SARS-CoV-2変異株の迅速定量と中和抗体へのHa-CoV-2偽ウイルスの応用

1. ウイルスおよびウイルス粒子の集合体 ベクター:SARS-CoV-2 M、E、N、およびSARS-CoV-2 S(野生型、Wt)、デルタ(B.1.617.2)、オミクロン(B.1.1.529)の発現ベクターを市販で購入します。注:発現ベクターのタンパク質配列は、 補足ファイル1に記載されています。これらの発現ベクターのベンダーは、 材料表にも記載されています。 細胞および細胞培養:10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、50ユニット/mLのペニシリン、および50μg/mLのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でHEK293T細胞を維持します。注:すべての細胞培養作業は、層流バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。ポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクションには、通常、5〜6時間のインキュベーションが必要です。開始時間は事前に慎重に検討する必要があります。 ウイルス集合体とPEIベースのコトランスフェクション:HEK293T細胞のコトランスフェクションによりHa-CoV-2粒子をアセンブルします。コトランスフェクションの前日に、10 cmの細胞培養ペトリ皿(4-5 x 106細胞/ 皿あたり6細胞)に10 mLの完全なDMEM培地で細胞を播種します。この研究では、3つのペトリ皿を使用して、Ha-CoV-2野生型、デルタ型、オミクロン株をそれぞれ組み立てるための細胞を播種します。 ペトリ皿をCO2 インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。 翌朝、皿をチェックして、細胞が80%コンフルエントであることを確認します。培地を完全に取り出し、9 mLのDMEM無血清培地と交換します。 各ディッシュについて、SARS-CoV-2構造タンパク質発現ベクター(N、E、M)2.5 μg、pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ(HaCoV2ゲノム)10 μg、Sタンパク質発現ベクター2.5 μg(デルタまたはオミクロンS変異株)、および45 μLのPEIベースのトランスフェクション試薬を含むコトランスフェクション混合物を調製します。コトランスフェクション混合物を13分間インキュベートして複合体を形成します(30分以上インキュベートしないでください)。 インキュベーション後、コトランスフェクション混合物を各ペトリ皿にゆっくりと一滴ずつ加えます。皿を37°CのCO2 インキュベーター内に6時間入れます。6時間後、無血清DMEMを除去し、完全なDMEM培地と交換します。コトランスフェクション後48〜60時間でウイルスを回収します。 ウイルスの回収と保存:コトランスフェクション後48時間で粒子を回収します。単分子膜の表面で繰り返しピペッティングして細胞を剥離し、各ディッシュから細胞を回収し、15 mLの遠心チューブに入れ、400 x g で5分間遠心分離します。上清を回収し、0.22μMフィルターに通します。Ha-CoV-2偽ウイルスは-80°Cで保存します。 2. ウイルス感染性アッセイ 細胞および細胞培養:10%熱不活化FBS、50ユニット/mLのペニシリン、および50μg/mLのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でHEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を維持します。 HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞の播種:ウイルス感染性アッセイの前日に、50 μLの完全DMEM培地中の96ウェルプレートにHEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を播種します。各 96 ウェルプレートについて、各ウェルに 2.5 x 104 セルを播種し、1 つのプレートに合計 2.5 x 106 セルが必要です。96ウェルプレートを37°CのCO2 インキュベーターに一晩置きます。 HEK293T(ACE2/TMPRSS2)の感染:Ha-CoV-2変異株粒子を使用して、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞に感染します。感染の朝に、播種済みの96ウェルプレートから50μLのDMEMを除去します。培地を50 μLのHa-CoV-2野生型、デルタ型、またはオミクロンのいずれかと交換し、37°Cで18時間放置します。注:感染が18時間のインキュベーションに達し、プレートをルシフェラーゼアッセイで分析する準備が整うまで、プロトコルはここで停止できます。感染の成功は、感染細胞に発現するルシフェラーゼレポーター遺伝子から生じるルシフェラーゼアッセイによって決定されるため、より多くのシグナルが生成されるほど、Ha-CoV-2変異株の感染が成功します。 ルシフェラーゼアッセイ:18時間のインキュベーション後、7.5 μLの細胞溶解バッファーを各ウェルに直接添加し、2分間オービタル振とうして混合します。細胞を溶解緩衝液中で室温で少なくとも5分間溶解します。 D-ルシフェリン溶液とFireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を1:50の比率で混合して、Fireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を調製します。