Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

Chloe  Ann Whitehouse; Yufang He; Janet Brownlees; Nicola Corbett

doi:10.3791/65856

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurociência

Bio-impression tridimensionnelle de cocultures neurones-astrocytes humaines dérivées d’iPSC pour des applications de criblage

Published: September 29, 2023

doi:

10.3791/65856

Chloe Ann Whitehouse¹, Yufang He², Janet Brownlees¹, Nicola Corbett¹

¹MSD Research Laboratories, London, UK, ²Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

Summary

Nous présentons ici un protocole pour produire des cocultures bio-imprimées en 3D de neurones et d’astrocytes dérivés d’iPSC. Ce modèle de coculture, généré à l’intérieur d’un échafaudage d’hydrogel dans des formats de 96 ou 384 puits, démontre une viabilité post-impression élevée et une croissance des neurites en 7 jours et montre l’expression de marqueurs de maturité pour les deux types de cellules.

Abstract

Pour qu’un modèle cellulaire soit viable pour le criblage de médicaments, le système doit répondre aux exigences de débit et d’homogénéité tout en ayant un temps de développement efficace. Cependant, de nombreux modèles 3D publiés ne répondent pas à ces critères. Cela limite donc leur utilité dans les premières applications de découverte de médicaments. La bio-impression tridimensionnelle (3D) est une nouvelle technologie qui peut être appliquée au développement de modèles 3D afin d’accélérer le temps de développement, d’augmenter la standardisation et d’augmenter le débit. Nous présentons ici un protocole pour développer des modèles de coculture bio-imprimés en 3D de neurones et d’astrocytes glutamatergiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC). Ces cocultures sont intégrées dans une matrice hydrogel de peptides bioactifs, de protéines de matrice extracellulaire (MEC) pleine longueur, et avec une rigidité physiologique de 1,1 kPa. Le modèle peut être rapidement établi dans les formats 96 puits et 384 puits et produit une viabilité post-impression moyenne de 72 %. Le rapport astrocyte/neurone dans ce modèle est de 1 :1,5, ce qui se situe dans la plage physiologique du cerveau humain. Ces populations cellulaires bio-imprimées en 3D montrent également l’expression de marqueurs de type de cellules neurales matures et la croissance des projections de neurites et d’astrocytes dans les 7 jours suivant la culture. Par conséquent, ce modèle est adapté à l’analyse à l’aide de colorants cellulaires et de techniques d’immunomarquage ainsi que de tests de croissance neuritaire. La capacité de produire ces modèles physiologiquement représentatifs à grande échelle les rend idéaux pour une utilisation dans les tests de criblage à débit moyen à élevé pour les cibles neuroscientifiques.

Introduction

La recherche sur les maladies du système nerveux central (SNC) dans l’industrie de la découverte de médicaments est en expansion¹. Cependant, de nombreuses maladies du SNC répandues telles que l’épilepsie, la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer n’ont toujours pas de traitement curatif ^2,3,4. Le manque de traitements efficaces dans les maladies du SNC peut, au moins en partie, être attribué à un manque de modèles in vitro précis du cerveau⁵. Il en est résulté un écart de traduction entre les modèles in vitro actuels et les données in vivo et un goulot d’étranglement subséquent dans les efforts de recherche.

En raison de cette lacune translationnelle, il y a eu une augmentation significative du développement de nouveaux modèles cellulaires 3D au cours des dernières années, y compris les organoïdes neuronaux, les neurosphéroïdes et les modèles basés sur des échafaudages⁶. La structure 3D de ces modèles aide à récapituler le microenvironnement neuronal, y compris les contraintes biomécaniques, les contacts cellule-cellule et la matrice extracellulaire (MEC^{) du} cerveau7. La MEC cérébrale est un élément dynamique de la neurophysiologie qui occupe l’espace entre les types de cellules neurales, y compris les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et l’unité neurovasculaire⁷. Il a été démontré que la récapitulation de la MEC cérébrale affecte la morphologie neuronale et la décharge neuronale, et de nombreux modèles 3D complexes du cerveau ont démontré le dépôt de protéines ECM par les types de cellules neurales 8,9,10,11. Les modèles basés sur des échafaudages sont constitués de cocultures neuronales matures en suspension dans une matrice d’hydrogel synthétique ou biologique poreuse qui représente l’ECM¹² du cerveau. Contrairement aux systèmes organoïdes et sphéroïdes, les modèles 3D basés sur des échafaudages permettent la personnalisation des protéines ECM présentes et présentent l’avantage supplémentaire de l’accordabilité de la rigidité de l’hydrogel pour imiter les contraintes biomécaniques^13,14.

Bien qu’une écrasante majorité des modèles neuronaux 3D démontrent une récapitulation accrue du microenvironnement cérébral, tous les modèles ne sont pas bien adaptés à la mise en œuvre d’applications de découverte de médicaments¹⁵. Pour qu’un modèle 3D puisse être mis en œuvre dans des processus industriels, le système doit répondre aux exigences de débit pour les applications de criblage et avoir un temps de développement relativement court¹⁶. La bio-impression 3D est une nouvelle technologie qui offre le potentiel de créer des modèles neuronaux basés sur des échafaudages 3D avec un temps de développement rapide, un débit accru et des niveaux de contrôle de précision plus élevés, ainsi que la suppression de la variabilité causée par l’erreur humaine¹⁷. Ce protocole présente un modèle de coculture 3D de neurones glutamatergiques et d’astrocytes humains dérivés d’iPSC dans un échafaudage d’hydrogel. Cet échafaudage en hydrogel contient des peptides bioactifs physiologiquement représentatifs (RGD, IKVAV, YIGSR) et des protéines ECM dans une rigidité biomécanique mimétique. Ces protéines ECM pleine longueur comprennent la laminine-211 pleine longueur et l’acide hyaluronique, abondants dans le cortex humain, avec une rigidité de 1,1 kPa en ligne avec les mesures in vivo ¹⁸. Ce modèle est conçu de manière pratique pour la découverte de médicaments et est créé à l’aide d’une bio-imprimante 3D dans un format de plaque à 96 ou 384 puits adapté à l’analyse de criblage à l’aide de techniques d’imagerie avec des colorants cellulaires et des anticorps, ainsi que des tests de croissance des neurites. Les cellules montrent l’expression de marqueurs de type de cellules neurales et la croissance de projections neurites et astrocytaires dans les 7 jours suivant la culture. Ainsi, ce protocole présentera la méthodologie pour développer un modèle de coculture neuronale 3D à haut débit destiné à être utilisé dans des applications de découverte de médicaments.

