スクリーニング応用のためのヒトiPS細胞由来神経細胞-アストロサイト共培養の3次元バイオプリンティング

1. 3Dモデルのバイオプリンティング プレートマップと印刷ファイルの生成モデルを生成する前に、プレートマップソフトウェアを使用して、プレートマップ、プロトコル、および印刷ファイルを生成します。プレートマップソフトウェアを開き、[ 細胞を3Dで培養 ]オプションを選択します。 ドロップダウンメニューの利用可能なオプションからバイオプリントするモデルタイプを選択します。このモデルは、イメージングモデルおよびHTPモデル形式で検証されています。96ウェルプレートにはイメージングモデルを、384ウェルプレートにはHTPを選択します。 マトリックス選択ウィンドウで、ラミニン-211およびヒアルロン酸タンパク質を含むハイドロゲルPx02.53と、IKVAV、RGD、およびYIGSRペプチドを選択します。 ポップアップウィンドウで、細胞タイプに 「Glutamatergic Neurons and Astrocytes 」、細胞密度に「2,000万細胞/mL」と入力します。 ソフトウェアを使用して、画面上のプレート上のウェルを強調表示することにより、目的のプレートマップを設計します。設計には、 プラスチック上の 2D コントロール を少なくとも 1 行含めます。 プラスチックウェルの2D制御 は、ハイドロゲルの足場なしでウェルに直接堆積されたセルで構成されています。ステップ1.2に従ってこれらのウェルをコーティングします。 ウィンドウの上部にリストされているプレートモデルが、使用するプレートモデルに変更されていることを確認します( 材料表を参照)。 ダウンロードボタンを使用してプレートマップのプロトコルと印刷ファイルをダウンロードし、バイオプリンターにリンクされたコンピューターに保存します。 プラスチックウェルへの2D制御のコーティングプリントの少なくとも24時間前に、細胞の接着と増殖のために2Dコントロールモデル用のウェルをコーティングします。3Dモデルウェルは、事前コーティングを必要としません。すべてのプロセスは、特に明記されていない限り、バイオセーフティキャビネットで実施する必要があります。版は、印刷の7日前までコーティングして準備することができます。 2.5 mL の 20 倍ホウ酸ストック溶液を 47.5 mL の滅菌 dH2O で希釈して、50 mL の 1x ホウ酸バッファーを調製します。 100 μL の 50% (w/v) ポリエチレンイミン (PEI) を 50 mL の 1x ホウ酸バッファーに添加して 0.1% (w/v) PEI 溶液を調製し、0.22 μm フィルターを通して滅菌フィルターを通します。 ステップ 1.1 で生成したプレートマップに示されているように、各 2D コントロールウェルに 0.1% (w/v) PEI 溶液を追加します。96ウェルプレートを使用する場合は100 μL/ウェル、384ウェルプレートを使用する場合は25 μL/ウェルを添加します。 プレートを37°Cで2時間インキュベートしてから、0.1%(w/v)PEI溶液を吸引し、ウェルをPBSで5回すすぎます。バイオセーフティキャビネットでウェルを完全に乾燥させます。 100 μL の 1 mg/mL ラミニン溶液を 5 mL の神経基底培地で希釈します。96ウェルプレートを使用する場合は各2Dコントロールウェルに100 μL、384ウェルプレートを使用する場合は25 μLを添加します。37°Cで4時間インキュベートします。 プレートを保存する場合は、インキュベーション後にラミニン溶液をそのままにして、4°Cで保存してください。 使用前にプレートを37°Cで1時間予熱してください。 共培養モデルの3Dバイオプリンティングバイオプリンターを使用する際は、常に滅菌技術を維持し、手袋、カートリッジ、培養プレートを70%EtOHで拭いてからプリンター内部に入れてください。特に明記されていない限り、バイオプリンターの外部ですべてのプロセスをバイオセーフティキャビネットで実行してください。 バイオプリンターのコンプレッサーをオンにし、バイオプリンターソフトウェアの[初期化]ボタンを選択してプリンターを 初期化 します。プリンタ内の空気の流れが始まったら、70%EtOHワイプでプリンタ内部の表面を拭きます。 印刷当日に、ガイド付きの Start of Day Greenlighting プロセスを実行して、印刷実行の正しいノズル状態(最小ノズル状態2A2B)を確認します。 