人 iPSC 衍生的神经元-星形胶质细胞共培养物的三维生物打印用于筛选应用

1. 3D模型的生物打印 生成板图和打印文件在模型生成之前，使用板图软件生成板图、协议和打印文件。打开孔板图软件，然后选择 “3D 培养细胞 ”选项。 从下拉菜单的可用选项中选择要生物打印的模型类型;该模型已在 成像模型 和 HTP 模型格式中进行了验证。为 96 孔板选择 成像模型 ，为 384 孔板选择 HTP 。 在“ 基 质选择”窗口中，选择含有层粘连蛋白-211 和透明质酸蛋白的水 凝胶 Px02.53，以及 IKVAV、RGD 和 YIGSR 肽。 在弹出窗口中，输入细胞类型为 谷氨酸能神经元和星形胶 质细胞，并将细胞密度输入为 2000 万个细胞/mL。 使用该软件通过突出显示屏幕上的孔来设计所需的孔图。在设计中至少包括 1 行 塑料上的 2D 控制 。 塑料孔的 2D 控制 由直接沉积到孔中的细胞组成，没有任何水凝胶支架;按照步骤 1.2 涂覆这些孔。 确保将窗口顶部列出的板模型更改为预期的板模型以供使用（请参阅 材料表）。 使用下载按钮下载板图的方案和打印文件，并将其保存到生物打印机链接的计算机中。 在塑料孔上涂覆 2D 控制打印前至少 24 小时，涂覆用于细胞粘附和生长的 2D 对照模型的孔。3D模型孔不需要任何预涂层。除非另有说明，否则所有过程均应在生物安全柜中进行。印版可以在印刷前 7 天进行涂布和制备。 用 47.5 mL 无菌 dH 2 O 稀释2.5mL 20x 硼酸盐储备溶液，制备 50 mL 1x 硼酸盐缓冲液。 将 100 μL 50% （w/v） 聚乙烯亚胺 （PEI） 加入 50 mL 1x 硼酸盐缓冲液中，以制备 0.1% （w/v） PEI 溶液，并通过 0.22 μm 过滤器进行无菌过滤器。 向每个 2D 对照孔中加入 0.1% （w/v） PEI 溶液，如步骤 1.1 中生成的板图所示。如果使用 96 孔板，则添加 100 μL/孔，如果使用 384 孔板，则添加 25 μL/孔。 在吸出0.1%（w / v）PEI溶液并用PBS冲洗孔5次之前，将板在37°C下孵育2小时。让孔在生物安全柜中完全干燥。 在 5 mL 神经基础培养基中稀释 100 μL 1 mg/mL 层粘连蛋白溶液。如果使用 96 孔板，则向每个 2D 对照孔中加入 100 μL，如果使用 384 孔板，则向每个 2D 对照孔中加入 25 μL。在37°C孵育4小时。 如果储存板，孵育后将层粘连蛋白溶液留在原位并储存在4°C。 使用前将板在37°C下预热1小时。 共培养模型的3D生物打印使用生物打印机时，请始终保持无菌技术，并在放入打印机之前用 70% EtOH 擦拭手套、墨盒和培养板。除非另有说明，否则请在生物安全柜中执行生物打印机以外的所有过程。 打开生物打印机的压缩机，并通过选择生物打印机软件上的初始化按钮来 初始化 打印机。打印机中的气流开始后，用 70% EtOH 擦拭器擦拭打印机内部的表面。 在打印当天，进行引导 式“开始日绿灯 ”流程，以确保打印运行的喷嘴状态正确（最小喷嘴状态 2A2B）。 从无菌包装中取出生物打印机墨盒，在隔室 A 中加入 20 mL 无菌 dH2O，并向隔室 B1-4 中加入 6 mL 无菌过滤的 70% EtOH。将墨盒插入生物打印机内的左侧墨盒支架中，然后将板盖放入专用的盖子支架中。 选择软件主屏幕上的 绿灯 按钮，并在软件上确认墨盒已在生物打印机内就位并且盖子已被取下。启动绿灯程序。 当软件提示时，确认左针或右针都看不到一致的滴水。随后，当软件提示时，确认 B7 和 B8 隔间中存在水。 在生物打印机完成自导绿灯步骤后，插入一个未包被的无菌 96 孔平底板（与用于生物打印共培养的包被板分开），并在软件提示时将该新板插入生物打印机的右侧板架部分。确保板架设置为 High Profile 板，并在开始下一步之前取下盖子并放入专用盖架中。 生物打印机将水滴沉积到96孔板的每个孔中。完成后，从生物打印机中放置板，并确认板的每个孔中都存在水滴。 