Præsenteret er en protokol til high-throughput lægemiddelscreening for at forbedre søvn ved at overvåge søvnadfærd hos bananfluer i en ældre Drosophila-model .
Søvn, en væsentlig komponent i sundhed og generelt velvære, giver ofte udfordringer for ældre personer, der ofte oplever søvnforstyrrelser præget af forkortet søvnvarighed og fragmenterede mønstre. Disse søvnforstyrrelser korrelerer også med en øget risiko for forskellige sygdomme hos ældre, herunder diabetes, hjerte-kar-sygdomme og psykiske lidelser. Desværre er eksisterende lægemidler til søvnforstyrrelser forbundet med betydelige bivirkninger såsom kognitiv svækkelse og afhængighed. Derfor er der et presserende behov for udvikling af nye, sikrere og mere effektive søvnforstyrrelsesmedicin. De høje omkostninger og den lange eksperimentelle varighed af de nuværende lægemiddelscreeningsmetoder er dog fortsat begrænsende faktorer.
Denne protokol beskriver en omkostningseffektiv screeningsmetode med høj kapacitet, der bruger Drosophila melanogaster, en art med en meget bevaret søvnreguleringsmekanisme sammenlignet med pattedyr, hvilket gør den til en ideel model til at studere søvnforstyrrelser hos ældre. Ved at administrere forskellige små forbindelser til ældre fluer kan vi vurdere deres virkninger på søvnforstyrrelser. Disse fluers søvnadfærd registreres ved hjælp af en infrarød overvågningsenhed og analyseres med open source-datapakken Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Denne protokol tilbyder en billig, reproducerbar og effektiv screeningsmetode til søvnregulering. Frugtfluer tjener på grund af deres korte livscyklus, lave husdyrbrugsomkostninger og lette håndtering som fremragende emner til denne metode. Som en illustration viste Reserpine, et af de testede lægemidler, evnen til at fremme søvnvarighed hos ældre fluer og fremhævede effektiviteten af denne protokol.
Søvn, en af de væsentlige adfærd, der er nødvendige for menneskelig overlevelse, er kendetegnet ved to hovedtilstande: hurtig øjenbevægelse (REM) søvn og ikke-hurtig øjenbevægelse (NREM) søvn1. NREM-søvn består af tre faser: N1 (overgangen mellem vågenhed og søvn), N2 (let søvn) og N3 (dyb søvn, langsom bølgesøvn), der repræsenterer progressionen fra vågenhed til dyb søvn1. Søvn spiller en afgørende rolle for både fysisk og mental sundhed2. Imidlertid reducerer aldring den samlede søvnvarighed, søvneffektivitet, søvnprocent med langsom bølge og REM-søvnprocent hos voksne3. Ældre personer har tendens til at bruge mere tid i let søvn sammenlignet med langsom bølgesøvn, hvilket gør dem mere følsomme over for natlige opvågninger. Når antallet af opvågninger stiger, falder den gennemsnitlige søvntid, hvilket resulterer i et fragmenteret søvnmønster hos ældre, hvilket kan være forbundet med overdreven excitation af HCRT-neuroner hos mus4. Derudover bidrager aldersrelaterede fald i døgnrytmemekanismer til et tidligere skift i søvnvarighed 5,6. I kombination med fysisk sygdom, psykologisk stress, miljøfaktorer og medicinbrug gør disse faktorer ældre voksne mere modtagelige for søvnforstyrrelser, såsom søvnløshed, REM-søvnadfærdsforstyrrelse, narkolepsi, periodiske benbevægelser, rastløse bensyndrom og søvnforstyrret vejrtrækning 7,8.