Figure 1 : Aperçu illustratif de la méthodologie utilisée pour les cocultures de bio-impression 3D. Les neurones et les astrocytes humains dérivés d’iPSC sont combinés avec des solutions d’activateurs et de bio-encres contenant des peptides bioactifs et sont bio-imprimés sur des échafaudages en hydrogel dans des formats de 96 puits ou 384 puits à l’aide de la technologie de bio-impression goutte à goutte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Bio-impression de modèles 3D Génération d’une carte de plaque et d’un fichier d’impressionAvant de générer le modèle, générez une carte de plaques, un protocole et un fichier d’impression à l’aide du logiciel de carte de plaques. Ouvrez le logiciel de cartographie des plaques et sélectionnez l’option Cellules de culture en 3D . Sélectionnez le type de modèle à bioimprimer parmi les options disponibles dans le menu déroulant ; ce modèle a été validé dans les formats de modèle d’imagerie et de modèle HTP . Sélectionnez Modèle d’imagerie pour les plaques à 96 puits et HTP pour les plaques à 384 puits. Dans la fenêtre Sélection de la matrice , sélectionnez Hydrogel Px02.53, contenant de la laminine-211 et des protéines d’acide hyaluronique, avec des peptides IKVAV, RGD et YIGSR. Dans la fenêtre contextuelle, entrez les types de cellules en tant que neurones glutamatergiques et astrocytes et entrez la densité cellulaire de 20 millions de cellules/mL. Utilisez le logiciel pour concevoir la carte de plaques souhaitée en mettant en surbrillance les puits sur la plaque à l’écran. Incluez au moins 1 rangée de contrôle 2D sur plastique dans la conception. Le contrôle 2D sur les puits en plastique consiste en des cellules déposées directement dans le puits sans aucun échafaudage d’hydrogel ; Enduisez ces puits conformément à l’étape 1.2. Assurez-vous que le modèle de plaque indiqué en haut de la fenêtre est remplacé par le modèle de plaque prévu pour l’utilisation (voir le tableau des matériaux). Téléchargez le protocole et le fichier d’impression de la carte des plaques à l’aide des boutons de téléchargement et enregistrez-les sur l’ordinateur relié à la bio-imprimante. Revêtement de contrôle 2D sur puits en plastiqueAu moins 24 h avant l’impression, enduisez les puits pour les modèles de contrôle 2D de l’adhérence et de la croissance des cellules. Les puits de modèle 3D ne nécessitent aucun pré-revêtement. Tous les processus doivent être effectués dans une enceinte de sécurité biologique, sauf indication contraire. Les plaques peuvent être revêtues et préparées jusqu’à 7 jours avant l’impression. Préparer 50 mL de tampon 1x borate en diluant 2,5 mL de solution mère 20x borate avec 47,5 mL de dH2O stérile. Ajouter 100 μL de polyéthylèneimine (PEI) à 50 mL de tampon 1x borate pour créer une solution PEI à 0,1 % (p/v) et un filtre stérile à travers un filtre de 0,22 μm. Ajouter 0,1 % (p/v) de solution PEI à chaque puits témoin 2D, comme l’indique la carte des plaques générée à l’étape 1.1. Ajouter 100 μL/puits si vous utilisez une plaque à 96 puits ou 25 μL/puits si vous utilisez une plaque à 384 puits. Incuber la plaque pendant 2 h à 37 °C avant d’aspirer la solution PEI à 0,1 % (p/v) et de rincer les puits 5 fois avec du PBS. Laissez les puits sécher complètement dans l’enceinte de sécurité biologique. Diluer 100 μL de solution de laminine à 1 mg/mL dans 5 mL de milieu neurobasal. Ajouter 100 μL à chaque puits de contrôle 2D si vous utilisez une plaque à 96 puits ou 25 μL si vous utilisez une plaque à 384 puits. Incuber pendant 4 h à 37 °C. Si vous stockez des plaques, laissez la solution de laminine en place après l’incubation et conservez-la à 4 °C. Préchauffez les plaques pendant 1 h à 37 °C avant utilisation. Bio-impression 3D de modèles de cocultureMaintenez toujours une technique stérile lors de l’utilisation de la bio-imprimante et essuyez les gants, les cartouches et les plaques de culture avec 70 % d’EtOH avant de les mettre à l’intérieur de l’imprimante. Sauf indication contraire, effectuez tous les processus à l’extérieur de la bio-imprimante dans une enceinte de sécurité biologique. Allumez le compresseur de la bio-imprimante et initialisez l’imprimante en sélectionnant le bouton Initialiser du logiciel de la bio-imprimante. Une fois que le flux d’air dans l’imprimante a démarré, essuyez les surfaces à l’intérieur de l’imprimante avec une lingette EtOH à 70 %. Le jour de l’impression, entreprenez le processus guidé de début de journée Greenlighting pour vous assurer que l’état de la buse est correct pour le tirage (état minimum de la buse 2A2B). Prenez une cartouche de bioimprimante dans l’emballage stérile, ajoutez 20 mL de dH2O stérile dans le compartiment A et ajoutez 6 mL d’EtOH à 70 % filtré stérile dans les compartiments B1 à 4. Insérez la cartouche dans le porte-cartouche gauche à l’intérieur de la bio-imprimante et placez le couvercle de la plaque dans le support de couvercle dédié. Sélectionnez le bouton Greenlighting sur l’écran d’accueil du logiciel et confirmez sur le logiciel que la cartouche est en place dans la bio-imprimante et que le couvercle a été retiré. Lancez le processus de feu vert. Lorsque le logiciel vous y invite, vérifiez qu’aucune goutte constante n’est visible sur les aiguilles gauche ou droite. Par la suite, lorsque le logiciel vous le demande, vérifiez que de l’eau est présente dans les compartiments B7 et B8. Une fois que la bio-imprimante a terminé l’étape d’auto-éclairage vert, insérez une plaque à fond plat stérile non couchée à 96 puits (séparée de la plaque couchée pour les cocultures de bio-impression) et insérez cette nouvelle plaque dans la section de support de plaque droite de la bioimprimante lorsque le logiciel vous y invite. Assurez-vous que le support de plaque est réglé sur High Profile Plate et que le couvercle est retiré et placé dans le support de couvercle dédié avant de commencer l’étape suivante. La bio-imprimante déposera des gouttelettes d’eau dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Une fois terminé, placez la plaque de la bio-imprimante et vérifiez que des gouttelettes d’eau sont présentes dans chaque puits de la plaque. Jetez la plaque à 96 puits utilisée pour le feu vert et laissez la bio-imprimante terminer le processus de feu vert. Une fois l’opération terminée, le logiciel indique l’état de la buse de la bio-imprimante et confirme que la bio-imprimante est prête à imprimer des modèles. Placez le couvercle sur la cartouche d’impression et retirez-le dans l’enceinte de sécurité biologique pour les étapes suivantes. À l’aide du logiciel de la bio-imprimante, chargez le fichier d’impression (généré à l’étape 1.1) dans le logiciel à l’aide du bouton Imprimer le logiciel et ouvrez le protocole d’impression pdf. Récupérer l’encre bio et les fluides activateurs, comme indiqué sur le protocole d’impression pdf, à -20 °C et décongeler à température ambiante (RT) pendant 40 min. Pour la matrice d’hydrogel Px02.53, cela comprendra : 1x flacon F32, 1xfial F3, 1x flacon F261, 1x flacon F299. Ne pas décongeler l’encre biologique et les liquides activateurs dans les mains ou les bains-marie. Apporter 50 mL de média complet contenant de la doxycycline et un inhibiteur de ROCK (média complet +DOX/ROCKi) (voir l’étape 2.2) à RT pendant la décongélation de l’encre biologique et des fluides activateurs. Une fois les bio-encres et les activateurs décongelés, préparez la cartouche d’impression comme indiqué sur les deux dernières pages du pdf du protocole d’impression généré. La cartouche d’imprimante