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Imunologia e Infecção

Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus zur schnellen Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und neutralisierenden Antikörpern

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65793
, ,
1Center for Infectious Disease Research, School of Systems Biology,George Mason University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung eines neuartigen hybriden Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2) als Plattform für die schnelle Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten und ihrer Empfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern.

Abstract

Die Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) hat die Notwendigkeit von Schnelltests zur genauen Messung der Infektiosität neu auftretender SARS-CoV-2-Varianten und der Wirksamkeit von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern gegen Virusvarianten deutlich gemacht. Diese Assays sind für die Pandemieüberwachung und die Validierung von Impfstoffen und variantenspezifischen Auffrischungsimpfungen unerlässlich. Dieses Manuskript demonstriert die Anwendung eines neuartigen hybriden Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2) zur schnellen Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten und impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern gegen Virusvarianten. Ha-CoV-2 ist ein SARS-CoV-2-Virus-ähnliches Partikel, das aus viralen Strukturproteinen (S, M, N und E) und einem schnell exprimierenden RNA-Genom besteht, das von einem Alphavirus, dem Semliki-Waldvirus (SFV), abgeleitet ist. Ha-CoV-2 enthält auch sowohl grün fluoreszierendes Protein (GFP) als auch Luciferase-Reportergene, die eine schnelle Quantifizierung der viralen Infektiosität ermöglichen. So wird beispielsweise die Infektiosität der Varianten SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) quantifiziert und ihre Empfindlichkeit gegenüber einem neutralisierenden Antikörper (27VB) gemessen. Diese Beispiele zeigen das große Potenzial von Ha-CoV-2 als robuste Plattform für die schnelle Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und deren Anfälligkeit für neutralisierende Antikörper.

Introduction

Im Mai 2023 gab es nun mehr als 766 Millionen COVID-19-Fälle1. Trotz weltweiter Impfkampagnen zirkuliert SARS-CoV-2 kontinuierlich und infiziert Menschen, was vor allem auf das Auftreten neuer Varianten wie Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) zurückzuführen ist, die neue Infektionswellen auslösen 2,3,4. Da sich SARS-CoV-2 ständig weiterentwickelt, ist es wichtig, schnelle Assays zu entwickeln, die die Infektiosität neu auftretender Varianten und die Wirksamkeit von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern gegen diese Varianten genau messen können. Diese Assays sind für die Pandemieüberwachung und für die Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen und ihren variantenspezifischen Auffrischungsimpfungen unerlässlich.

Aufgrund der hochansteckenden Natur von SARS-CoV-2 verlangt das Center for Disease Control and Prevention (CDC), dass die Untersuchung von SARS-CoV-2 und seinen Varianten in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe (BSL) 3 durchgeführt wird 5,6. Diese BSL-3-Anforderung schränkt die Verwendung lebender Viren zur Quantifizierung der Infektiosität von Virusvarianten und ihrer neutralisierenden Antikörper in gemeinsamen Forschungs- und klinischen Labors ein. Darüber hinaus sind herkömmliche SARS-CoV-2-Neutralisationsassays, wie z. B. die auf Plaques oder zytopathischer Wirkung basierenden Assays mit replikationskompetenten Lebendviren, zeitaufwändig und erfordern lange Inkubationszeiten7. Mehrere Spike-Protein-pseudotypisierte SARS-CoV-2-Pseudoviren wurden entwickelt, um die Wirksamkeit neutralisierender Antikörperzu quantifizieren 8,9,10,11,12. Bei SARS-CoV-2 ist das S-Protein das Hauptprotein, das den Viruseintritt vermittelt13 und das Hauptantigen, das in SARS-CoV-2-Impfstoffenverwendet wird 9,10,14,15,16. Die S-Protein-pseudotypisierten Virionen, wie die des vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G) oder des Lentivirus, wurden zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper verwendet 17,18,19. Dennoch benötigt das Lentivirus-basierte Pseudovirus normalerweise 2 bis 3 Tage der Infektion, um Reportersignale zu quantifizieren. VSV-basierte Pseudovirussysteme enthalten häufig VSV-Restviren, die zu hohen Raten falsch-positiver Ergebnisse führen können und typischerweise 24 Stunden Infektion erfordern20.