Epidemiologiske undersøgelser har vist, at søvnforstyrrelser er tæt forbundet med kroniske sygdomme hos ældre9, herunder depression10, hjerte-kar-sygdom 11 og demens12. Håndtering af søvnforstyrrelser spiller en afgørende rolle i forbedring og behandling af kroniske sygdomme og forbedring af livskvaliteten for ældre voksne. I øjeblikket er patienter primært afhængige af lægemidler som benzodiazepiner, ikke-benzodiazepiner og melatoninreceptoragonister for at forbedre søvnkvaliteten13. Benzodiazepiner kan imidlertid føre til nedregulering af receptorer og afhængighed efter langvarig brug, hvilket forårsager alvorlige abstinenssymptomer ved seponering14,15. Ikke-benzodiazepiner indebærer også risici, herunder demens16, brud17 og kræft18. Den almindeligt anvendte melatoninreceptoragonist, ramelteon, reducerer søvnlatens, men øger ikke søvnvarigheden og har leverfunktionsrelaterede bekymringer på grund af omfattende eliminering af første pass19. Agomelatin, en melatoninreceptoragonist og serotoninreceptorantagonist, forbedrer depressionsrelateret søvnløshed, men udgør også en risiko for leverskade20. Derfor er der et presserende behov for sikrere lægemidler til behandling eller lindring af søvnforstyrrelser. De nuværende lægemiddelscreeningsstrategier, der er baseret på molekylære og cellulære eksperimenter kombineret med automatiserede systemer og computeranalyse, er imidlertid dyre og tidskrævende21. Strukturbaserede lægemiddeldesignstrategier, der er afhængige af receptorstruktur og egenskaber, kræver en klar forståelse af receptorens tredimensionelle struktur og mangler prædiktive evner for lægemiddeleffekter22.
I 2000, baseret på søvnkriterierne foreslået af Campbell og Tobler i 1984 23, etablerede forskere enkle dyremodeller til at studere søvn 24, herunder Drosophila melanogaster, som udviste søvnlignende tilstande25,26. På trods af anatomiske forskelle mellem Drosophila og mennesker bevares mange neurokemiske komponenter og signalveje, der regulerer søvn i Drosophila, i pattedyrs søvn, hvilket letter undersøgelsen af menneskelige neurologiske sygdomme27,28. Drosophila anvendes også i vid udstrækning i døgnrytmeundersøgelser på trods af forskelle i kerneoscillatorer mellem fluer og pattedyr 29,30,31. Derfor tjener Drosophila som en værdifuld modelorganisme til at studere søvnadfærd og udføre søvnrelateret lægemiddelscreening.
Denne undersøgelse foreslår en omkostningseffektiv og enkel fænotypebaseret tilgang til screening af småmolekylære lægemidler til behandling af søvnforstyrrelser ved hjælp af ældre fluer. Søvnregulering i Drosophila er meget bevaret25, og faldet i søvn observeret med alderen kan være reversibel gennem lægemiddeladministration. Således kan denne søvnfænotypebaserede screeningsmetode intuitivt afspejle lægemiddeleffektivitet. Vi fodrer fluerne med en blanding af det undersøgte lægemiddel og mad, overvåger og registrerer søvnadfærd ved hjælp af Drosophila Activity Monitor (DAM)32 og analyserer de erhvervede data ved hjælp af open source SCAMP2020 datapakken i MATLAB (figur 1). Statistisk analyse udføres ved hjælp af statistik og grafsoftware (se materialetabel). Som et eksempel demonstrerer vi effektiviteten af denne protokol ved at præsentere eksperimentelle data om Reserpin, en småmolekylehæmmer af den vesikulære monoamintransportør, der rapporteres at øge søvn33. Denne protokol giver en værdifuld tilgang til at identificere lægemidler til behandling af aldersrelaterede søvnproblemer.
Den beskrevne metode er egnet til hurtig screening af små og mellemstore søvnmedicin. I øjeblikket er de fleste almindelige screeningsmetoder med høj kapacitet baseret på biokemiske og cellulære niveauer. For eksempel undersøges receptorens struktur og egenskaber for at søge efter specifikke ligander, der kan binde til det22. En anden tilgang indebærer analyse af bindingstilstanden og styrken af molekylære fragmenter af udvalgte lægemidler ved anvendelse af kernemagnetisk resonans (NMR)…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Junhai Hans laboratoriemedlemmer for deres diskussion og kommentarer. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China 32170970 til Y.T og “Cyanine Blue Project” i Jiangsu-provinsen til Z.C.Z.
Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |