Beoordeling van neurotoxiciteit bij volwassen Danio rerio met behulp van een reeks gedragstests in een enkele tank
Summary
Hier presenteren we een uitgebreide gedragstestbatterij, inclusief de nieuwe tank-, Shoaling- en sociale voorkeurstests, om de potentiële neurotoxische effecten van chemicaliën (bijv. methamfetamine en glyfosaat) op volwassen zebravissen effectief te bepalen met behulp van een enkele tank. Deze methode is relevant voor neurotoxiciteit en milieuonderzoek.
Abstract
De aanwezigheid van neuropathologische effecten bleek jarenlang het belangrijkste eindpunt te zijn voor de beoordeling van de neurotoxiciteit van een chemische stof. In de afgelopen 50 jaar zijn de effecten van chemicaliën op het gedrag van modelsoorten echter actief onderzocht. Geleidelijk aan werden gedragseindpunten opgenomen in neurotoxicologische screeningsprotocollen, en deze functionele uitkomsten worden nu routinematig gebruikt om de potentiële neurotoxiciteit van chemicaliën te identificeren en te bepalen. Gedragstesten bij volwassen zebravissen bieden een gestandaardiseerde en betrouwbare manier om een breed scala aan gedragingen te bestuderen, waaronder angst, sociale interactie, leren, geheugen en verslaving. Gedragstesten bij volwassen zebravissen omvatten meestal het plaatsen van de vissen in een experimentele arena en het registreren en analyseren van hun gedrag met behulp van videotrackingsoftware. Vissen kunnen worden blootgesteld aan verschillende stimuli en hun gedrag kan worden gekwantificeerd met behulp van verschillende statistieken. De nieuwe tanktest is een van de meest geaccepteerde en meest gebruikte tests om angstachtig gedrag bij vissen te bestuderen. De scholen- en sociale voorkeurstests zijn nuttig bij het bestuderen van het sociale gedrag van zebravissen. Deze test is vooral interessant omdat het gedrag van de hele school wordt bestudeerd. Deze tests hebben bewezen zeer reproduceerbaar en gevoelig te zijn voor farmacologische en genetische manipulaties, waardoor ze waardevolle hulpmiddelen zijn voor het bestuderen van de neurale circuits en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrag. Bovendien kunnen deze tests worden gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen om verbindingen te identificeren die potentiële gedragsmodulatoren kunnen zijn.
We zullen in dit werk laten zien hoe gedragsinstrumenten kunnen worden toegepast in de neurotoxicologie van vissen, waarbij we het effect van methamfetamine, een recreatieve drug, en glyfosaat, een milieuverontreinigende stof, analyseren. De resultaten tonen de significante bijdrage aan van gedragstesten in volwassen zebravissen aan het begrip van de neurotoxicologische effecten van milieuverontreinigende stoffen en medicijnen, naast het verschaffen van inzicht in de moleculaire mechanismen die de neuronale functie kunnen veranderen.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is een populaire modelsoort van gewervelde dieren voor ecotoxicologie, ontdekking van geneesmiddelen en veiligheidsfarmacologische studies. De goedkope, gevestigde moleculair genetische hulpmiddelen en het behoud van belangrijke fysiologische processen die betrokken zijn bij de morfogenese en het onderhoud van het zenuwstelsel maken zebravissen tot een ideaal diermodel voor neurowetenschappelijk onderzoek, inclusief neurogedragstoxicologie 1,2. Het belangrijkste eindpunt voor het evalueren van de neurotoxiciteit van een chemische stof was tot voor kort de aanwezigheid van neuropathologische effecten. De laatste tijd zijn gedragseindpunten echter opgenomen in neurotoxicologische screeningprotocollen, en deze functionele uitkomsten worden nu vaak gebruikt om de potentiële neurotoxiciteit van chemicaliën te identificeren en te bepalen. Bovendien zijn gedragseindpunten zeer relevant vanuit ecologisch oogpunt, aangezien zelfs een zeer milde gedragsverandering bij vissen het voortbestaan van het dier in natuurlijke omstandigheden in gevaar kan brengen.
