Summary

在单个水箱中使用一系列行为测试对成年 Danio rerio 进行神经毒性评估

Published: November 03, 2023
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Summary

在这里,我们提出了一个全面的行为测试电池,包括新型水箱、浅滩和社会偏好测试,以有效确定使用单个水箱的化学物质(例如甲基苯丙胺和草甘膦)对成年斑马鱼的潜在神经毒性作用。这种方法与神经毒性和环境研究有关。

Abstract

多年来,神经病理学效应的存在被证明是评估化学物质神经毒性的主要终点。然而,在过去的 50 年里,人们积极研究了化学物质对模式物种行为的影响。渐渐地,行为终点被纳入神经毒理学筛查方案,这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性。成年斑马鱼的行为测定提供了一种标准化和可靠的方法来研究广泛的行为,包括焦虑、社交互动、学习、记忆和成瘾。成年斑马鱼的行为测定通常涉及将鱼置于实验场中,并使用视频跟踪软件记录和分析它们的行为。鱼可以暴露在各种刺激下,它们的行为可以使用各种指标来量化。这种新型的鱼缸测试是研究鱼类焦虑样行为的最被接受和广泛使用的测试之一。浅滩和社会偏好测试有助于研究斑马鱼的社会行为。这种测定特别有趣,因为研究了整个浅滩的行为。这些检测已被证明具有高度可重复性,并且对药理学和遗传操作敏感,使其成为研究行为背后的神经回路和分子机制的宝贵工具。此外,这些测定可用于药物筛选,以鉴定可能成为行为潜在调节剂的化合物。

在这项工作中,我们将展示如何在鱼类神经毒理学中应用行为工具,分析甲基苯丙胺(一种娱乐性药物)和草甘膦(一种环境污染物)的影响。结果表明,成年斑马鱼的行为测定对理解环境污染物和药物的神经毒理学影响做出了重大贡献,此外还提供了对可能改变神经元功能的分子机制的见解。

Introduction

斑马鱼 (Danio rerio) 是一种流行的模式脊椎动物物种,用于生态毒理学、药物发现和安全药理学研究。斑马鱼成本低廉,分子遗传工具完善,对神经系统形态发生和维持的关键生理过程的保护,使斑马鱼成为神经科学研究的理想动物模型,包括神经行为毒理学1,2。直到最近,评估化学品神经毒性的主要终点是神经病理学效应的存在。然而,最近,行为终点已被纳入神经毒理学筛查方案,这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性 3,4。此外,从生态学的角度来看,行为终点具有高度相关性,因为即使是鱼类非常轻微的行为变化也可能危及动物在自然条件下的生存5.

成年斑马鱼研究中最常用的行为测定之一是新型水箱测试 (NTT),它测量焦虑样行为 6,7。在这种测定中,鱼暴露于新奇事物(鱼被放置在不熟悉的水箱中),轻微的厌恶刺激并观察它们的行为反应。NTT 主要用于评估鱼类的基础运动活动、地质趋向性、冻结和不稳定的运动。飘忽不定的8 的特征是方向的突然变化(锯齿形)和反复的加速(飞镖)。这是一种警报反应,通常在冻结事件之前或之后观察到。冷冻行为对应于鱼在水箱底部时完全停止运动(鳃盖和眼部运动除外),这与镇静引起的不动不同,镇静引起的不动会导致运动减退、运动不能和下沉8.冻结通常与高度压力和焦虑状态有关,也是顺从行为的一部分。複雜行為是動物焦慮狀態的极好指標。NTT 已被证明对药理学和遗传操作敏感9,使其成为研究焦虑和相关疾病的神经基础的宝贵工具。

斑马鱼是一种高度社会化的物种,因此我们可以测量广泛的社会行为。浅滩试验 (ST) 和社会偏好试验 (SPT) 是评估社会行为最常用的检测方法10.ST 通过量化鱼类的空间行为和运动模式来测量鱼类组合在一起的趋势11。ST 可用于研究群体动态、领导力、社会学习和理解许多鱼类的社会行为12.成年斑马鱼的SPT改编自Crawley对小鼠13的社交新奇性测试的偏好,并迅速成为研究该模型物种14中社会互动的流行行为测定。这两种测试也适用于药物筛选分析,并显示出识别调节社会行为的新化合物的希望15,16

一般来说,成年斑马鱼的行为测定是强大的工具,可以提供有关活性化合物和滥用药物的行为机制或神经表型的宝贵信息17。该协议详细说明了如何使用基本材料资源实现这些行为工具7 ,以及如何将它们应用于毒性测定以表征各种神经活性化合物的作用。此外,我们将看到,相同的测试可用于评估急性暴露于神经活性化合物(甲基苯丙胺)的神经行为影响,也可以表征长期暴露于环境浓度的杀虫剂(草甘膦)后的这些影响。

Protocol

严格遵守道德标准保证了用于实验的斑马鱼的福利和适当待遇。所有实验程序均根据机构动物护理和使用委员会(CID-CSIC)制定的指南进行。下面介绍的协议和结果是在当地政府授予的许可下进行的(协议编号 11336)。 1. 用于行为测试的动物圈舍 在10:00至17:00之间,在27-28°C的隔离行为室中进行所有测试(如 图1所示)。 在…

Representative Results

在本节中,我们将研究这些行为工具在鱼类神经毒理学中的一些可能应用。以下结果对应于甲基苯丙胺(METH)的急性或暴饮暴食效应(一种娱乐性药物)的特征,以及草甘膦(水生生态系统中发现的主要除草剂之一)的亚慢性效应。 成年斑马鱼甲基苯丙胺暴饮暴食神经毒性模型的表征在评估 40 mg/L METH 对 NTT 的影响(图 3)时,Kruskal-Walli…

Discussion

在 NTT 中观察到的特征性焦虑行为与大脑中分析的血清素水平呈正相关21.例如,在暴露于对氯苯丙氨酸(PCPA),一种5-HT生物合成的抑制剂后,鱼类表现出积极的趋向性以及大脑5-HT水平的降低22,结果与MEH获得的结果非常相似。因此,暴露于甲基苯丙胺的斑马鱼中大脑血清素水平的降低和正向地理趋向性的表现表明,药物产生的焦虑行为是由血清素能途径介导的…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了西班牙科学与创新部的“Agencia Estatal de Investigación”(项目 PID2020-113371RB-C21)、IDAEA-CSIC、Severo Ochoa 卓越中心 (CEX2018-000794-S) 的支持。朱丽叶·贝德罗西安茨(Juliette Bedrossiantz)得到了西班牙政府和欧洲社会基金(ESF)共同资助的博士资助(PRE2018-083513)。

Materials

Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

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Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

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