Ein neuartiges SARS-CoV-2-Pseudovirussystem, das hybride Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2), wurde kürzlich von Hetrick et al.12 entwickelt. Ha-CoV-2 bietet ein neues Werkzeug zur schnellen Quantifizierung der Virusinfektiösität und der Virusempfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern in gängigen BSL-2-Labors. Strukturell ähnelt Ha-CoV-2 dem SARS-CoV-2-Virionpartikel, das aus SARS-CoV-2-Strukturproteinen besteht, einschließlich des S-Proteins (S), der Membran (M), des Nukleokapsids (N) und der Hülle (E), und es gibt kein Strukturprotein von anderen Viren. Darüber hinaus enthält das Ha-CoV-2-Partikel ein schnell exprimierendes RNA-Genom aus einem Alphavirus für eine schnelle Reporterexpression in Zellen. Es wurde gezeigt, dass Ha-CoV-2 die neutralisierende Aktivität von Antikörpern in den Seren von geimpften und genesenen Personen schnell misst12. Wie Hetrick et al. zeigten, exprimierte Ha-CoV-2 im Vergleich zu einem Lentivirus-basierten SARS-CoV-2-Pseudovirus in einem Zeitverlaufsassay den Luc-Reporter bereits 2-4 h nach der Infektion, während das Lentivirus-Pseudovirus Luc nach 24 hexprimierte. Darüber hinaus wird die potenzielle Anwendung von Ha-CoV-2-Varianten zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper durch die Verwendung eines monoklonalen neutralisierenden Standardantikörpers, 27BV, weiter demonstriert (siehe ergänzende Abbildung 1)12. In dieser Arbeit wird die Verwendung der Ha-CoV-2-Plattform zur schnellen Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten am Beispiel der Varianten Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) beschrieben. Darüber hinaus wird die potenzielle Anwendung von Ha-CoV-2-Varianten zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper durch die Verwendung eines monoklonalen neutralisierenden Standardantikörpers, 27BV12, weiter demonstriert.