滅菌パッケージからバイオプリンターカートリッジを取り出し、コンパートメントAに滅菌dH2Oを20 mL添加し、コンパートメントB1〜4に滅菌ろ過した70%EtOHを6 mL加えます。カートリッジをバイオプリンター内部の左側のカートリッジホルダーに挿入し、プレートの蓋を専用の蓋ホルダーに入れます。 ソフトウェアのホーム画面で [グリーンライト ]ボタンを選択し、カートリッジがバイオプリンター内の所定の位置にあり、蓋が取り外されていることをソフトウェアで確認します。グリーンライト プロセスを開始します。 ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、左右の針から一貫した滴りが見られないことを確認します。続いて、ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、B7およびB8コンパートメントに水が存在することを確認します。 バイオプリンターがセルフガイドのグリーンライトステップを完了した後、コーティングされていない滅菌済み96ウェルフラットボトムプレート(バイオプリンティング共培養用のコーティングプレートとは別)を挿入し、ソフトウェアのプロンプトに従ってこの新しいプレートをバイオプリンターの右側のプレートホルダーセクションに挿入します。次の手順を開始する前に、プレートホルダーが ハイプロファイルプレートに設定され、蓋を取り外して専用の蓋ホルダーに配置していることを確認してください。 バイオプリンターは、96ウェルプレートの各ウェルに水滴を堆積させます。完了したら、バイオプリンターからプレートを置き、プレートの各ウェルに水滴が存在することを確認します。 グリーンライティングに使用した96ウェルプレートを廃棄し、バイオプリンターがグリーンライトプロセスを終了するのを待ちます。完了すると、ソフトウェアはバイオプリンターのノズルの状態を示し、バイオプリンターがモデルを印刷する準備ができていることを確認します。プリントカートリッジに蓋を置き、次のステップのためにバイオセーフティキャビネットに取り外します。 バイオプリンターソフトウェアを使用して、印刷実行ソフトウェアボタンを使用して印刷ファイル(ステップ1.1で生成) をソフトウェアに ロードし、印刷プロトコルpdfを開きます。 印刷プロトコルのPDFに示されているように、バイオインクとアクチベーター液を-20°Cから取り出し、室温(RT)で40分間解凍します。ハイドロゲルマトリックス Px02.53 の場合、これには 1x バイアル F32、1xvial F3、1x バイアル F261、1x バイアル F299 が含まれます。バイオインクや活性剤の液体を手や水浴で解凍しないでください。 バイオインクとアクチベーター液を融解している間に、ドキシサイクリンとROCK阻害剤を含む完全培地(完全培地+DOX/ROCKi)(ステップ2.2を参照)をRTに50 mL持ち込みます。 バイオインクと活性剤が解凍されたら、生成された印刷プロトコルpdfの最後の2ページの指示に従って印刷カートリッジを準備します。グリーンライトプリンターカートリッジは、モデルの印刷段階で再利用されます。区画 A1 に 40 mL の dH2O があり、区画 B1 および B2 に 8 mL の 70% EtOH があることを確認します。活性化剤 F32 1.2 mL を C1 に、F3 1.2 mL を C2 に、F261 200 μL を C4 に加えます。 インキュベーターからPEIとラミニンコーティングされたプレートを取り出し、プリンター内の右側のプレートホルダーコンパートメントに置きます。この時点では、ラミニン培地溶液をウェルから取り出さないでください。プレートホルダーコンパートメントが ロープロファイルプレート に設定され、蓋が取り外されて蓋ホルダーに入れられていることを確認します。 プリントカートリッジをバイオプリンターに挿入し、蓋が取り外されてホルダーに入れられていることを確認し、バイオプリンターソフトウェアの [不活性ベースの 印刷]ボタンを選択して、ソフトウェアで印刷の実行を開始します。 不活性塩基が印刷されている間に、グルタミン酸作動性ニューロンおよびアストロサイトのバイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、セクション2の指示に従って再懸濁します。 