Применение псевдовируса Ha-CoV-2 для быстрого количественного определения вариантов SARS-CoV-2 и нейтрализующих антител

1. Сборка вирусов и вирусных частиц Переносчики: Приобретите векторы экспрессии для SARS-CoV-2 M, E или N, а также SARS-CoV-2 S (дикого типа, Wt), Delta (B.1.617.2) и Omicron (B.1.1.529) на коммерческой основе.ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые последовательности векторов экспрессии приведены в Дополнительном файле 1. Поставщика этих векторов выражений также можно найти в таблице материалов. Клетки и клеточная культура: Поддерживайте HEK293T клеток в модифицированной среде Eagle’s Medium (DMEM) Dulbecco, содержащей 10% термически инактивированную эмбриональную бычью сыворотку (FBS), 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с клеточными культурами должны выполняться в шкафу биобезопасности с ламинарным воздушным потоком. Для трансфекции полиэтиленимина (PEI) обычно требуется 5-6 часов инкубации. Время начала необходимо тщательно продумать заранее. Сборка вирусов и котрансфекция на основе PEI: Сборка частиц Ha-CoV-2 путем котрансфекции HEK293T клеток. Засевают клетки в чашку Петри с 10 см клеточной культуры (4-5 x 10,6 клеток в чашке) в 10 мл полной среды DMEM за день до котрансфекции. В этом исследовании три чашки Петри используются для посева клеток для сборки Ha-CoV-2 дикого типа, «Дельты» и «Омикрона» соответственно. Чашки Петри инкубируют в течение ночи в инкубатореСО2 при температуре 37 °C. На следующее утро проверьте посуду, чтобы убедиться, что ячейки сливаются на 80%. Удалите всю среду и замените ее 9 мл среды, не содержащей сыворотки DMEM. Для каждого блюда приготовьте смесь для котрансфекции с 2,5 мкг каждого из векторов экспрессии структурных белков SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 мкг pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (геном HaCoV2) и 2,5 мкг вектора экспрессии S-белка, вариантов Delta или Omicron S, и 45 мкл реагента для трансфекции на основе PEI. Дайте котрансфекционной смеси образовать комплексы, инкубируя в течение 13 мин (не инкубируйте дольше 30 мин). После инкубации медленно добавляйте котрансфекционную смесь в каждую чашку Петри, капля за каплей. Поместите посуду в инкубатор CO2 при температуре 37 °C на 6 ч. Через 6 ч удалите ДМЭМ без сыворотки и замените его полной средой ДМЭМ. Собирают вирус через 48-60 ч после котрансфекции. Сбор и хранение вирусов: Сбор частиц через 48 ч после котрансфекции. Отделите клетки путем многократного пипетирования по поверхности монослоя и соберите клетки из каждой чашки, поместите в центрифужные пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут. Соберите надосадочную жидкость и пропустите ее через фильтр 0,22 мкМ. Храните псевдовирус Ha-CoV-2 при температуре -80 °C. 2. Анализ на вирусную заразность Клетки и клеточная культура: Поддерживайте клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) в модифицированной среде Eagle’s (DMEM) Dulbecco, содержащей 10% термоинактивированного FBS, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Посев клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2): За день до анализа на вирусную инфекционность высевают клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) в 96-луночный планшет в 50 мкл полной среды DMEM. Для каждой 96-луночной пластины засейте 2,5 x 104 ячейки в каждую лунку, а всего для одной пластины необходимо 2,5 x 106 ячеек. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор CO2 при температуре 37 °C на ночь. Инфекция HEK293T(ACE2/TMPRSS2): используйте частицы вариантов Ha-CoV-2 для заражения клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Утром в день заражения удалите 50 мкл DMEM из предварительно засеянной 96-луночной пластины. Замените носитель 50 мкл Ha-CoV-2 дикого типа, Delta или Omicron на 18 ч при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен здесь до тех пор, пока инфекция не достигнет 18 часов инкубации и планшет не будет готов к анализу с помощью люциферазного анализа. Успешность инфекции определяется методом люциферазы, полученным в результате экспрессии репортерного гена люциферазы в инфицированных клетках, поэтому чем больше сигнала вырабатывается, тем успешнее инфекция вариантом Ha-CoV-2. Анализ люциферазы: После 18 ч инкубации добавьте 7,5 мкл буфера для лизиса клеток непосредственно в каждую лунку и перемешайте путем орбитального встряхивания в течение 2 мин. Лизируйте клетки в лизисном буфере не менее 5 мин при комнатной температуре. Приготовьте раствор люциферазы Firefly, смешав раствор D-люциферина с раствором люциферазы Firefly в соотношении 1:50. Для получения целой 96-луночной планшетной пластины смешайте 3 мл раствора субстрата люциферазы с 60 мкл раствора D-люциферина с 2940 мкл буферного раствора люциферазы Firefly. Добавьте 25 мкл раствора люциферазы Firefly к клеточным лизатам и перемешайте планшет орбитальным встряхиванием в течение 1 мин. Проанализируйте активность люциферазы с помощью коммерческого считывателя микропланшетов люциферазы. 