Een van de meest gebruikte gedragstesten in het onderzoek naar volwassen zebravissen is de nieuwe tanktest (NTT), die angstachtig gedrag meet 6,7. In deze test worden vissen blootgesteld aan nieuwigheid (vissen worden in een onbekend aquarium geplaatst), een milde aversieve stimulus en hun gedragsreacties worden geobserveerd. NTT wordt voornamelijk gebruikt om basale locomotorische activiteit, geotaxis, bevriezing en grillige bewegingen van vissen te beoordelen. Grillig8 wordt gekenmerkt door abrupte richtingsveranderingen (zigzaggen) en herhaalde episodes van versnellingen (darten). Het is een alarmreactie en wordt meestal waargenomen voor of na bevriezingsepisodes. Bevriezingsgedrag komt overeen met een volledige stopzetting van de bewegingen van de vis (behalve operculaire en oculaire bewegingen) op de bodem van de tank, in tegenstelling tot immobiliteit veroorzaakt door sedatie, die hypolocobeweging, akinesie en zinken veroorzaakt8. Bevriezing is meestal gerelateerd aan een hoge staat van stress en angst en maakt ook deel uit van onderdanig gedrag. Complex gedrag is een uitstekende indicator van de staat van angst van dieren. Van NTT is aangetoond dat het gevoelig is voor farmacologische en genetische manipulatie9, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het bestuderen van de neurale basis van angst en aanverwante aandoeningen.
Zebravissen zijn een zeer sociale soort, dus we kunnen een breed scala aan sociaal gedrag meten. De ondieptetest (ST) en de sociale voorkeurstest (SPT) zijn de meest gebruikte tests om sociaal gedrag te beoordelen10. De ST meet de neiging van vissen om11 te groeperen door hun ruimtelijk gedrag en bewegingspatronen te kwantificeren. ST is nuttig voor het bestuderen van groepsdynamiek, leiderschap, sociaal leren en het begrijpen van het sociale gedrag van veel vissoorten12. De SPT in volwassen zebravissen werd aangepast van Crawley’s voorkeur voor sociale nieuwheidstest voor muizen13 en werd al snel een populaire gedragstest voor de studie van sociale interactie in deze modelsoort14. Deze twee tests zijn ook aangepast voor gebruik in drugsscreeningstests en zijn veelbelovend gebleken voor het identificeren van nieuwe verbindingen die sociaal gedrag moduleren15,16.
Over het algemeen zijn gedragstesten bij volwassen zebravissen krachtige hulpmiddelen die waardevolle informatie kunnen opleveren over de gedragsmechanismen of de neurofenotypes van actieve stoffen en misbruikte medicijnen. Dit protocol beschrijft hoe deze gedragshulpmiddelen7 kunnen worden geïmplementeerd met elementaire materiële middelen en hoe ze kunnen worden toegepast in toxiciteitstests om de effecten van een breed scala aan neuroactieve stoffen te karakteriseren. Daarnaast zullen we zien dat dezelfde tests kunnen worden toegepast om de neurologische gedragseffecten van acute blootstelling aan een neuroactieve stof (methamfetamine) te beoordelen, maar ook om deze effecten te karakteriseren na chronische blootstelling aan omgevingsconcentraties van een pesticide (glyfosaat).
Protocol
Representative Results
Discussion
Kenmerkend angstgedrag dat bij NTT is waargenomen, is positief gecorreleerd met serotoninespiegels die in de hersenen zijn geanalyseerd21. Bijvoorbeeld, na blootstelling aan para-chloorfenylalanine (PCPA), een remmer van 5-HT biosynthese, vertoonden vissen positieve geotaxis en verlaagde 5-HT-niveaus in de hersenen22, resultaten die sterk lijken op die verkregen met METH. Daarom suggereert de afname van de serotoninespiegels in de hersenen en de weergave van positieve geota…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door “Agencia Estatal de Investigación” van het Spaanse Ministerie van Wetenschap en Innovatie (project PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz werd ondersteund door een doctoraatsbeurs (PRE2018-083513) medegefinancierd door de Spaanse regering en het Europees Sociaal Fonds (ESF).
Materials
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
Referências
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
- Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
- Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
- . Social behavior in Zebrafish Available from: https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012)
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
- Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
- Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
- Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
- Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, (2005).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
- Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
- Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
- Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
- Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Cachat, J. M., Kalueff, A., Cachat, J., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. 51, (2011).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
- Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
- Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).