細胞を融解し、8 mLの完全培地+DOX/ROCKiを各細胞タイプに別々に添加したら(セクション2に従って)、細胞を300 x g で5分間室温で遠心分離します。 上清を吸引し、両方の細胞タイプを1 mLの完全培地+DOX/ROCKiに別々に再懸濁します。 20 μL の細胞懸濁液を 20 μL のトリパンブルーに加え、細胞を計数する前に混合して、各細胞タイプの mL あたりの生細胞濃度を決定します。 合計 300 万個のグルタミン酸作動性ニューロンと 100 万個のアストロサイトを 15 mL チューブで組み合わせます。培地を添加して、合計容量8 mLにします。 細胞を300 x g で5分間室温で遠心分離します。 細胞ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引し、細胞ペレットを200μLの活性剤液F299に再懸濁します。 アクティベーター液は粘性があることに注意してください。ピペットを上下に動かして、ペレットを完全に再懸濁します。細胞の種類はデリケートです。せん断や気泡を最小限に抑えるには、口径の広いピペットチップとリバースピペッティング技術を使用します。細胞の損失を防ぐために、ピペットでしっかりと上下に3回以内にしてください。 不活性ベースステージの印刷が終了したら、カートリッジと培養プレートに蓋を置き、両方をバイオプリンターから取り外してバイオセーフティキャビネットに入れます。 F299の細胞懸濁液200 μLをプリントカートリッジのウェルC3に加え、カートリッジをバイオプリンターに再挿入し、蓋を外して蓋ホルダーに入れます。培養プレートをまだ再挿入しないでください。 印刷実行の 印刷モデル ステージを開始します。バイオプリンターが液体をプライミングしている間に、プレートの2Dコントロールウェルからラミニン培地溶液を取り出し、96ウェルプレートを使用する場合は各2Dコントロールウェルで150 μLの完全培地+DOX/ROCKiと交換し、384ウェルプレートを使用する場合は50 μLの完全培地+DOX/ROCKiと交換します。 液体がプライミングされたら、バイオプリンティングターゲティングプレートをバイオプリンターに挿入し、蓋を外して蓋ホルダーに入れます。 バイオプリンターのターゲット設定プロセスを開始します。バイオプリンティングソフトウェアのプロンプトが表示されたら、バイオプリンターからターゲティングプレートを取り外します。 ガイドを使用して、プレート上の液滴を観察できる場所を選択します。ターゲットプレートをバイオプリンターに再挿入し、液滴の印刷と選択プロセスを繰り返します。 プロンプトが表示されたら、ターゲティングプレートを再度取り外し、細胞培養プレート(ステップ 1.3.25 に従って 2D コントロールウェルに培地を含む)と交換します。培養プレートの蓋が外れ、ホルダーに置かれていることを確認します。バイオプリンターが模型印刷を終了します。 モデルプリントが完了したら、セクション2(ステップ2.8)の細胞培養方法に従って、ウェルに培地を添加します。 バイオプリンターのクリーニングプロセスを開始し、完了したら、ラボのプロトコルに従ってカートリッジと残りの液体を廃棄します。 2. 細胞培養 モデルは、グルタミン酸作動性ニューロンのバイアル1本(バイアルあたり500万>細胞)とアストロサイトのバイアル1本(バイアルあたり>100万細胞)を使用して生成されます。 ウォーターバスを37°Cに予熱します。 両方の細胞バイアルをドライアイス上でラボに輸送し、ドライアイスから取り出した直後に水浴に浸します。両方のバイアルを同時に解凍します。 小さな氷の結晶だけが残っているときに、水浴からバイアルを取り出します。浸漬後、約3分かかります。水浴で細胞を渦巻かせたり混ぜたりしないでください。 バイアルに70%EtOHをスプレーし、バイオセーフティキャビネットに移します。 500 μL の完全培地 +DOX/ROCKi を各バイアルに滴下してから、各懸濁液を別々の 15 mL チューブに移します。 各チューブの培地を 8 mL に補充し、ステップ 1.3 に従ってバイオプリンティングステップに進みます。 バイオプリンティングモデル(ステップ1.3)に続いて、直ちにすべての3D共培養ウェルに完全な培地+ DOX / ROCKiを追加し、モデルを37 °Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。