处理用于绿灯的 96 孔板，并让生物打印机完成绿灯过程。完成后，软件将说明生物打印机的喷嘴状态，并确认生物打印机已准备好打印模型。将盖子放在打印墨盒上，然后将其取到生物安全柜中，以便进行后续步骤。 使用生物打印机软件，使用 Print Run 软件按钮将打印文件（在步骤1.1中生成）加载到软件中，然后打开打印方案pdf。 从-20°C检索生物墨水和活化剂液体，如打印方案pdf所示，并在室温（RT）下解冻40分钟。对于水凝胶基质 Px02.53，这将包括：1x 小瓶 F32、1x 小瓶 F3、1x 小瓶 F261、1x 小瓶 F299。不要在手或水浴中解冻生物墨水和活化剂液体。 将含有多西环素和 ROCK 抑制剂（完整培养基 + DOX/ROCKi）（参见步骤 2.2）的 50 mL 完全培养基置于室温中，同时将生物墨水和活化剂液解冻。 一旦生物墨水和活化剂解冻，按照生成的打印方案pdf的最后两页上的说明准备打印墨盒。绿灯打印机墨盒将重复用于模型打印阶段。确保隔室 A1 中有 40 mL 的 dH2O，隔室 B1 和 B2 中有 8 mL 的 70% EtOH。向 C1 中加入 1.2 mL 活化剂 F32，向 C2 中加入 1.2 mL F3，向 C4 中加入 200 μL F261。 从培养箱中取出PEI和层压涂层板，并将其放入打印机内右侧板架隔间中。此时不要从孔中取出层粘连蛋白培养基溶液。确保板架隔间设置为 低调 Profile 板，并且盖子已取下并放入盖板架中。 将打印墨盒放入生物打印机中，确保盖子取下并放入支架中，然后通过选择生物打印机软件上的 “打印惰性底座 ”按钮在软件上开始打印运行。 在惰性基座打印时，按照第 2 节中的说明从液氮储存中取出谷氨酸能神经元和星形胶质细胞的小瓶，解冻并重悬。 一旦细胞解冻，并将 8 mL 完全培养基 + DOX/ROCKi 分别添加到每种细胞类型中（如第 2 节），在室温下以 300 x g 离心细胞 5 分钟。 吸出上清液，并将两种细胞类型分别重悬于1 mL完全培养基+DOX / ROCKi中。 将 20 μL 细胞悬液加入 20 μL 台盼蓝中，并在计数细胞之前混合，以确定每种细胞类型每 mL 的活细胞浓度。 将总共 300 万个谷氨酸能神经元与 100 万个星形胶质细胞结合在一个 15 mL 的试管中。添加培养基，总体积为 8 mL。 在室温下以300× g 离心细胞5分钟。 在不干扰细胞沉淀的情况下吸出尽可能多的上清液，并将细胞沉淀重悬于200μL活化液F299中。 请注意，活化剂液是粘稠的;上下移液以完全重悬沉淀。细胞类型很脆弱;通过使用宽口径移液器吸头和反向移液技术，最大限度地减少剪切和气泡。用力上下移液不超过 3 次，以防止细胞丢失。 惰性基础载物台完成打印后，将盖子放在墨盒和培养板上，从生物打印机中取出并放入生物安全柜中。 将 F299 中的 200 μL 细胞悬浮液加入打印墨盒的孔 C3 中，将墨盒重新插入生物打印机，取下盖子，然后将其放入盖架中。不要重新插入培养板。 启动打印运行的 “打印模型 ”阶段。当生物打印机启动流体时，从板的 2D 对照孔中取出层粘连蛋白培养基溶液，如果使用 96 孔板，则在每个 2D 对照孔中用 150 μL 完全培养基 +DOX/ROCKi 替换，如果使用 384 孔板，则用 50 μL 完全培养基 +DOX/ROCKi 替换。 液体灌注后，将生物打印靶向板插入生物打印机，取下盖子，然后将其放入盖架中。 开始生物打印机靶向过程。当生物打印软件提示时，从生物打印机上取下靶向板。 使用指南选择可以在板上观察到液滴的位置。将靶向板重新插入生物打印机中，并重复液滴打印和选择过程。 出现提示时，再次取下靶向板，然后用细胞培养板（根据步骤1.3.25在2D对照孔中含有培养基）替换。确保培养板盖已关闭并放入支架中。生物打印机将完成模型打印。 模型打印完成后，按照第 2 节（步骤 2.8）中的细胞培养方法将培养基添加到孔中。 