Protocol

1. Virus- und Viruspartikel-Assemblierung Vektoren: Kaufen Sie Expressionsvektoren für SARS-CoV-2 M, E oder N sowie SARS-CoV-2 S (Wildtyp, Wt), Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) kommerziell.HINWEIS: Proteinsequenzen der Expressionsvektoren sind in der Zusatzdatei 1 enthalten. Den Anbieter dieser Expressionsvektoren finden Sie auch unter der Materialtabelle. Zellen und Zellkultur: Halten Sie HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin.HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten müssen in einer Biosicherheitswerkbank mit laminarem Luftstrom durchgeführt werden. Die Transfektion von Polyethylenimin (PEI) erfordert typischerweise eine Inkubationszeit von 5-6 Stunden. Die Startzeiten müssen im Vorfeld genau abgewogen werden. Virusassemblierung und PEI-basierte Kotransfektion: Assemblierung von Ha-CoV-2-Partikeln durch Kotransfektion HEK293T Zellen. Keimzellen in einer 10 cm Zellkultur-Petrischale (4-5 x 106 Zellen pro Schale) in 10 ml vollständigem DMEM-Medium am Tag vor der Kotransfektion. Für diese Studie werden drei Petrischalen verwendet, um Zellen für den Zusammenbau von Ha-CoV-2-Wildtyp, Delta bzw. Omicron zu säen. Petrischalen über Nacht in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie das Geschirr am nächsten Morgen, um sicherzustellen, dass die Zellen zu 80 % zusammenfließen. Entfernen Sie das gesamte Medium und ersetzen Sie es durch 9 ml DMEM-serumfreies Medium. Bereiten Sie für jedes Gericht eine Cotransfektionsmischung mit jeweils 2,5 μg der SARS-CoV-2-Strukturproteinexpressionsvektoren (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-Genom) und 2,5 μg des S-Proteinexpressionsvektors, entweder der Delta- oder der Omicron S-Variante, und 45 μl PEI-basiertem Transfektionsreagenz zu. Lassen Sie die Cotransfektionsmischung durch 13 min Inkubation komplexe bilden (nicht länger als 30 min inkubieren). Nach der Inkubation die Cotransfektionsmischung langsam und tropfenweise in jede Petrischale geben. Stellen Sie das Geschirr für 6 h bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator. Entfernen Sie nach 6 h serumfreies DMEM und ersetzen Sie es durch vollständiges DMEM-Medium. Ernte des Virus 48-60 Stunden nach der Kotransfektion. Virusernte und -lagerung: Ernte der Partikel 48 Stunden nach der Kotransfektion. Trennen Sie die Zellen durch wiederholtes Pipettieren über die Oberfläche der Monoschicht und sammeln Sie Zellen aus jeder Schale, geben Sie sie in 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 x g . Der Überstand wird aufgefangen und durch einen 0,22-μM-Filter geleitet. Lagern Sie das Ha-CoV-2-Pseudovirus bei -80 °C. 2. Viraler Infektiositätstest Zellen und Zellkultur: Halten Sie HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin. Aussaat HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen: Am Tag vor dem viralen Infektiositätstest HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in einer 96-Well-Platte in 50 μl vollständigem DMEM-Medium säen. Für jede 96-Well-Platte werden 2,5 x 104 Zellen in jede Vertiefung gesät, und für eine Platte werden insgesamt 2,5 x 106 Zellen benötigt. Stellen Sie die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator. Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Verwenden Sie Ha-CoV-2-Variantenpartikel, um HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen zu infizieren. Entfernen Sie am Morgen der Infektion 50 μl DMEM aus der vorgesäten 96-Well-Platte. Ersetzen Sie das Medium durch 50 μl Ha-CoV-2 Wildtyp, Delta oder Omikron für 18 Stunden bei 37 °C.HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, bis die Infektion 18 Stunden Inkubationszeit erreicht hat und die Platte bereit ist, mit dem Luciferase-Assay analysiert zu werden. Der Erfolg der Infektion wird durch den Luziferase-Assay bestimmt, der aus dem in den infizierten Zellen exprimierten Luciferase-Reportergen resultiert, daher ist die Infektion der Ha-CoV-2-Variante umso erfolgreicher, je mehr Signal erzeugt wird. Luciferase-Assay: Nach 18 Stunden Inkubation 7,5 μl Zelllysepuffer direkt in jede Vertiefung geben und 2 Minuten lang durch orbitales Schütteln mischen. Zellen in Lysepuffer für mindestens 5 min bei Raumtemperatur lysieren. Bereiten Sie die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung vor, indem Sie die D-Luciferin-Lösung mit der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung im Verhältnis 1:50 mischen. Kombinieren Sie für eine ganze 96-Well-Platte 3 ml der Luciferase-Substratlösung mit 60 μl der D-Luciferin-Lösung mit 2940 μl der Firefly-Luciferase-Pufferlösung. Geben Sie 25 μl der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den Zelllysaten und mischen Sie die Platte durch Orbitalschütteln für 1 Minute. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader. 3. RNA-Extraktion von Ha-CoV-2 und quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (RT-qPCR) Extraktion viraler RNA: Extrahieren Sie die virale RNA aus Ha-CoV-2-Wildtyp- und Ha-CoV-2-Delta- und Omicron-Variantenpartikeln mit einem kommerziellen viralen RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lagern Sie die extrahierte virale RNA bei -80 °C oder verwenden Sie sie sofort für die RT-qPCR. RT-qPCR: Führen Sie die RT-qPCR an viraler RNA mit einem einstufigen Mastermix durch. Führen Sie die Reaktion in einem handelsüblichen PCR-Gerät durch. Bitte beachten Sie, dass das Ziel der Amplifikation die genomische RNA von Ha-CoV-2 ist. Verwenden Sie Ha-CoV-2-Vektor-DNA als Standard für die Erstellung einer Standardkurve und die Berechnung der RNA-Kopienzahl jeder Variante. 4. Neutralisierender Antikörper-Assay Aussaat HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen: Am Tag vor dem Assay HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in einer 96-Well-Platte in 50 μl vollständigem DMEM-Medium säen. HEK293T (ACE2/TMPRSS2)-Zellen werden kommerziell gekauft. Zum Zählen der Zellen werden 20 μl-Zellen aus einem T75-Kolben mit HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen entnommen und mit 20 μl Trypanblaulösung gemischt. Geben Sie 20 μl dieser Mischung in die Zellzählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen pro ml. Um eine 96-Well-Platte für die Infektion zu säen, verwenden Sie 2,5 x 104 Zellen pro Well, und insgesamt werden 2,5 x 106 Zellen benötigt. Die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator stellen. Neutralisierender Antikörper-Assay: Bereiten Sie in einer sterilen 96-Well-Platte aus Polypropylen die standardmäßige Mischung aus neutralisierendem 27BV-Antikörper und Ha-CoV-2 vor. Geben Sie 8 μl 27BV (45 mg/ml) in die Platte und führen Sie serielle Verdünnungen des Antikörpers mit 6 μl serumfreiem DMEM durch.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Pipettenspitzen zwischen den Well-Transfers auszutauschen und sicherzustellen, dass der Antikörper und das serumfreie Medium gründlich gemischt sind, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Dem seriell verdünnten Antikörper werden 54 μl Ha-CoV-2-Partikel zugesetzt und das Virus und der Antikörper vermischt. Ha-CoV-2-Partikel mit seriell verdünntem 27BV 1 h bei 37 °C bei 5 % CO2 vorinkubieren. Nach der 1-stündigen Inkubation werden 50 μl des Antikörper-Ha-CoV-2-Gemisches auf die 96-Well-Platte mit den am Vortag ausgesäten HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen (2,5 x 104 Zellen pro Well) gegeben. Lassen Sie für Kontrollen mindestens drei Vertiefungen, die nur die HEK293T (ACE2/TMPRSS2)-Zellen enthalten. Geben Sie 50 μl vollständiges Medium in diese Vertiefungen, die als nicht infizierte Vertiefungen für das Hintergrundsignal der Luciferase-Assay-Messwerte dienen.HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, bis die Infektion 18 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C erreicht hat und die Platte dann für die Analyse mittels Luciferase-Assay bereit ist. Luciferase-Assay: Nach 18 Stunden Inkubation 7,5 μl Lysepuffer direkt in jede Vertiefung geben und 2 Minuten lang durch orbitales Schütteln mischen. Zellen in Lysepuffer für mindestens 5 min bei Raumtemperatur lysieren. Bereiten Sie die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung vor, indem Sie die D-Luciferin-Lösung mit der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung im Verhältnis 1:50 mischen. Kombinieren Sie für eine ganze 96-Well-Platte 3 ml der Luciferase-Substratlösung mit 60 μl der D-Luciferin-Lösung mit 2940 μl der Glühwürmchen-Luciferase-Pufferlösung. Geben Sie 25 μl der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den Zelllysaten und mischen Sie die Platte durch Orbitalschütteln für 1 Minute. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader. 5. Quantifizierung und statistische Analyse Datenerhebung: Führen Sie Infektions- und Luciferase-Assays in dreifacher Ausführung durch, wie angegeben (Abbildung 1). Quantifizieren Sie die Luciferase-Expression mit Luciferase-Assay-Messwerten. Der Mittelwert ist der Durchschnittswert der drei Luciferase-Assay-Messwerte. Hintergrundsignalwerte aus nicht infizierten Vertiefungen werden von diesem Mittelwert abgezogen. Die Standardabweichung (SD) wird aus dem Durchschnittswert der Luciferase-Assay-Messwerte bestimmt. Datenanalyse: Zeichnen Sie die Antikörperneutralisationsaktivität auf und berechnen Sie die ID50-Werte (50% Hemmdosis) mit kommerzieller Grafiksoftware. DerID-50-Wert ist definiert als die Antikörper-inhibitorischen Verdünnungen, bei denen eine 50%ige Verringerung der Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen (basierend auf Luciferase-Assay-Messwerten) erreicht wird.