3. РНК-экстракция Ha-CoV-2 и количественная ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-кПЦР) Экстракция вирусной РНК: Извлеките вирусную РНК из частиц Ha-CoV-2 дикого типа и Ha-CoV-2 вариантов Delta и Omicron с помощью коммерческого набора для экстракции вирусной РНК в соответствии с инструкциями производителя. Выделенную вирусную РНК хранят при температуре -80 °C или сразу используют для ОТ-кПЦР. ОТ-кПЦР: Проведите ОТ-кПЦР на вирусной РНК с использованием одноэтапной мастер-смеси. Проведите реакцию в коммерческом ПЦР-аппарате. Обратите внимание, что мишенью амплификации является геномная РНК Ha-CoV-2. Используйте векторную ДНК Ha-CoV-2 в качестве стандарта для создания стандартной кривой и вычисления числа копий РНК каждого варианта. 4. Анализ нейтрализующих антител Посев клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2): За день до анализа высевают клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) в 96-луночный планшет в 50 мкл полной среды DMEM. Элементы HEK293T(ACE2/TMPRSS2) приобретаются в промышленных масштабах. Для подсчета клеток берут 20 мкл клеток из колбы Т75, содержащей HEK293T(ACE2/TMPRSS2) клетки, и смешивают с 20 мкл раствора трипанового синего. Добавьте 20 мкл этой смеси в камеру для подсчета клеток и подсчитайте количество клеток в мл. Чтобы засеять 96-луночную пластину для заражения, используйте 2,5 х 104 ячейки на лунку, а всего потребуется 2,5 х 106 клеток. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор CO2 при температуре 37 °C на ночь. Анализ нейтрализующих антител: В стерильной полипропиленовой 96-луночной планшете приготовьте стандартную смесь нейтрализующих антител 27BV и Ha-CoV-2. Добавьте 8 мкл 27BV (45 мг/мл) в планшет и выполните серийные разведения антител с 6 мкл безсывороточного DMEM.ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно меняйте наконечники пипеток между лунками и убедитесь, что антитела и среда, не содержащая сыворотки, тщательно перемешаны для получения точных результатов. К серийно разведенному антителу добавляют 54 мкл частицы Ha-CoV-2 и смешивают вирус и антитело. Предварительную инкубацию частиц Ha-CoV-2 с последовательно разбавленным 27BV в течение 1 ч при 37 °C при 5% CO2. После 1 ч инкубации нанести 50 мкл смеси антител и Ha-CoV-2 на 96-луночный планшет, содержащий клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 104 клетки на лунку), высеянные накануне. Для контроля оставьте по крайней мере три лунки, содержащие только ячейки HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Добавьте 50 мкл полной среды в эти лунки, чтобы они служили неинфицированными лунками для фонового сигнала показаний анализа люциферазы.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен до тех пор, пока инфекция не достигнет 18 часов инкубации при 37 °C, после чего планшет будет готов к анализу с помощью люциферазного анализа. Анализ люциферазы: После 18 ч инкубации добавьте 7,5 мкл лизисного буфера непосредственно в каждую лунку и перемешайте путем орбитального встряхивания в течение 2 минут. Лизируйте клетки в лизисном буфере не менее 5 мин при комнатной температуре. Приготовьте раствор люциферазы Firefly, смешав раствор D-люциферина с раствором люциферазы Firefly в соотношении 1:50. Для получения целого 96-луночного планшета смешайте 3 мл раствора люциферазного субстрата с 60 мкл раствора D-люциферина с 2940 мкл буферного раствора люциферазы светлячка. Добавьте 25 мкл раствора люциферазы Firefly к клеточным лизатам и перемешайте планшет орбитальным встряхиванием в течение 1 мин. Проанализируйте активность люциферазы с помощью коммерческого считывателя микропланшетов люциферазы. 5. Количественная оценка и статистический анализ Сбор данных: Проведите анализ на инфекцию и люциферазу в трех экземплярах, как указано (рис. 1). Количественная оценка экспрессии люциферазы с помощью показаний анализа люциферазы. Среднее значение – это среднее значение трех показаний анализа люциферазы. Из этого среднего значения вычитаются показания фоновых сигналов от незараженных скважин. Стандартное отклонение (SD) определяется по среднему значению показаний люциферазного анализа. Анализ данных: Постройте график активности нейтрализации антител и рассчитайте значения ID50 (50% дозировка ингибирования) с помощью коммерческого программного обеспечения для построения графиков. Значение ID50 определяется как ингибирующие антитела разведения, при которых достигается 50%-ное снижение инфицирования клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (на основе показаний анализа люциферазы).