Greenlighting sera réutilisée pour les étapes d’impression du modèle.S’assurer qu’il y a 40 mL de dH2O dans le compartiment A1 et 8 mL d’EtOH à 70 % dans les compartiments B1 et B2. Ajouter 1,2 mL d’activateur F32 à C1, 1,2 mL de F3 à C2 et 200 μL de F261 à C4. Récupérez la plaque PEI et la plaque laminée de l’incubateur et placez-la à l’intérieur de l’imprimante dans le compartiment de droite du support de plaque. Ne retirez pas la solution laminin-média des puits à ce stade. Assurez-vous que le compartiment du porte-plaque est réglé sur Plaque à profil bas et que le couvercle est retiré et inséré dans le porte-couvercle. Placez la cartouche d’impression dans la bio-imprimante, en veillant à ce que le couvercle soit retiré et placé dans le support, puis lancez le tirage sur le logiciel en sélectionnant le bouton Imprimer la base inerte du logiciel de la bio-imprimante. Pendant que la base inerte s’imprime, récupérez les flacons de neurones glutamatergiques et d’astrocytes du stockage d’azote liquide, décongelez-les et remettez-les en suspension conformément aux instructions de la section 2. Une fois que les cellules sont décongelées et que 8 mL de milieu complet +DOX/ROCKi ont été ajoutés séparément à chaque type de cellule (conformément à la section 2), centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min à RT. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les deux types de cellules séparément dans 1 mL de milieu complet +DOX/ROCKi. Ajouter 20 μL de suspension cellulaire à 20 μL de bleu de trypan et mélanger avant de compter les cellules pour déterminer la concentration cellulaire viable par mL pour chaque type de cellule. Combinez un total de 3 millions de neurones glutamatergiques avec 1 million d’astrocytes dans un tube de 15 ml. Ajouter le média pour obtenir un volume total de 8 ml. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à RT. Aspirer autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et remettre la pastille cellulaire en suspension dans 200 μL de liquide activateur F299. Notez que le fluide activateur est visqueux ; pipeter de haut en bas pour remettre complètement le granulé en suspension. Les types de cellules sont délicats ; Minimisez le cisaillement et les bulles en utilisant une pointe de pipette à large alésage et la technique de pipetage inversé. Pipeter fermement de haut en bas pas plus de 3 fois pour éviter la perte de cellules. Une fois l’impression de l’étape de base inerte terminée, placez les couvercles sur la cartouche et la plaque de culture, retirez-les de la bio-imprimante et placez-les dans l’enceinte de sécurité biologique. Ajoutez les 200 μL de suspension cellulaire dans F299 au puits C3 de la cartouche d’impression, réinsérez la cartouche dans la bio-imprimante, retirez le couvercle et placez-la dans le support de couvercle. Ne réinsérez pas encore la plaque de culture. Lancez l’étape Modèles d’impression du tirage. Pendant que la bio-imprimante amorce les fluides, retirez la solution de laminine des puits de contrôle 2D de la plaque et remplacez-la par 150 μL de média complet +DOX/ROCKi dans chaque puits de contrôle 2D si vous utilisez une plaque à 96 puits et 50 μL de média complet +DOX/ROCKi si vous utilisez une plaque à 384 puits. Une fois que les liquides ont été apprêtés, insérez la plaque de ciblage de bio-impression dans la bio-imprimante, retirez le couvercle et placez-le dans le support de couvercle. Lancez le processus de ciblage de la bio-imprimante.Lorsque le logiciel de bio-impression vous y invite, retirez la plaque de ciblage de la bio-imprimante. Utilisez le guide pour sélectionner l’endroit où les gouttelettes peuvent être observées sur la plaque. Réinsérez la plaque de ciblage dans la bio-imprimante et répétez le processus d’impression et de sélection des gouttelettes. Lorsque vous y êtes invité, retirez à nouveau la plaque de ciblage, puis remplacez-la par la plaque de culture cellulaire (contenant le milieu dans les puits de contrôle 2D conformément à l’étape 1.3.25). Assurez-vous que le couvercle de la plaque de culture est retiré et placé dans le support. La bio-imprimante terminera l’impression du modèle. Une fois l’impression du modèle terminée, suivez les méthodes de culture cellulaire de la section 2 (étape 2.8) pour ajouter des milieux dans les puits. Commencez le processus de nettoyage de la bioimprimante et, une fois terminé, éliminez les cartouches et les liquides restants conformément aux protocoles de laboratoire. 2. Culture cellulaire Les modèles sont générés à l’aide d’un flacon de neurones glutamatergiques (>5 millions de cellules par flacon) et d’un flacon d’astrocytes (>1 million de cellules par flacon). Préchauffez le bain-marie à 37 °C. Transportez les deux flacons de cellules au laboratoire sur de la glace carbonique et immergés-les dans un bain-marie immédiatement après les avoir retirés de la glace sèche. Décongeler les deux flacons simultanément. Retirez les flacons du bain-marie lorsqu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace ; Cela prendra environ 3 minutes après l’immersion. Ne pas faire tourner ou mélanger les cellules dans le bain-marie. Vaporisez les flacons avec 70 % d’EtOH et transférez-les dans l’enceinte de sécurité biologique. Ajouter 500 μL de milieu complet +DOX/ROCKi goutte à goutte dans chaque flacon avant de transférer chaque suspension dans des tubes séparés de 15 mL. Remplissez le support dans chaque tube à 8 ml et procédez aux étapes de bio-impression conformément à l’étape 1.3. En suivant les modèles de bio-impression (étape 1.3), ajoutez immédiatement le milieu complet +DOX/ROCKi à tous les puits de coculture 3D et placez les modèles dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Si vous utilisez une plaque à 96 puits, ajoutez 150 μL de média par puits ; si vous utilisez une plaque à 384 puits, utilisez 50 μL de média par puits. Aucun changement de support n’est requis pendant les 48 premières heures de culture. Lors de l’exécution de changements de milieu sur des commandes et des modèles 2D, il faut veiller à ne pas induire de contraintes mécaniques, ce qui pourrait détacher les cultures 2D ou provoquer une déformation de l’hydrogel. Effectuez lentement l’aspiration et l’ajout du milieu à l’aide d’une micropipette pointant vers le bas du puits. Après 48 h, effectuer un changement de média de 90 % sur tous les puits et retirer ROCKi de la composition du média (voir l’étape 2.14). Après 96 h, effectuez un changement de média supplémentaire de 90 % sur tous les puits pour éliminer le DOX de la composition du milieu (voir l’étape 2.14). Après les deux changements de média à 90 % à 48 h et 96 h, effectuez 50 % de changement de média toutes les 48 h, où 50 % du média est aspiré et remplacé par un média complet neuf Composition des médias :Milieu complet : Milieu neurobasal avec 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoéthanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF. Milieu complet plus doxycycline (DOX) : Milieu neurobasal avec 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM de 2-mercaptoéthanol, 10 ng/mL de neurotrophine-3 (NT3), 5 ng/μL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et 1 μg/mL de doxycycline. Milieu complet et inhibiteur de DOX/ROCK (ROCKi) : Milieu neurobasal avec 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM de 2-mercaptoéthanol, 10 ng/mL de NT3, 5 ng/μL de BDNF, 1 μg/mL de doxycycline et 10 μM d’inhibiteur de ROCK. 3. Analyse de la croissance des naurites Placez les cellules dans un microscope à cellules vivantes pour l’imagerie en fond clair immédiatement après l’ajout du support après la bio-impression. Utilisez un logiciel de microscope pour programmer l’imagerie des cellules à un grossissement de 4x dans chaque puits, y compris les contrôles 2D, toutes les 12 h pendant au moins 7 jours. Effectuer des changements de milieu toutes les 48 h, comme indiqué dans la section 2, en replaçant les cellules dans le microscope après chaque changement de milieu. Après 7 jours de données, exportez les images du logiciel au format .jpg Importez toutes les images .jpg dans le logiciel ImageJ et convertissez les fichiers au format 8 bits. Chargez le plug-in NeuronJ et tracez la croissance des neurites dans les images, y compris les points de branchement, à l’aide de l’outil de traçage. Utilisez les données de traçage des neurites générées par NeuronJ pour tracer la croissance des neurites au fil du temps. 