开始生物打印机清洁过程，完成后，根据实验室方案处理墨盒和剩余液体。 2. 细胞培养 使用 1x 小瓶谷氨酸能神经元（每瓶 >500 万个细胞）和 1x 小瓶星形胶质细胞（每小瓶 >100 万个细胞）生成模型。 将水浴预热至37°C。 将两瓶细胞在干冰上运送到实验室，并在从干冰中取出后立即浸入水浴中。同时解冻两个小瓶。 当只剩下小冰晶时，从水浴中取出小瓶;浸泡后大约需要 3 分钟。不要在水浴中旋转或混合细胞。 用 70% EtOH 喷洒小瓶并将它们转移到生物安全柜中。 将 500 μL 完全培养基 +DOX/ROCKi 滴加到每个小瓶中，然后将每个悬浮液转移到单独的 15 mL 管中。 将每个试管中的培养基加满至 8 mL，并按照步骤 1.3 进行生物打印步骤。 按照生物打印模型（步骤1.3），立即将完整的培养基+ DOX / ROCKi添加到所有3D共培养孔中，并将模型置于37 °C和5%CO2的培养箱中。如果使用 96 孔板，则每孔加入 150 μL 培养基;如果使用 384 孔板，则每孔使用 50 μL 培养基。 培养的前 48 小时不需要更换培养基。 在对 2D 对照和模型进行培养基更换时，应注意防止引起机械应力，这可能会使 2D 培养物分离或导致水凝胶变形。使用指向孔侧的微量移液管缓慢进行培养基抽吸和添加。 48小时后，对所有孔进行90%的培养基更换，并从培养基组合物中除去ROCKi（参见步骤2.14）。 96小时后，在所有孔上再进行90%的培养基更换，以从培养基组合物中去除DOX（参见步骤2.14）。 在 48 小时和 96 小时两次 90% 介质更换后，每 48 小时进行一次 50% 的介质更换，其中 50% 的介质被吸出并更换为新鲜的完整介质 媒体组成：完整培养基：含有 1x GlutaMAX、1x B27、12.5 nM 2-巯基乙醇、10 ng/mL NT3、5 ng/μL BDNF 的 Neurobasal 培养基。 完整培养基加多西环素 （DOX）：含有 1x GlutaMAX、1x B27、12.5 nM 2-巯基乙醇、10 ng/mL 神经营养因子-3 （NT3）、5 ng/μL 脑源性神经营养因子 （BDNF） 和 1 μg/mL 多西环素的神经基础培养基。 完整培养基加 DOX/ROCK 抑制剂 （ROCKi）：含有 1x GlutaMAX、1x B27、12.5 nM 2-巯基乙醇、10 ng/mL NT3、5 ng/μL BDNF、1 μg/mL 多西环素和 10 μM ROCK 抑制剂的神经基础培养基。 3. 神经突生长分析 在生物打印后立即将细胞置于活细胞显微镜中进行明场成像。 使用显微镜软件安排每 12 小时在每个孔中以 4 倍放大倍率成像的细胞，包括 2D 对照，至少持续 7 天。 如第2节所述，每48小时更换一次培养基，每次更换培养基后将细胞放回显微镜中。 数据 7 天后，以.jpg格式从软件中导出图像 将所有.jpg图像导入 ImageJ 软件并将文件转换为 8 位格式。加载 NeuronJ 插件并使用跟踪工具跟踪图像（包括分支点）中的神经突生长。 使用从 NeuronJ 生成的神经突追踪数据绘制神经突随时间推移的生长情况。 4. 细胞活力分析 在培养的每个 24 小时时间点，使用活/死活力试剂盒对 3 个或更多孔进行染色以进行细胞活力分析。在研究期间在24小时或48小时时间点重复此步骤。 通过在成像前 30 分钟将活细胞试剂 （1x 钙黄绿素-AM） 和死细胞试剂 （1x 乙锭同型二聚体-1） 和 1x 活细胞核染色剂 （Hoechst 33342） 悬浮在 10 mL 不含酚红的还原血清培养基 （Opti-MEM） 中来制备活/死试剂培养基。让活/死试剂培养基进入室温。 由于荧光漂白，将活/死试剂培养基储存在避光直射的地方。 从含有细胞模型/2D 对照的 3 个孔中取出培养基，小心防止凝胶干扰。用RT无菌PBS洗涤细胞模型一次。对于96孔板，向每个孔中加入100 μL活/死试剂培养基，对于384孔板，向每个孔中加入25 μL。 