Representative Results

Ha-CoV-2-Partikel wurden mit fünf verschiedenen DNA-Vektoren zusammengesetzt, die das Ha-CoV-2-RNA-Genom und die Strukturproteine (M, N, E und S) von SARS-CoV-2 in HEK293T Zellen exprimieren. Der S-Protein-Vektor variiert je nach S-Variante. Das S-Protein aus dem ursprünglichen Ha-CoV-2-Wuhan-Stamm (Wildtyp, Wt) wurde als Positivkontrolle verwendet und zusammen mit dem S-Protein aus jeder der beiden anderen Varianten zusammengesetzt: Delta (B.1.617.2) oder Omikron (B.1.1.529). In allen Varianten wurden die gleichen M, N, E verwendet. Ha-CoV-2(Wt)- und Variantenpartikel wurden 48 Stunden nach der Kotransfektion gesammelt und dann zur Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen verwendet. Die Infektiosität wurde durch die Expression von Luciferase 18 h nach der Infektion gemessen. In diesem System spiegeln höhere Expressionsniveaus des Luciferase-Signals eine höhere Infektion der Zellen mit Ha-CoV-2 wider. Das Luciferase-Signal wurde mit genomischen RNA-Kopien durch RT-qPCR für jede Variante normalisiert. Wie in Abbildung 1 gezeigt, erzeugte die Ha-CoV-2-Omikron-Variante ein 4- bis 10-fach höheres Signal als die ursprüngliche Ha-CoV-2(Wt), was auf eine höhere Infektiosität hindeutet. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit von 27BV zur Neutralisierung von HaCoV-2(Wt), Delta- und Omicron-Varianten quantifiziert. 27BV ist ein monoklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen die RBD-Domäne des SARS-COV-2 S1-Proteins entwickelt wurde. Für Neutralisationsassays wurden serielle Verdünnungen von 27BV in einer 96-Well-Platte durchgeführt, mit Ha-CoV-2 vorinkubiert und dann zu HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zielzellen hinzugefügt. Die Ergebnisse zeigten, dass 27BV eine neutralisierende Aktivität gegen alle getesteten Varianten aufwies (Abbildung 2). Interessanterweise war der ID50 von 27VB für Omicron etwa 10-mal weniger wirksam als der ID50 für Ha-CoV-2(WT) und Ha-CoV-2(Delta; Abbildung 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Ha-COV-2-Plattform als schnelle Methode zur Quantifizierung von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern in neu auftretenden Varianten eingesetzt werden kann. Abbildung 1. Assemblierung und Quantifizierung von Ha-CoV-2-Varianten. (A) Illustration der Assemblierung des Ha-CoV-2 und der Variantenpartikel. Die Vektoren, die das Ha-CoV-2-Reportergenom und die Strukturproteine (M, S, N und E) exprimieren, werden in HEK293T Zellen kotransfiziert. Die Partikel wurden 48 Stunden nach der Kotransfektion geerntet (die Bildgebung von Virionpartikeln und HEK293T Zellen wurde mit Biorender.com erstellt). (B) Quantifizierung der Infektiosität von Ha-CoV-2-Varianten. Die relative Infektiosität der beiden Varianten (Delta und Omicron) wird anhand genomischer RNA-Kopien einzelner Ha-CoV-2 (Luc)-Varianten quantifiziert und normalisiert. Wildtyp ist der Ha-COV-2 (Wt), der als Kontrolle zum Vergleich verwendet wird. Infektions- und Luciferase-Assays wurden 3x durchgeführt. RU, relative Einheit. Der Mittelwert und die Standardabweichung (SD) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2. Quantifizierung der 27BV-Neutralisationsaktivität gegen Ha-CoV-2(Luc)-Varianten Die Neutralisationsaktivität von 27BV wurde 18 h nach der Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen analysiert. Die ID50 wurde anhand der relativen Infektionsrate (Luciferase-Aktivität) im Vergleich zur 27BV-Konzentration berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3. Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2) mit Ha-CoV-2(GFP). Ha-CoV-2(GFP)-Partikel wurden zusammengesetzt und dann verwendet, um HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen zu infizieren. Die GFP-Expression wurde 48 Stunden nach der Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Das weiße Feld infizierter Zellen ist links und die GFP-Bildgebung rechts dargestellt. Der weiße Balken steht für 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Abbildung 1. Grafische Zusammenfassung. Die Struktur und Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus. Mit Biorender.com erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Akte 1. Proteinsequenzen. Liste der Sequenzen der SARS-CoV-2 S-, M-, N- und E-Proteine. Zu den S-Protein-Sequenzen gehören auch die SARS-CoV-2-Varianten Omikron (B.1.1.529) und Delta (B.1.617.2). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Ha-CoV-2-Plattform bietet einen schnellen, robusten und einfachen Arbeitsablauf zur Quantifizierung von Virusvarianten und zur Neutralisierung von Antikörpern. Es gibt jedoch einige kritische Schritte, die beachtet werden müssen. Die Herstellung des Ha-CoV-2-Pseudovirus sollte mit HEK293T Zellen mit hoher Lebensfähigkeit erfolgen. Die Kotransfektionseffizienz kann 24 Stunden nach der Transfektion mit dem GFP-Reportergen aus dem Ha-CoV-2-Genom überwacht werden. Das Ha-CoV-2-Genom kann zwei Reporter (GFP und Luc) enthalten, und GFP kann während der Kotransfektion und nach einer Ha-CoV-2-Infektion von Zielzellen exprimiert werden12. Die GFP+-Zellen aus der Infektion haben normalerweise einen geringen Prozentsatz (1% bis 5%), aber jede infizierte Zelle exprimiert starke GFP-Signale (Abbildung 3). Dieser niedrige GFP-Prozentsatz könnte die Verwendung von GFP als robustes Messwert zur Quantifizierung der Antikörperneutralisation im Vergleich zum Luc-Reporter, der die gesamte Population infizierter Zellen quantifiziert, einschränken.