4. Analyse de la viabilité cellulaire À chaque période de 24 heures de la culture, colorez 3 puits ou plus pour l’analyse de la viabilité cellulaire à l’aide d’une trousse de viabilité vivante/morte. Répétez cette étape à des moments de 24 h ou 48 h pendant toute la durée de l’étude. Préparer les milieux réactifs vivants/morts en suspendant le réactif de cellules vivantes (1x Calcéine-AM) et le réactif de cellules mortes (1x homodimère d’éthidium-1) et 1x coloration nucléaire de cellules vivantes (Hoechst 33342) dans 10 mL de milieu sérique réduit sans rouge de phénol (Opti-MEM) 30 min avant l’imagerie. Laissez les milieux réactifs vivants/morts arriver à RT. Stockez les milieux réactifs vivants/morts à l’abri de la lumière directe en raison du blanchiment par fluorescence. Retirez le milieu de 3 puits contenant des modèles cellulaires/des contrôles 2D, en évitant soigneusement de perturber le gel. Lavez les modèles de cellules une fois avec du PBS stérile RT. Ajouter 100 μL de milieu réactif vivant/mort dans chaque puits pour une plaque de 96 puits ou 25 μL pour une plaque de 384 puits. Incuber les modèles pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2. Après incubation, les modèles sont prêts pour l’imagerie. Effectuez l’imagerie sur n’importe quel microscope standard avec des canaux d’excitation rouges (647 nm, cellules mortes), verts (488 nm, cellules vivantes) et bleus (405 nm, coloration nucléaire). Pour de meilleurs résultats dans les modèles 3D, modélisez les images à l’aide d’un microscope confocal à haut contenu et effectuez des images à l’aide d’une fonction Z-stack à un grossissement de 4x ou 10x.REMARQUE : Dans cette étude, les modèles cellulaires ont été imagés à l’aide de l’INCell Analyzer 6500HS (système d’imagerie à haut contenu), et l’analyse a été effectuée à l’aide de Signals Image Artist (plate-forme d’analyse d’images, voir étape 4.7). Une fois l’imagerie terminée, renvoyez les modèles cellulaires dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C et à 5 % de CO2. Cependant, omettre les modèles cellulaires utilisés pour l’analyse de la viabilité des études ultérieures en raison des milieux réactifs vivants/morts sur la viabilité à long terme. Analyse d’images sur la plateforme d’analyse d’imagesSélectionnez chaque plan de l’image Z-stack dans le logiciel. Combinez des images planes en tant qu’image de projection d’intensité maximale. Créez une nouvelle analyse en sélectionnant le modèle bio-imprimé comme région d’intérêt (ROI) en identifiant la fluorescence du canal de la cellule vivante à 488 nm (assurez-vous que toutes les cellules sont sélectionnées sous ROI). Dans la région d’intérêt, utilisez le logiciel d’imagerie pour identifier le nombre de cellules dans le ROI à travers le canal de coloration nucléaire (405 nm), le nombre de cellules vivantes dans le ROI à l’aide du canal à 488 nm et le nombre de cellules mortes dans le ROI à l’aide du canal à 647 nm. Exécutez l’analyse sur tous les puits de modèles de cellules vivantes/mortes traitées et exportez le tableau de données contenant la zone de retour sur investissement, le nombre total de cellules, le nombre de cellules vivantes et le nombre de cellules mortes. Calculez le nombre de cellules vivantes et mortes en pourcentage du nombre total de cellules par jour d’analyse. 5. Immunomarquage et analyse des populations cellulaires Avant la fixation, retirez le milieu des modèles de cellules et lavez les modèles une fois dans PBS. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % (v/v) dans du PBS à RT pendant 20 min.ATTENTION : Tous les travaux avec du paraformaldéhyde doivent être effectués conformément aux procédures de laboratoire. Aspirer la solution de paraformaldéhyde à 4 % (v/v) des modèles et laver les modèles quatre fois dans du PBS pour éliminer complètement le paraformaldéhyde. Perméabiliser les modèles cellulaires avec 0,2 % de triton-X pendant 30 min à RT et laver trois fois avec du PBS. Bloquer les modèles cellulaires en utilisant 10 % (v/v) de sérum d’ânesse normal (NDS) pendant 3 h à RT. Retirez la solution bloquante et ajoutez des anticorps primaires (dilués dans 1 % v/v NDS dans le PBS) aux modèles. Si vous effectuez une analyse du rapport de population cellulaire (voir l’étape 5.11), assurez-vous d’inclure des modèles cellulaires co-colorés pour la tubuline B-III (avec conjugaison AF647 rouge) et GFAP (avec conjugaison AF488 verte). Incuber les modèles avec des anticorps primaires pendant 24 h à 4 °C. Après l’incubation primaire, laver les modèles colorés avec des anticorps primaires conjugués trois fois dans du PBS et contre-colorer avec 20 μM Hoechst pendant 30 min. Image telle que détaillée à l’étape 5.10. Lavez les modèles colorés avec des anticorps primaires non conjugués trois fois dans du PBS et ajoutez des anticorps secondaires (dilués dans 1 % v/v NDS dans du PBS). Incuber pendant 24 h à 4 °C. Éliminez les anticorps secondaires en les lavant trois fois dans du PBS et contre-colorez les modèles avec 20 μM Hoechst pendant 30 minutes avant l’imagerie. Effectuez des examens d’imagerie sur des microscopes standard avec des canaux d’excitation rouges (647 nm) et verts (488 nm). Cependant, pour de meilleurs résultats dans les modèles 3D, modélisez l’image à l’aide d’un microscope confocal à haut contenu et effectuez une imagerie à l’aide d’une fonction Z-stack à un grossissement de 4x ou 10x. Analyse des ratios de population cellulaire sur la plateforme d’analyse d’imagesObtenir une analyse des populations cellulaires à l’aide de modèles co-colorés pour la GFAP (avec conjugaison AF488) et la tubuline B-III (avec conjugaison AF647). Sélectionnez chaque plan de l’image Z-stack dans le logiciel et combinez les images planes en tant qu’image de projection d’intensité maximale. Créez une nouvelle analyse en sélectionnant le modèle bio-imprimé comme ROI en identifiant la fluorescence du canal tubuline B-III à 647 nm (assurez-vous que toute la zone contenant des cellules est sélectionnée sous ROI). Dans le ROI, utilisez le logiciel pour identifier le nombre de cellules dans le canal de Hoechst (405 nm), le nombre d’astrocytes GFAP+ dans le ROI en utilisant le canal 488 nm et le nombre de cellules de tubuline B -III + dans le ROI en utilisant le canal 647 nm. Exécutez l’analyse sur tous les puits de modèles de cellules co-colorées et exportez le tableau de données contenant la zone de retour sur investissement, le nombre total de cellules, le nombre de cellules GFAP+ et le nombre de cellules de tubuline B-III+. Calculer le nombre de cellules de tubuline GFAP+ et Β-III en pourcentage du nombre total de cellules.