96ウェルプレートを使用する場合は、ウェルあたり150 μLの培地を添加します。384ウェルプレートを使用する場合は、ウェルあたり50 μLの培地を使用します。 培養の最初の48時間には培地の交換は必要ありません。 2Dコントロールおよびモデルで培地交換を行う場合は、2D培養液の剥離やハイドロゲルの変形を引き起こす可能性のある機械的ストレスを誘発しないように注意する必要があります。培地の吸引と添加は、ウェルの側面を下向きにしたマイクロピペットを使用してゆっくりと行います。 48時間後、すべてのウェルで90%の培地交換を行い、培地組成物からROCKiを除去します(ステップ2.14を参照)。 96-時間後、すべてのウェルでさらに90%の培地交換を行い、培地組成物からDOXを除去します(ステップ2.14を参照)。 48時間と96時間の2回の90%培地交換に続いて、48時間ごとに50%の培地交換を行い、培地の50%を吸引し、新しい完全な培地と交換します メディア構成:コンプリート培地:GlutaMAX 1x GlutaMAX、B27 x 12.5 nM 2-メルカプトエタノール、NT3 10 ng/mL、BDNF 5 ng/μL を含む神経基底培地。 完全培地とドキシサイクリン(DOX):GlutaMAX 1 個、B27 1 個、12.5 nM 2-メルカプトエタノール、10 ng/mL のニューロトロフィン-3(NT3)、5 ng/μL の脳由来神経栄養因子(BDNF)、1 μg/mL のドキシサイクリンを含む神経基底培地。 完全培地とDOX/ROCK阻害剤(ROCKi):GlutaMAX 1個、B27 個1個、12.5 nM 2-メルカプトエタノール、NT3 10 ng/mL、BDNF 5 ng/μL、ドキシサイクリン1 μg/mL、ROCK阻害剤10 μMを含む神経基底培地。 3. 神経突起成長解析 バイオプリンティング後の培地添加後すぐに明視野イメージングのために細胞を生細胞顕微鏡に入れます。 顕微鏡ソフトウェアを使用して、2Dコントロールを含むすべてのウェルで、12時間ごとに少なくとも7日間、細胞を4倍の倍率でイメージングするようにスケジュールします。 セクション2で詳述したように、48時間ごとに培地交換を行い、その都度培地交換後に細胞を顕微鏡に戻します。 7日間のデータの後、ソフトウェアから.jpg形式で画像をエクスポートします .jpg画像をすべてImageJソフトウェアにインポートし、ファイルを8ビット形式に変換します。 NeuronJ プラグインをロードし、トレース ツールを使用して、分岐点を含む画像内の神経突起の成長を追跡します。 NeuronJ から生成された神経突起追跡データを使用して、神経突起伸長を経時的にプロットします。 4. 細胞生存率解析 培養の24時間ごとに、生/死生存率キットを使用して細胞生存率分析のために3つ以上のウェルを染色します。研究期間中、24時間または48時間の時点でこのステップを繰り返します。 イメージングの30分前に、生細胞試薬(1x Calcein-AM)と死細胞試薬(1x ethidium homodimer-1)および1x 生細胞核染色試薬(Hoechst 33342)をフェノールレッドを含まない還元血清培地(Opti-MEM)10 mLに懸濁して、生/死試薬培地を調製します。生/死試薬培地をRTに取り込みます。 生試薬/死試薬培地は、蛍光漂白により直射日光を避けて保管してください。 細胞モデル/2Dコントロールを含む3つのウェルから培地を除去し、ゲルの乱れを慎重に防止します。細胞モデルをRT滅菌PBSで一度洗浄します。96ウェルプレートの場合は各ウェルに100 μL、384ウェルプレートの場合は25 μLの生試薬/死試薬培地を添加します。 モデルを37°C、5%CO2で30分間インキュベートします。 インキュベーション後、モデルはイメージングの準備が整います。赤(647 nm、死細胞)、緑(488 nm、生細胞)、青(405 nm、核染色)の励起チャンネルを備えた標準的な顕微鏡でイメージングを行います。3Dモデルで最良の結果を得るには、ハイコンテント共焦点顕微鏡を使用してモデルを画像化し、4倍または10倍の倍率でZスタック機能を使用してイメージングを実行します。