Bei der Durchführung des Neutralisationsassays ist es wichtig, die Pipettenspitzen zwischen den Well-Transfers zu wechseln und sicherzustellen, dass der Antikörper und das serumfreie Medium gründlich gemischt werden, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus müssen die Zellen bei der Durchführung des Luciferase-Assay-Protokolls mindestens 3 Minuten lang vollständig lysiert werden, um eine vollständige Lyse der Zellen und die Freisetzung des Luciferase-Enzyms zu gewährleisten. Dadurch wird die Genauigkeit des Assays sichergestellt. Sobald die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den optischen weißwandigen 96-Well-Platten hinzugefügt wurde, muss die Platte innerhalb von 10 Minuten analysiert werden, da die anfängliche Lichtemission hoch ist, aber mit der Zeit abnimmt, wenn das ATP erschöpft ist21.

Da sich immer mehr SARS-CoV-2-Varianten weiterentwickeln, besteht ein erhöhter Bedarf an Plattformen wie Ha-CoV-2, um schnell auf die Infektiosität von Varianten und die Empfindlichkeit von Varianten gegenüber impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern zu untersuchen. Die Ha-CoV-2-Plattform bietet eine höhere Geschwindigkeit, ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis und ein einfaches Protokoll im Vergleich zu bestehenden pseudovirusbasierten Neutralisationsassays 8,9,10,11. Die Ha-CoV-2-Plattform bietet zudem den Vorteil, dass sie in BSL-2-Laboren eingesetzt werden kann und keine BSL-3-Einrichtungen benötigt. Dadurch kann SARS-CoV-2 in gemeinsamen Forschungs- und klinischen Labors erforscht werden. Darüber hinaus liefert die Ha-CoV-2-Plattform im Vergleich zu anderen Systemen schnelle Ergebnisse. Beispielsweise wird bei der Untersuchung neutralisierender Antikörper gegen das infektiöse SARS-CoV-2-Virus häufig der Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRINT) verwendet22. Obwohl PRINT zuverlässige Ergebnisse liefert, ist die manuelle Zählung von plaquebildenden Einheiten (PFUs) langsam und benötigt 3-5 Tage, um Ergebnisse zu erhalten 23,24. Andere Pseudotypsysteme, wie z.B. das Lentivirus-Pseudovirus, benötigen 24-72 h, um ein nachweisbares Reportersignalzu erzeugen 12. Im Vergleich dazu kann der Ha-CoV-2-Neutralisationsassay innerhalb von 18 h Ergebnisse liefern. Das Ha-CoV-2 bietet ein praktisches Werkzeug für das schnelle Screening und die Quantifizierung von Virusvarianten und neutralisierenden Antikörpern für die Pandemieüberwachung.