Representative Results

Analyse de la croissance des nauritesDans ce protocole, des neurones glutamatergiques et des astrocytes dérivés d’iPSC ont été bio-imprimés en coculture dans une matrice d’hydrogel à l’aide de la bio-imprimante 3D. Au cours des 7 premiers jours suivant l’impression, les cellules ont été imagées toutes les 12 heures à l’aide d’un microscope à cellules vivantes. Après la bio-impression, les cellules doivent avoir une morphologie arrondie et doivent être dispersées dans toute la matrice d’hydrogel, se transformant progressivement pour former des amas cellulaires plus petits avec peu de protubérances au cours des premiers jours de culture (voir la vidéo supplémentaire 1 pour une croissance cellulaire saine représentative). Au jour 4, les cellules saines migreront dans le gel pour former des amas plus grands, qui sont reliés par des excroissances de neurites. Au jour 7, il ne devrait presque plus y avoir de cellules, les faisceaux interconnectés de neurites et de projections astrocytaires devraient apparaître fortifiés, et de nombreuses excroissances de neurites plus petites peuvent être vues se former à partir des amas (Figure 2A). À l’aide d’une série d’images en fond clair de cellules vivantes prises au cours de la période de croissance de 7 jours, une analyse de la croissance des neurites a été effectuée comme détaillé dans la section 3. Cette analyse a démontré que la croissance des neurites augmente de façon quasi linéaire (valeur R2 = 0,84) entre 12 h et 156 h (Figure 2B). Au cours de cette période de croissance des neurites, les amas de corps cellulaires augmentent également en taille (voir la vidéo supplémentaire 1), ce qui indique la migration des cellules dans l’hydrogel. Viabilité cellulaire et ratio de populationDans ce protocole, une concentration de 20 millions de cellules/mL, comprenant 15 millions de neurones/mL et 5 millions d’astrocytes/mL, est utilisée pour la bio-impression des modèles cellulaires. À l’aide d’une coloration des cellules vivantes avec de la calcéine-AM (cellules vivantes), de l’homodimère d’éthidium-1 (cellules mortes) et d’une coloration nucléaire, le nombre de cellules survivantes sur une période de 7 jours peut être calculé conformément à la section 4 (Figure 3A). Les résultats de viabilité cellulaire pour les cultures représentatives sont présentés pour le jour 4, où 72 % ± 1 % (moyenne ± MEB) des cellules totales sont vivantes et présentent une coloration pour la calcéine-AM, tandis que 29 % ± 2 % (moyenne ± MEB) des cellules totales sont mortes et présentent une coloration à l’homodimère d’éthidium-1 (Figure 3B). Des images représentatives de la coloration cellulaire avec la calcéine-AM et l’homodimère-1 d’éthidium peuvent être vues dans la figure supplémentaire 1. Il convient de noter que les valeurs de survie cellulaire pour les cultures 3D ne peuvent pas être directement comparées aux cultures 2D, car les cellules mortes sont retenues dans l’hydrogel et ne seront pas éliminées pendant les processus d’alimentation cellulaire. À l’aide de la coloration immunofluorescente de la tubuline B-III et de la GFAP, comme décrit dans la section 5 et dans la figure 4, une analyse d’image peut être effectuée pour déterminer les rapports de population cellulaire entre les neurones et les astrocytes (Figure 3A). Sur le nombre total de cellules par modèle dans les cultures représentatives, les neurones positifs à la tubuline B III représentent 49 % ± 3 % (moyenne ± MEB), tandis que les astrocytes GFAP positifs représentent 30 % ± 4 % (moyenne ± MEB). Cela donne un rapport de 1 :1,5, astrocytes / neurones, respectivement. Il reste donc 21 % de cellules totales par modèle, qui ne se colorent pas pour l’un ou l’autre marqueur cellulaire. Comme l’analyse de la viabilité cellulaire a démontré qu’une valeur moyenne de 29 % des cellules n’est pas viable au jour 4, il est probable que ces cellules soient mortes dans l’hydrogel. Expression des marqueurs cellulairesLa morphologie des neurones et des astrocytes bio-imprimés a été évaluée par immunomarquage pour le marqueur de type de cellule neuronale (tubuline B-III) et le marqueur astrocytaire (GFAP). Dans les cultures représentatives présentées, l’immunomarquage est localisé à des types de cellules individuelles, montrant une morphologie cellulaire saine, les deux types de cellules présentant une excroissance de protubérances cellulaires (Figure 4A,B). Comme les structures de l’hydrogel et des cellules sont tridimensionnelles, chaque image ne représente qu’une seule tranche à travers la structure de la figure 4A,B. La figure 4C montre une pile d’images fusionnées dans l’hydrogel, montrant des vues de la localisation des cellules dans les plans X, Y et Z. La figure 4D montre l’immunomarquage de la tubuline β-III seulement ; mettant en évidence des excroissances de neurites plus fines provenant des amas de corps cellulaires. Pour approfondir l’examen du phénotype des neurones glutamatergiques, il est possible d’effectuer un immunomarquage du marqueur du récepteur ionique glutamatergique, GluR2. Dans la figure 4E, la zone 4E.1 (médaillon) a été mise en évidence pour montrer une coloration ponctuée à plus haute résolution le long des faisceaux de neurites. Cela confirme donc que les neurones de cette coculture ont un phénotype glutamatergique. Sur toutes les images d’immunomarquage, des structures non cellulaires colorées par immunofluorescence peuvent être observées autour des amas de cellules et des neurites. Il est probable que ces structures représentent des débris retenus dans l’hydrogel en combinaison avec des quantités mineures d’anticorps non spécifiques se liant à l’hydrogel. C’est ce que l’on peut attendre des cultures bio-imprimées, car dans les modèles d’échafaudage 3D, les