96ウェルプレート全体について、3 mLのルシフェラーゼ基質溶液と60 μLのD-ルシフェリン溶液、および2940 μLのFireflyルシフェラーゼバッファー溶液を混合します。 25 μL の Firefly ルシフェラーゼアッセイ溶液を細胞ライセートに加え、1 分間オービタル振とうしてプレートを混合します。市販のルシフェラーゼマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性を分析します。 3. Ha-CoV-2のRNA抽出と定量的逆転写酵素PCR(RT-qPCR) ウイルス RNA 抽出: 製造元の指示に従い、市販のウイルス RNA 抽出キットを使用して、Ha-CoV-2 野生型および Ha-CoV-2 デルタおよびオミクロン変異株の粒子からウイルス RNA を抽出します。抽出したウイルスRNAを-80°Cで保存するか、RT-qPCRにすぐに使用してください。 RT-qPCR:ワンステップマスターミックスを使用して、ウイルス RNA に対して RT-qPCR を実行します。市販のPCR装置で反応を行います。なお、増幅対象はHa-CoV-2のゲノムRNAです。Ha-CoV-2ベクターDNAを標準試料として使用し、検量線を作成し、各バリアントのRNAコピー数を計算します。 4. 中和抗体アッセイ HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞の播種:アッセイの前日に、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を96ウェルプレートに播種し、50 μLの完全DMEM培地に入れます。HEK293T(ACE2/TMPRSS2)セルは市販されています。 細胞をカウントするには、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を含むT75フラスコから20 μLの細胞を入手し、20 μLのトリパンブルー溶液と混合します。この混合物20 μLを細胞計数チャンバーに加え、mLあたりの細胞数をカウントします。感染のために96ウェルプレートを播種するには、ウェルあたり2.5 x 104 細胞を使用し、合計で2.5 x 106 細胞が必要になります。96ウェルプレートをCO2 インキュベーターに37°Cで一晩置きます。 中和抗体アッセイ:滅菌ポリプロピレン製96ウェルプレートで、標準27BV中和抗体とHa-CoV-2混合物を調製します。8 μL の 27BV (45 mg/mL) をプレートに加え、6 μL の無血清 DMEM で抗体を段階希釈します。注:正確な結果が得られるように、ウェル移送の合間にピペットチップを交換し、抗体と無血清培地が十分に混合されていることを確認してください。 段階希釈した抗体に、54 μLのHa-CoV-2粒子を加え、ウイルスと抗体を混合します。段階希釈した 27BV の Ha-CoV-2 粒子を 37 °C、5% CO2 で 1 時間プレインキュベートします。1時間のインキュベーション後、前日に播種したHEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞(ウェルあたり2.5 x 104 細胞)を含む96ウェルプレートに、50 μLの抗体とHa-CoV-2混合物を塗布します。 コントロールの場合は、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞のみを含むウェルを少なくとも3つ残します。これらのウェルに50 μLの完全培地を添加し、ルシフェラーゼアッセイの読み取り値のバックグラウンドシグナルの非感染ウェルとして使用します。注:感染が37°Cで18時間のインキュベーションに達するまで、ここでプロトコルを停止し、その後、プレートをルシフェラーゼアッセイで分析する準備が整います。 ルシフェラーゼアッセイ:18時間のインキュベーション後、7.5 μLの溶解緩衝液を各ウェルに直接添加し、2分間オービタル振とうして混合します。細胞を溶解緩衝液中で室温で少なくとも5分間溶解します。 D-ルシフェリン溶液とFireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を1:50の比率で混合して、Fireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を調製します。96ウェルプレート全体について、3 mLのルシフェラーゼ基質溶液と60 μLのD-ルシフェリン溶液、および2940 μLのホタルルシフェラーゼバッファー溶液を混合します。 25 μL の Firefly ルシフェラーゼアッセイ溶液を細胞ライセートに加え、1 分間オービタル振とうしてプレートを混合します。市販のルシフェラーゼマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性を分析します。 5. 定量化と統計分析 データ収集:感染アッセイとルシフェラーゼアッセイを、示されているように3回に分けて実施します(図1)。ルシフェラーゼアッセイの測定値でルシフェラーゼの発現を定量します。平均値は、3 つのルシフェラーゼ アッセイ測定値の平均値です。感染していないウェルからのバックグラウンドシグナルの読み取り値は、この平均値から差し引かれます。標準偏差(SD)は、ルシフェラーゼアッセイの読み取り値の平均値から決定されます。 データ解析:市販のグラフ作成ソフトウェアを使用して、抗体中和活性をプロットし、ID50 (50%阻害投与量)値を計算します。ID50 値は、HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 細胞の感染が 50% 減少する抗体阻害希釈液として定義されます (ルシフェラーゼアッセイの測定値に基づく)。