Die Überwachung der Infektiosität von SARS-CoV-2 ist von entscheidender Bedeutung, da immer mehr besorgniserregende Varianten (VOCs) auftauchen. Ha-CoV-2 bietet den Vorteil, dass die Infektiosität von VOCs schnell bestimmt werden kann. Frühere Studien haben auf künstlicher Intelligenz (KI) basierende Modellierung verwendet, um die Infektiosität der Omikron-Subvariante und der anderen SARS-CoV-2-Varianten, wie z. B. der Delta-Variante25, quantitativ zu analysieren. Diese Studien haben gezeigt, dass die Omicron-Variante ansteckender ist als das ursprüngliche Virus und mit größerer Wahrscheinlichkeit neutralisierenden Antikörpern entgeht25. In diesen Studien wurden mit Ha-CoV-2 ähnliche Phänotypen beobachtet. Darüber hinaus ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Omicron-Variante in den Antikörper-Neutralisations-Assays von 27BV neutralisiert wird, zehnmal geringer als bei den Stämmen Wuhan und Delta. Diese Ergebnisse stehen auch im Einklang mit der berichteten höheren Übertragbarkeit der Omikron-Variante, die mindestens 15 Mutationen auf ihrer Rezeptorbindungsdomäne (RBD) aufweist, was wahrscheinlich die virale Bindungsaffinität zum ACE2-Rezeptor für eine höhere Übertragbarkeit und eine größere Immunflucht erhöht26.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den internen Forschungsfonds der George Mason University unterstützt.

Materials

27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody Virongy Biosciences 27VBI-01
500 mL – US Origin FBS Neuromics FBS001
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit  Genesee Scientific Cat# 24-300 
Allegra 6R Centrifuge Beckman Coulter 2043-30-1158
DMEM (1x)  ThermoFisher  11995-073
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit Genesee Scientfic 25-209
GlowMax Discover Microplate reader Promega  GM3000 
Ha-CoV-2 E Vector  Virongy Biosciences pCoV2_E
Ha-CoV-2 M Vector  Virongy Biosciences pCoV2_M
Ha-CoV-2 N Vector  Virongy Biosciences pCoV2_N
Ha-CoV-2 WT S Vector Virongy Biosciences pCoV2_WT S
Hek293T cells ATCC CRL-3214
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays Gold Bio  I-930-1000
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney)  VWR  Cat# 82050-758 
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector  In house
PEI-based Transfection Reagent Virongy Biosciences Transfectin
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Invitrogen 10378016
Polyethylenimine, branched Millipore Sigma 408727-100ML
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System ThermoFisher  A43163
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells Virongy Biosciences Ready-To-Use-Cells
SARS-CoV-2 S  Omicron (B.1.1.529) Vector Virongy Biosciences pCoV2-B.1.1.529
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector Virongy Biosciences pCoV2- B.1.617.2
Syringe Filters, PES, 0.22µm Genesee Scientfic 25-244
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix ThermoFisher  4444432
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher  15250061
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Referências

  1. World Health Organization. . Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
  2. Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
  3. Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
  4. El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
  5. CDC. . Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , (2021).
  6. Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
  7. Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
  8. Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
  9. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  10. Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
  11. Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
  12. Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
  13. Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  14. Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 – Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
  15. Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  16. Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
  17. Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
  18. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
  19. Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
  20. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
  21. Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
  22. Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
  23. Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
  24. Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
  25. Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
  26. Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).

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Chilin, L., Hetrick, B., Wu, Y. Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies. J. Vis. Exp. (199), e65793, doi:10.3791/65793 (2023).
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