将模型在37°C和5%CO 2下孵育30分钟。 孵育后，模型即可进行成像。在任何具有红色（647 nm，死细胞）、绿色（488 nm，活细胞）和蓝色（405 nm，核染色）激发通道的标准显微镜上进行成像。为了在3D模型中获得最佳效果，请使用高内涵共聚焦显微镜对模型进行成像，并使用Z-stack功能以4倍或10倍放大倍率进行成像。注：在本研究中，使用 INCell Analyzer 6500HS（高内涵成像系统）对细胞模型进行成像，并使用 Signals Image Artist（图像分析平台，参见步骤 4.7）进行分析。 成像完成后，将细胞模型返回到37°C和5%CO 2的细胞培养箱中。 然而，由于活/死试剂培养基对长期活力的影响，因此在进一步研究中省略了用于活力分析的细胞模型。 在图像分析平台上分析图像在软件中选择 Z-stack 映像的每个平面。将平面图像合并为最大强度投影图像。 通过识别 488 nm 处活细胞通道的荧光，选择生物打印模型作为感兴趣区域 （ROI） 来创建新的分析（确保在 ROI 下选择所有细胞）。 在感兴趣的区域内，使用成像软件通过核染色通道 （405 nm） 识别 ROI 中的细胞数量，使用 488 nm 通道识别 ROI 中的活细胞数量，以及使用 647 nm 通道识别 ROI 中的死细胞数量。 对所有活/死处理的细胞模型孔运行分析，并导出包含 ROI 面积、总细胞数、活细胞数和死细胞数的数据表。 计算活细胞和死细胞的数量占每个分析日细胞总数的百分比。 5. 免疫染色和细胞群分析 固定前，从细胞模型中取出培养基，并在PBS中洗涤模型一次。 在室温下用4%（v / v）多聚甲醛在PBS中固定细胞20分钟。注意：所有使用多聚甲醛的工作都必须按照实验室程序进行。 从模型中吸出4%（v / v）多聚甲醛溶液，并在PBS中洗涤模型四次，以完全去除多聚甲醛。 在室温下用0.2%triton-X透化细胞模型30分钟，并用PBS洗涤3次。 在室温下使用10%（v / v）正常驴血清（NDS）封闭细胞模型3小时。 取出封闭溶液，并向模型中加入一抗（在PBS中以1%v / v NDS稀释）。如果进行细胞群比分析（参见步骤5.11），请确保包括对Β-III微管蛋白（具有红色AF647偶联物）和GFAP（具有绿色AF488偶联物）进行共染色的细胞模型。将模型与一抗在4°C下孵育24小时。 初次孵育后，在PBS中洗涤用偶联的一抗染色的模型3次，并用20μMHoechst复染30分钟。如步骤 5.10 中详述的图像。 在PBS中洗涤用非偶联一抗染色的模型三次，并加入二抗（在PBS中用1%v / v NDS稀释）。在4°C孵育24小时。 通过在PBS中洗涤三次除去二抗，并在成像前用20μM Hoechst对模型进行复染30分钟。 在具有红色 （647 nm） 和绿色 （488 nm） 激发通道的标准显微镜上进行成像。然而，为了在3D模型中获得最佳效果，请使用高内涵共聚焦显微镜对模型进行成像，并使用Z-stack功能以4倍或10倍放大倍率进行成像。 在图像分析平台上分析细胞群比率使用GFAP（AF488偶联）和Β-III微管蛋白（AF647偶联）共染色的模型对细胞群进行分析。 在软件中选择Z-stack图像的每个平面，并将平面图像组合为最大强度投影图像。 通过识别 647 nm 处 Β-III 微管蛋白通道的荧光，选择生物打印模型作为 ROI（确保在 ROI 下选择所有含有细胞的区域），从而创建新的分析。 在 ROI 中，使用软件识别 Hoechst 通道 （405 nm） 中的细胞数量、使用 488 nm 通道的 ROI 中 GFAP+ 星形胶质细胞的数量，以及使用 647 nm 通道识别 ROI 中 Β-III 微管蛋白+ 细胞的数量。 在所有共染色的细胞模型孔上运行分析，并导出包含 ROI 面积、总细胞数、GFAP+ 细胞数和 Β-III 微管蛋白+ 细胞数的数据表。 计算GFAP +和Β-III微管蛋白+细胞的数量占总细胞数的百分比。