיות מאוד מבחינה אקולוגית, שכן אפילו שינוי התנהגותי קל מאוד בדגים עלול לסכן את הישרדות החיה בתנאים טבעיים5.
אחד המבחנים ההתנהגותיים הנפוצים ביותר במחקר דגי זברה בוגרים הוא מבחן טנק חדשני (NTT), המודד התנהגות דמוית חרדה 6,7. בבדיקה זו, דגים נחשפים לחידוש (דגים ממוקמים במיכל לא מוכר), גירוי מרתיע קל ותגובותיהם ההתנהגותיות נצפות. NTT משמש להערכת פעילות מוטורית בסיסית, גיאוטקסים, קפיאה ותנועות לא יציבות של דגים, בעיקר. 8 לא יציב מאופיין בשינויי כיוון פתאומיים (זיגזג) ובאפיזודות חוזרות ונשנות של תאוצות (הטלת חצים). זוהי תגובת אזעקה והוא נצפה בדרך כלל לפני או אחרי פרקים הקפאה. התנהגות הקפאה מקבילה להפסקה מוחלטת של תנועות הדג (למעט תנועות אופרולריות ועיניות) בעודו בתחתית המיכל, להבדיל מחוסר תנועה הנגרם על ידי טשטוש, הגורם לתנועה היפולוקוציונית, אקינזיה ושקיעה8. הקפאה קשורה בדרך כלל למצב גבוה של מתח וחרדה והיא גם חלק מהתנהגות כנועה. התנהגויות מורכבות הן אינדיקטורים מצוינים למצב החרדה של בעלי חיים. NTT הוכח כרגיש למניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות9, מה שהופך אותו לכלי רב ערך לחקר הבסיס העצבי של חרדה והפרעות נלוות.
דגי זברה הם מין חברתי מאוד, כך שאנו יכולים למדוד מגוון רחב של התנהגויות חברתיות. מבחן השולינג (ST) ומבחן ההעדפה החברתית (SPT) הם המבחנים הנפוצים ביותר להערכת התנהגות חברתית10. ST מודד את הנטייה של דגים להתקבץ יחד11 על ידי כימות ההתנהגות המרחבית שלהם ודפוסי התנועה שלהם. ST שימושי לחקר דינמיקה קבוצתית, מנהיגות, למידה חברתית והבנת ההתנהגות החברתית של מיני דגים רבים12. ה-SPT בדגי זברה בוגרים הותאם מהעדפתו של קרולי למבחן חידוש חברתי עבור עכברים13 והפך במהרה למבחן התנהגותי פופולרי לחקר אינטראקציה חברתית במין מודל זה14. שתי בדיקות אלה הותאמו גם לשימוש בבדיקות סינון סמים והראו הבטחה לזיהוי תרכובות חדשות המווסתות התנהגות חברתית15,16.
באופן כללי, בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לספק מידע רב ערך על מנגנוני ההתנהגות או על הנוירופנוטיפים של תרכובות פעילות וסמים שעברו התעללות17. פרוטוקול זה מפרט כיצד ליישם כלים התנהגותיים אלה7 עם משאבים חומריים בסיסיים וכיצד ליישם אותם במבחני רעילות כדי לאפיין את ההשפעות של מגוון רחב של תרכובות נוירואקטיביות. בנוסף, נראה כי ניתן ליישם את אותן בדיקות כדי להעריך את ההשפעות הנוירו-התנהגותיות של חשיפה חריפה לתרכובת נוירואקטיבית (מתאמפטמין), אך גם כדי לאפיין השפעות אלה לאחר חשיפה כרונית לריכוזים סביבתיים של חומר הדברה (גלייפוסט).
Protocol
Representative Results
Discussion
התנהגויות חרדה אופייניות שנצפו ב- NTT נמצאו בקורלציה חיובית עם רמות סרוטונין שנותחו במוח21. לדוגמה, לאחר חשיפה לפארא-כלורופנילאלנין (PCPA), מעכב של ביוסינתזה של 5-HT, דגים הציגו גיאוטקסיס חיובי כמו גם ירידה ברמות 5-HT במוח22, תוצאות דומות מאוד לאלה שהתקבלו עם METH. לכן, הירידה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי “Agencia Estatal de Investigación” ממשרד המדע והחדשנות הספרדי (פרויקט PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa מרכז מצוינות (CEX2018-000794-S). ז’ולייט בדרוסיאנץ נתמכה על ידי מענק דוקטורט (PRE2018-083513) במימון משותף של ממשלת ספרד והקרן החברתית האירופית (ESF).
Materials
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
Referências
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
- Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
- Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
- . Social behavior in Zebrafish Available from: https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012)
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
- Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
- Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
- Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
- Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, (2005).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
- Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
- Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
- Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
- Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Cachat, J. M., Kalueff, A., Cachat, J., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. 51, (2011).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
- Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
- Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).