cellules mortes et les débris ne sont pas éliminés lors de l’alimentation cellulaire. Une image d’immunomarquage témoin négative représentative est présentée à la figure supplémentaire 2 pour une démonstration de la liaison non spécifique des anticorps secondaires par l’hydrogel. Figure 2 : Les neurones glutamatergiques et les astrocytes ont été bio-imprimés dans la matrice d’hydrogel à l’aide de la bio-imprimante et ont été imagés toutes les 12 h à l’aide d’un microscope à fond clair. (A) Un exemple d’image en fond clair prise de cultures cellulaires pendant l’analyse. L’image représente le point temporel 156 h et la barre d’échelle représente 400 μm. (B) La longueur moyenne des excroissances de neurites (μm) des cultures mesurées à l’aide du package NeuronJ pour ImageJ. Chaque point de données correspond à n = 3 neurites, et les données sont affichées sous forme de moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Une concentration de 20 millions de cellules/mL de solution d’activateur a été utilisée pour la bio-impression des modèles cellulaires. (A) La viabilité cellulaire a été calculée à l’aide de colorants de cellules vivantes/mortes (Calcéine-AM et homodimère-1 d’éthidium, respectivement). Les valeurs montrent que 72 % ± 1 % (moyenne ± MEB, n = 3) du nombre total de cellules par puits sont vivantes et que 29 % ± 2 % (moyenne ± MEB, n = 3) des cellules sont mortes de la population cellulaire totale par puits au jour 4. Les valeurs indiquées représentent la moyenne ± MEB. (B) Le pourcentage de neurones et d’astrocytes par puits des populations cellulaires a été calculé par analyse d’images de la coloration illustrée à la figure 4. Les neurones représentent le pourcentage de cellules positives pour la tubuline β-III au jour 7 (49 % ± 3 %, moyenne ± MEB, n = 3), tandis que les astrocytes représentent le pourcentage de cellules positives pour la GFAP au jour 7 (30 % ± 4 %, moyenne ± MEB, n = 3). Les valeurs indiquées représentent la moyenne ± SEM. Toutes les analyses pour les calculs présentés à la figure 3 ont été effectuées sur un système d’imagerie confocale, et toutes les analyses ont été effectuées sur la plate-forme d’analyse d’images et le GraphPad Prism conformément aux méthodes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Expression de marqueurs de type de cellules neurales dans des cocultures bio-imprimées en 3D de neurones glutamatergiques et d’astrocytes au jour 7. (A,B) Marquage immunofluorescent du marqueur neuronal B-III tubuline et du marqueur astrocytaire GFAP, imagé sur une plate-forme de microscope inversé à un grossissement de 10x. Les barres d’échelle représentent 100 μm. (C) Marquage immunofluorescent du marqueur neuronal β-III tubuline et marqueur d’astrocyte GFAP co-coloré avec Hoechst, montré en vue plane XYZ, imagé sur un système d’imagerie confocale à un grossissement de 10x. Créé sur la plateforme d’analyse d’images. La barre d’échelle représente 100 μm. (D) Marquage immunofluorescent du marqueur neuronal β-III tubuline co-colorée avec Hoechst, imagée sur un système d’imagerie confocale à un grossissement de 20x. La barre d’échelle représente 100 μm. (E) Marquage immunofluorescent du marqueur glutamatergique GluR2 co-coloré avec Hoechst, imagé sur une plate-forme de microscope inversé à un grossissement de 10x. L’encadré 3E.1 montre les zones de coloration au GluR2 mises en évidence. La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Vidéo supplémentaire 1 : Les neurones glutamatergiques et les astrocytes ont été bio-imprimés dans la matrice d’hydrogel à l’aide de la bio-imprimante et ont été imagés toutes les 12 h à l’aide d’un microscope à fond clair. Vidéo d’images en fond clair prises de cultures cellulaires pendant l’analyse, les points temporels sont indiqués dans le coin inférieur droit et les barres d’échelle représentent 400 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 1 : Exemples d’images d’analyse de neurones et d’astrocytes bio-imprimés au jour 4. La coloration de calcéine-AM est représentée en vert (488 nm) et la coloration de l’homodimère d’éthidium est représentée en rouge (647 nm). L’image est affichée dans une vue plane XYZ, créée sur la plate-forme d’analyse d’image. La barre d’échelle représente 100 μm. (A) L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie confocale à grossissement 4x. (B) L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie confocale à un grossissement de 10x Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 2 : Exemple d’image témoin négative après coloration par immunofluorescence. Les anticorps primaires ont été omis, et les anticorps secondaires verts (488 nm) et rouges (647 nm) ont été utilisés conformément aux protocoles d’immunomarquage. L’image est affichée dans une vue plane XYZ, créée sur la plate-forme d’analyse d’image. La barre d’échelle représente 100 μm. L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie confocale à grossissement 10x. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le besoin de modèles précis du SNC n’a jamais été aussi élevé, et les limites des modèles de culture cellulaire traditionnels bidimensionnels (2D) ont conduit à une génération de modèles complexes du SNC au cours des dernières années¹⁹. Cependant, de nombreux modèles 3D complexes qui représentent les interactions entre les types de cellules neuronales et l’ECM ont des limites qui empêcheraient l’application de ces modèles dans les processus industriels 6,20,21. Dans ce protocole, nous développons un modèle de coculture 3D de neurones et d’astrocytes humains dérivés de CSPi, qui vise à résoudre certaines de ces limitations en utilisant la technologie de bio-impression 3D pour créer un échafaudage d’hydrogel bioactif dans des formats de 96 puits et 384 puits.