注:この研究では、INCell Analyzer 6500HS(ハイコンテントイメージングシステム)を使用して細胞モデルをイメージングし、Signals Image Artist(画像解析プラットフォーム、ステップ4.7を参照)を使用して分析を行いました。 イメージングが完了したら、細胞モデルを37°C、5%CO2 の細胞培養インキュベーターに戻します。ただし、生存率分析に用いた細胞モデルは、長期生存率に関する生死試薬培地のため、さらなる研究から除外してください。 画像解析プラットフォーム上での画像解析ソフトウェアでZスタックイメージの各平面を選択します。平面イメージを最大強度投影イメージとして結合します。 488 nmの生細胞チャンネルからの蛍光を同定し、バイオプリントモデルを関心領域(ROI)として選択して、新しい分析を作成します(ROIですべての細胞が選択されていることを確認します)。 関心領域内で、イメージングソフトウェアを使用して、核染色チャンネル(405 nm)を介してROI内の細胞数を、488 nmチャネルを使用してROI内の生細胞数を、647 nmチャネルを使用してROI内の死細胞数を特定します。 すべての生細胞/死細胞モデルウェルで解析を実行し、ROI面積、総細胞数、生細胞数、死細胞数を含むデータテーブルをエクスポートします。 生細胞と死細胞の数を、分析日ごとの総細胞数に対する割合として計算します。 5. 免疫染色と細胞集団解析 固定する前に、細胞モデルから培地を取り除き、PBSでモデルを一度洗浄します。 細胞をPBS中の4%(v/v)パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。注意: パラホルムアルデヒドを使用するすべての作業は、実験室の手順に従って実行する必要があります。 モデルから4%(v/v)のパラホルムアルデヒド溶液を吸引し、PBSでモデルを4回洗浄してパラホルムアルデヒドを完全に除去します。 細胞モデルを0.2%トリトン-Xで室温で30分間透過処理し、PBSで3回洗浄します。 10%(v/v)の正常ロバ血清(NDS)を用いて、室温で3時間細胞モデルをブロッキングします。 ブロッキング溶液を除去し、一次抗体(PBS中の1% v/v NDSに希釈)をモデルに添加します。細胞集団比解析(ステップ5.11参照)を行う場合は、Β-IIIチューブリン(赤色AF647結合)およびGFAP(緑色AF488結合)を共染色した細胞モデルを必ず含めてください。一次抗体を含むモデルを4°Cで24時間インキュベートします。 一次インキュベーション後、標識一次抗体で染色したモデルをPBSで3回洗浄し、20 μM Hoechstで30分間対比染色します。手順5.10で詳述した画像。 非標識一次抗体で染色したモデルをPBSで3回洗浄し、二次抗体(PBSで1%v/v NDSに希釈)を添加します。4°Cで24時間インキュベートします。 PBSで3回洗浄して二次抗体を除去し、イメージング前に20 μM Hoechstで30分間対比染色します。 赤色(647 nm)と緑色(488 nm)の励起チャンネルを備えた標準的な顕微鏡でイメージングを行います。ただし、3Dモデルで最良の結果を得るには、ハイコンテント共焦点顕微鏡を使用してモデルを画像化し、4倍または10倍の倍率でZスタック機能を使用してイメージングを実行します。 画像解析プラットフォーム上での細胞集団率の解析GFAP(AF488 結合)と Β-III チューブリン(AF647 結合)を共染色したモデルを使用して、細胞集団の解析を行います。 ソフトウェアで Z スタック イメージの各平面を選択し、平面イメージを最大強度の投影イメージとして結合します。 647 nmのΒ-IIIチューブリンチャネルからの蛍光を同定し、バイオプリントモデルをROIとして選択して、新しい分析を作成します(ROIですべての細胞含有領域が選択されていることを確認してください)。 ROI内で、ソフトウェアを使用して、Hoechstチャネル(405 nm)の細胞数、488 nmチャネルを使用してROI内のGFAP+アストロサイトの数、および647 nmチャネルを使用してROI内のΒ-IIIチューブリン+細胞の数を特定します。 共染色したすべての細胞モデルウェルで分析を実行し、ROI面積、総細胞数、GFAP+細胞数、およびΒ-IIIチューブリン+細胞数を含むデータテーブルをエクスポートします。 GFAP+およびΒ-IIIチューブリン+細胞の数を、総細胞数に対する割合として計算します。