La méthodologie de développement de ces modèles a été simplifiée grâce au logiciel de conception de cartes de plaques, aux protocoles d’impression générés automatiquement et au processus d’impression guidé à partir de la bio-imprimante. Cependant, en raison de la nature sensible des types de cellules sensibles dérivées de CSPi utilisés dans ce protocole, il convient de prendre soin des étapes critiques suivantes de la décongélation et de la culture. Tout d’abord, l’inclusion de l’inhibiteur de ROCK (ROCKi) présente plusieurs avantages tout au long du processus de bio-impression et pendant la culture précoce. La décongélation cellulaire est un point critique dans lequel les neurones peuvent subir une réponse au stress, et des protocoles de décongélation inappropriés peuvent réduire les chances de survie²². Il est généralement recommandé de décongeler les cellules, d’ajouter des milieux et d’élever les cellules à la température de l’incubateur aussi efficacement que possible²³. Cependant, au cours du processus de bio-impression décrit dans ce protocole, il est nécessaire que les neurones et les astrocytes soient remis en suspension dans une solution d’activateur plutôt que dans un milieu, et les cellules ne seront pas élevées au-dessus de la température ambiante jusqu’à la fin du tirage (jusqu’à 30 minutes après la décongélation). Ainsi, l’ajout de ROCKi au milieu immédiatement après la décongélation et son inclusion au cours des deux étapes de centrifugation (étapes 2.1-2.7 et 1.3.15-1.3.20) est impératif pour inhiber les voies de stress cellulaire, ce qui se traduirait par des niveaux de viabilité plus faibles²⁴. De plus, il a été démontré que ROCKi favorise la croissance des neurites et améliore la maturation neuronale²⁵. Ainsi, la supplémentation en ROCKi est poursuivie pendant 48 h après la bio-impression. Cependant, il est impératif d’éliminer la supplémentation en ROCKi après 48 h pour assurer un lavage complet lors des changements de milieu ultérieurs avant que les cellules ne soient utilisées pour le dosage.

Une autre étape qui nécessite une attention critique est l’ajout de supports post-impression et les changements de supports (étapes 2.8-2.13). L’échafaudage en hydrogel bio-imprimé a une rigidité biomécanique équivalente de seulement 1,1 kPa, soit l’équivalent de la matière grise. Comme décrit à l’étape 2.10, il est essentiel de pipeter doucement sur le côté du puits pendant l’ajout et l’aspiration du milieu pour éviter toute perturbation. Ceci est particulièrement pertinent pour les plaques à 384 puits, où le niveau de gel occupe une proportion plus élevée du volume total du puits. Cette méthode doit également être utilisée dans les puits de contrôle 2D pour empêcher le soulèvement des bords des cellules et le cisaillement des excroissances de neurites. Les auteurs tiennent également à souligner l’importance de la technique stérile au sein de la bio-imprimante, qui doit être traitée avec la même prudence que celle d’une enceinte de sécurité biologique utilisée pour les cultures cellulaires dérivées de cellules iPS. Il s’agit notamment de filtrer stérilement l’EtOH et le dH2O à 70 % utilisés dans les procédures d’éclairage vert et d’impression, de maintenir les couvercles sur les cartouches et les plaques tout en déplaçant les mains à l’intérieur et à l’extérieur de la bio-imprimante, et de décontaminer les surfaces à l’intérieur de la bio-imprimante avec des lingettes à 70 % d’éthanol avant et après l’impression.

L’échafaudage en hydrogel bio-imprimé, formé à partir de solutions de bio-encre et d’activateur, sélectionné pour développer ce modèle est sélectionné parmi une gamme de bio-encres et de solutions d’activateurs développées par Inventia Life Science pour une utilisation dans la bio-imprimante RUSTRUM. La laminine et l’acide hyaluronique ont été identifiés comme des molécules pertinentes pour la maturation neuronale dérivée des CSPi en raison de leur rôle dans le guidage axonal, la formation des synapses et la formation du réseau périneuronal^26,27. De plus, une rigidité biomécanique de 1,1 kPa a été retenue, car il a été démontré que les hydrogels de plus faible densité permettent une meilleure croissance des neurites à partir des neurones¹². Si des modifications sont apportées au protocole en utilisant des neurones et des astrocytes qui ont été différenciés à l’interne ou auprès d’un autre fournisseur commercial, il serait recommandé de faire un test de sélection de matrice pour déterminer l’échafaudage d’hydrogel le plus favorable¹⁵. De plus, il peut également être nécessaire d’optimiser la densité cellulaire si des modifications sont apportées aux sources cellulaires afin d’assurer une viabilité optimale et d’éviter la surpopulation de l’hydrogel. Pour toutes les modifications et dépannages liés à la fonction de bio-imprimante, les auteurs recommandent de contacter les fabricants et de se référer aux protocoles des fabricants.

Le SNC contient un large éventail de sous-types neuronaux et de cellules gliales, qui existent tous dans différentes niches cérébrales et ont des rôles spécifiques contribuant à la fonction neuronale²⁸. Dans le cadre de ce large champ d’application, ce modèle ne représente que les deux types de cellules les plus abondants (astrocytes et neurones glutamatergiques excitateurs). Les types de cellules importants tels que la microglie, les oligodendrocytes et les cellules endothéliales formant la barrière hémato-encéphalique sont omis de ce système. L’inclusion de la microglie pourrait être pertinente pour mettre l’accent sur les interactions neuro-immunes, et les oligodendrocytes pourraient être intéressants dans les maladies qui affectent la myélinisation centrale. En plus de leur rôle dans la pathologie, des cellules telles que les cellules endothéliales formant la barrière hémato-encéphalique excrètent des enzymes métabolisant les médicaments, ce qui pourrait affecter l’utilisation de ce modèle pour les tests pharmacocinétiques²⁹. Une autre limite du modèle peut être le rapport entre les astrocytes et les neurones ; Le rapport entre les astrocytes et les neurones varie considérablement d’une région du cerveau à l’autre, avec des valeurs suggérées comprises entre 1 :1 et 1 :3^30,31. Ce modèle a un rapport approximatif de 1 :1,5 astrocytes par rapport aux neurones ; Ainsi, ce modèle pourrait ne pas être pertinent pour modéliser les zones du cerveau où les astrocytes sont plus abondants, comme dans les zones de la substance blanche³⁰.

D’autres protocoles de développement de modèles de coculture bio-imprimés en 3D ont été publiés ces dernières années. Une publication de Sullivan et al., 2021, a présenté un modèle neuronal bio-imprimé en 3D utilisant des cellules progénitrices neurales dérivées d’iPSC, qui démontre une viabilité post-impression élevée et une amélioration de la fonction neuronale par rapport aux cultures 2D³². Cependant, dans ce protocole, des cellules progénitrices neurales ont été utilisées comme source cellulaire et ont été maintenues en culture pendant 4 semaines. Dans ce protocole, des neurones glutamatergiques et des astrocytes dérivés d’iPSC disponibles dans le commerce ont été utilisés. Cela permet d’établir un réseau 3D de cellules co-cultivées en aussi peu que 7 jours ; Comme l’a démontré l’analyse de la croissance des neurites, la croissance des neurites commence dans les 24 heures et se poursuit de manière linéaire tout au long de la période de 156 heures pendant laquelle la croissance cellulaire a été surveillée. La mise en place rapide de ces réseaux peut être en partie attribuée à l’utilisation de neurones glutamatergiques qui utilisent l’expression génique optimisée de NGN2 inductible par la doxycycline, qui montre l’expression de marqueurs de sous-types neuronaux matures dans les 7 jours, même en culture 2D³³. Le raccourcissement de cette période de croissance à l’aide de cette technique est important pour la mise en œuvre de modèles au sein de l’industrie biopharmaceutique, car le développement de tests nécessite un délai d’exécution rapide et le développement de modèles cellulaires¹⁵.

En conclusion, ce modèle montre le potentiel d’un modèle 3D de neurones et d’astrocytes, qui est établi rapidement et facilement à des fins de criblage. Les applications futures de ce type de modèle pourraient être destinées aux efforts de découverte de médicaments dans différentes maladies du SNC, avec la possibilité de s’étendre à différentes maladies en utilisant des lignées iPSC de patients ou de maladies génétiquement modifiées. De plus, l’utilisation de neurones glutamatergiques dérivés de l’iPSC à expression de NGN2 inductibles par la doxycycline permet aux cellules d’atteindre leur maturité en moins de temps, ce qui peut être utilisé pour développer des modèles du cerveau vieillissant pour la recherche en neurodégénérescence. Ce système pourrait également être étendu par l’utilisation d’autres types de cellules en coculture, notamment la microglie et les oligodendrocytes.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Alex Volkerling, Martin Engel et Rachel Bleach pour leur aide dans l’élaboration du protocole et leurs commentaires sur le manuscrit.

Materials

2-mercaptoethanol	Thermofisher	31350010
384-well plate	PerkinElmer	6057300
96-well plate	PerkinElmer	6055300
Activator fluid F299	Inventia Life Science	N/A
Activator fluid F3	Inventia Life Science	N/A
B27 (50x) minus Vit A	Thermofisher	12587010
Bioink fluid F261	Inventia Life Science	N/A
Bioink fluid F32	Inventia Life Science	N/A
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D5207
GlutaMAX (100x)	Thermofisher	35050061
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647	Abcam	ab150115
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hoechst	Abcam	ab228551
Human BDNF Recombinant Protein	Thermofisher	PHC7074
Human NT3 Recombinant Protein	Thermofisher	PHC7036
iCell Astrocytes	Fujifilm CDI	1434
INCell Analyser 6500HS	Molecular Devices	N/A	high content imaging system
Incucyte S3	Sartorius	N/A
ioGlutamatergic Neurons (Large vial)	Bit.bio	e001
Laminin (1 mg/mL)	Sigma Aldrich	L2020
Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1)	Invitrogen	L3224
Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated	R&D systems	SC024
Neurobasal media	Thermofisher	21103049
Normal Donkey Serum	Abcam	ab7475
NucBlue Live (Hoechst 33342)	Thermofisher	R37605
Opti-MEM	Thermofisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
PEI 50% in H₂O	Sigma Aldrich	181978
Pierce Borate Buffer 20x	Thermofisher	28341
Prism	GraphPad		Data analysis software
Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2)	Abcam	ab206293
RASTRUM(TM) Bioprinter	Inventia Life Science	N/A	Bioprinter
RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges	Inventia Life Science	N/A	Bioprinter Cartridges
RASTRUM(TM) Targeting plate	Inventia Life Science	N/A	Targeting plate
Rho kinase (ROCK) inhibitor	Abcam	ab120129
Sheep anti-GFAP NL493 conjugated	R&D systems	SC024
Signals Image Artist	PerkinElmer	N/A	Image analysis platform
Triton X-100	Thermofisher	HFH10
Zeiss Axio Observer	Zeiss	N/A	Inverted microscope platform

Referências

Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study. Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).
Potkin, S. G., et al. The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research. npj Schizophrenia. 6, 1 (2020).
Zahra, W., et al., Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. Bioeconomy for Sustainable Development. , (2019).
Perucca, E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives. Acta Epileptologica. 3 (1), 22 (2021).
Nikolakopoulou, P., et al. Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system. Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).
Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. 3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).
Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges. Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).
Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).
Lam, D., et al. Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array. Scientific Reports. 9, 4159 (2019).
Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix. Cells. 11 (5), 760 (2022).
Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration. Cells. 8 (3), 242 (2019).
Ma, L., et al. 3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation. Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).
Liaw, C. -. Y., Ji, S., Guvendiren, M. Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models. Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165 (2018).
Ma, J., Huang, C. Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).
Belfiore, L., et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876 (2021).
Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow. SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).
Takamura, T., et al. Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).
Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. In vitro models of neurodegenerative diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328 (2020).
de Souza, N. Organoid variability examined. Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).
Hernández, D., et al. Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer’s disease. Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).
Li, R., et al. Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960 (2021).
Nishiyama, Y., et al. Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field. Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).
Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799 (2022).
Harbom, L. J., et al. The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons. Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).
Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin. Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).
Tarus, D., et al. Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).
Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).
Dauchy, S., et al. Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).
Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
Sullivan, M. A., et al. 3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function. bioRxiv. , (2022).
Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Whitehouse, C. A., He, Y., Brownlees, J., Corbett, N. Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications. J. Vis. Exp. (199), e65856, doi:10.3791/65856 (2023).