दो लिंगों में मल्टीपल स्केलेरोसिस मॉडलिंग: एमओजी35-55-प्रेरित प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस
Summary
प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस मल्टीपल स्केलेरोसिस के सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले म्यूरिन मॉडल में से एक है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, दोनों लिंगों के C57BL/6J चूहों को माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मुख्य रूप से पूंछ और अंगों के आरोही पैरेसिस होते हैं। यहां हम ईएई प्रेरण और मूल्यांकन के प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं।
Abstract
मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) एक पुरानी ऑटोइम्यून सूजन की बीमारी है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करती है। यह लिंगों में अलग-अलग प्रसार की विशेषता है, पुरुषों की तुलना में अधिक महिलाओं को प्रभावित करता है, और विभिन्न परिणाम, महिलाओं की तुलना में पुरुषों में अधिक आक्रामक रूप दिखाते हैं। इसके अलावा, एमएस नैदानिक पहलुओं, रेडियोलॉजिकल और रोग संबंधी विशेषताओं के संदर्भ में अत्यधिक विषम है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक पशु मॉडल का लाभ उठाना आवश्यक है जो पैथोलॉजी के अधिक से अधिक पहलुओं की जांच की अनुमति देता है। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) चूहों में एमएस के सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले मॉडल में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, प्रतिरक्षा प्रणाली की सक्रियता से लेकर सीएनएस क्षति तक, विभिन्न रोग सुविधाओं का मॉडलिंग। यहां हम माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) टीकाकरण का उपयोग करके पुरुष और महिला C57BL/6J चूहों दोनों में EAE को शामिल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिससे रोग का एक पुराना रूप विकसित होता है। हम टीकाकरण के बाद 28 दिनों के लिए इन चूहों के दैनिक नैदानिक स्कोर और मोटर प्रदर्शन के मूल्यांकन की भी रिपोर्ट करते हैं (28 डीपीआई)। अंत में, हम सीएनएस स्तर पर कुछ बुनियादी ऊतकीय विश्लेषण का वर्णन करते हैं, जो रीढ़ की हड्डी पर रोग-प्रेरित क्षति की प्राथमिक साइट के रूप में ध्यान केंद्रित करते हैं।
Introduction
मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) एक पुरानी ऑटोइम्यून सूजन की बीमारी है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करती है। यह भड़काऊ कोशिकाओं, डिमाइलिनेशन, एक्सोनल लॉस और ग्लियोसिस1 के पेरिवस्कुलर घुसपैठ की उपस्थिति को दर्शाता है। इसका एटियलजि अज्ञात रहता है, और इसके नैदानिक पहलू, रेडियोग्राफिक और रोग संबंधी विशेषताएं रोग2 में उल्लेखनीय विविधता का सुझाव देती हैं।
इसकी अज्ञात एटियलजि और जटिलता के कारण, वर्तमान में, कोई भी पशु मॉडल मानव एमएस 3,4 में प्रदर्शित सभी नैदानिक और रेडियोलॉजिकल विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत नहीं करता है। हालांकि, एमएस 3,4 के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न पशु मॉडल कार्यरत हैं। इन मॉडलों में, रोग की शुरुआत आमतौर पर बेहद कृत्रिम होती है, और नैदानिक संकेतों की शुरुआत की समय सीमा मनुष्यों और चूहों के बीच अलग होती है। उदाहरण के लिए, मनुष्यों में, नैदानिक अभिव्यक्तियों की शुरुआत से पहले रोग को अंतर्निहित करने वाली पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं का पता नहीं लगाया जाता है। इसके विपरीत, प्रयोगकर्ता एमएस इंडक्शन4 के बाद हफ्तों या दिनों के भीतर पशु मॉडल में लक्षणों का पता लगा सकते हैं।
तीन बुनियादी पशु मॉडल डिमाइलिनेशन की विशेषताओं का उत्पादन करते हैं जो एमएस की विशेषता हैं: वे जो वायरस-प्रेरित हैं (जैसे, थिइलर के म्यूरिन एन्सेफैलोमाइलाइटिस वायरस), जो विषाक्त एजेंटों (जैसे, क्यूप्रीज़ोन, लियोकोसिथिन) द्वारा प्रेरित होते हैं, और प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) 5 के विभिन्न रूप। प्रत्येक मॉडल रोग के कुछ विशिष्ट पहलुओं का अध्ययन करने में मदद करता है लेकिन कोई भी एमएस6 की सभी विशेषताओं को दोहराता नहीं है। इस प्रकार, विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और संबोधित किए जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्नों पर विचार करते हुए सही मॉडल चुनना महत्वपूर्ण है।
माइलिन-व्युत्पन्न एंटीजन के खिलाफ टीकाकरण प्रक्रियाओं के लिए धन्यवाद, ईएई अतिसंवेदनशील चूहों में सीएनएस घटकों के लिए एक ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया को ट्रिगर करके प्रेरित होता है। इम्यूनोपैथोलॉजिकल और न्यूरोपैथोलॉजिकल तंत्र की एक विस्तृत श्रृंखला के बीच परस्पर क्रिया प्रतिरक्षित चूहों 7,8 में एमएस (यानी, सूजन, डिमाइलिनेशन, एक्सोनल हानि, और ग्लियोसिस) के प्रमुख रोग लक्षणों के विकास का कारण बनती है। चूहे टीकाकरण के बाद दूसरे सप्ताह के आसपास नैदानिक लक्षण दिखाना शुरू करते हैं और आम तौर पर पूंछ से अंग और अग्रभाग तक आरोही पक्षाघात दिखाते हैं। नैदानिक स्कोर (यानी, रोग से संबंधित घाटे के संचय की मात्रा का ठहराव) आमतौर पर 5-बिंदु पैमाने7 का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है।
प्रोटीन या पेप्टाइड या एन्सेफलोजेनिक टी कोशिकाओं के निष्क्रिय हस्तांतरण के साथ सक्रिय टीकाकरण का उपयोग विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि (जैसे, एसजेएल / जे, सी 57 बीएल / 6, और गैर-मोटापे-मधुमेह (एनओडी) चूहों) के साथ चूहों में ईएई को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। माइलिन प्रोटीओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी), माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी), और माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) स्व-सीएनएस प्रोटीन के उदाहरण हैं जिनसे आमतौर पर इम्युनोजेन्स का उत्पादन होता है। विशेष रूप से, पीएलपी (पीएलपी139−151) के इम्यूनोडोमिनेंट एपिटोप के साथ प्रतिरक्षित एसजेएल/जे चूहों ने एक रिलैपसिंग-रिमिटिंग (आरआर) रोग पाठ्यक्रम विकसित किया, जबकि सी 57 बीएल / 6 जे चूहों ने इम्यूनोडोमिनेंट एमओजी35-55 पेप्टाइड शो ईएई के साथ प्रतिरक्षित किया एक पुरानी प्रकृति1. कुछ सीमाओं के बावजूद, जैसे एमएस प्रगति के बारे में बहुत कम जानकारी प्रदान करना, रोग में बी कोशिकाओं की भूमिका, अंदर-बाहर तंत्र, या पुनर्मिलन का अध्ययन करने में कठिनाइयों, ईएई मॉडल ने ऑटोइम्यून और न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रक्रियाओं की समझ में बेहद योगदान दिया है, एमएस क्षेत्र में ज्ञान बढ़ाना और इस प्रकार इस बीमारी के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास की अनुमति देना4, 6.
वर्तमान कार्य में, हमने सक्रिय ईएई के एक विशेष रूप पर ध्यान केंद्रित किया, माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) -प्रेरित फॉर्म 9,10,11,12। एमओजी35-55-प्रेरित ईएई एमएस का एक पुराना रूप मॉडल करता है। टीकाकरण के बाद, चूहों टीकाकरण के बाद पहले सप्ताह के भीतर एक स्पर्शोन्मुख चरण से गुजरना, तो रोग आम तौर पर टीकाकरण के बाद दूसरे सप्ताह के दौरान उठता है, जबकि टीकाकरण के बाद तीसरे और चौथे सप्ताह के बीच, रोग पुरानी हो जाता है, संचित घाटे से पूरी वसूली की कोई संभावना नहीं के साथ 7,8,13. दिलचस्प बात यह है कि साहित्य14 में मौजूद अधिकांश अध्ययनों में घटनाओं, बीमारी की शुरुआत, पाठ्यक्रम या प्रगति में पुरुषों और महिलाओं के बीच कोई अंतर नहीं देखा जाता है, भले ही कम अध्ययन पुरुषों और महिलाओं में बीमारी की तुलना करते हों।
इसके विपरीत, मनुष्यों में, इन मापदंडों को दृढ़ता से यौन रूप से मंद माना जाता है2. एमएस पुरुषों की तुलना में अधिक महिलाओं को प्रभावित करता है; हालांकि, पुरुष आमतौर पर बीमारी का अधिक आक्रामक रूप विकसित करते हैं2. इस सबूत ने एक आवश्यक, साथ ही जटिल, गोनाडल हार्मोन15 की भूमिका का सुझाव दिया है; फिर भी, पैथोलॉजी में सेक्स हार्मोन की भूमिका और कार्रवाई का तंत्र स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, पशु मॉडल से डेटा दोनों एस्ट्रोजेन और एण्ड्रोजन एक सेक्स विशिष्ट तरीके से16,17 पैथोलॉजी के विभिन्न इलाकों पर सकारात्मक प्रभाव डालती है कि विचार का समर्थन.
कुछ अध्ययनों से प्रोजेस्टेरोन18 के न्यूरोप्रोटेक्टिव, प्रोमाइलिनेटिंग और एंटी-इंफ्लेमेटरी प्रभाव भी सुझाए गए हैं और, हालांकि एमएस रोगियों में सबूत दुर्लभ18 हैं, न्यूरोएक्टिव स्टेरॉयड (यानी, तंत्रिका तंत्र द्वारा डे नोवो संश्लेषित स्टेरॉयड, जैसे कि प्रेग्नेनोलोन, टेट्राहाइड्रोप्रोजेस्टेरोन, और डायहाइड्रोप्रोजेस्टेरोन) भी रोग पाठ्यक्रम19 को प्रभावित कर सकता है. सामूहिक रूप से, ये आंकड़े इस विचार का समर्थन करते हैं कि परिधीय रूप से और सीएनएस के अंदर उत्पादित सेक्स हार्मोन की बीमारी की शुरुआत और प्रगति में एक महत्वपूर्ण और सेक्स-विशिष्ट भूमिका है। इसलिए, वर्तमान कार्य में, हम नर और मादा दोनों जानवरों से अलग-अलग डेटा एकत्र करने का आग्रह करते हैं।
हिस्टोपैथोलॉजिकल दृष्टिकोण से, रीढ़ की हड्डी का सफेद पदार्थ इस मॉडल में सीएनएस चोट की प्रमुख साइट के रूप में कार्य करता है, जो मोनोन्यूक्लियर भड़काऊ घुसपैठ और डिमाइलिनेशन8 के मल्टीफोकल, संगम क्षेत्रों की विशेषता है। इस प्रकार, C57BL/6J चूहों में MOG35-55-प्रेरित EAE को शामिल करने के लिए इस प्रोटोकॉल का वर्णन करने में, हम दो लिंगों में रोग के परिणाम को ध्यान में रखेंगे और रीढ़ की हड्डी के बारे में कुछ हिस्टोपैथोलॉजिकल अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
MOG35-55-प्रेरित EAE प्रोटोकॉल जिसका हमने वर्णन किया है, C57BL/6J चूहों 7,8,13 में MS के जीर्ण रूप के विकास का नेतृत्व किया। इन प्रतिनिधि परिणामों में, हमने बताया कि टीकाकरण प्रक्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को मिनिस्टरो डेल’इस्ट्रूज़ियोन, डेल’यूनिवर्सिटी ई डेला रिसेर्का – MIUR प्रोजेक्ट डिपार्टमेंटी डिपार्टमेंटी डि एक्सेलेन्ज़ा 2018-2022 और 2023-2027 द्वारा न्यूरोसाइंस विभाग रीटा लेवी मोंटालिनी द्वारा समर्थित किया गया है; कैवेलियरी-ओटोलेघी फाउंडेशन, ओरबासानो, इटली। बीबी INFRA-P, पीडमोंट क्षेत्र (n.378-35) (2022-2023) और PRIN 2020 – 20203AMKTW के साथी थे। हम समर्थन के लिए Fondazione प्रति la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) को धन्यवाद देते हैं। प्रकाशन शुल्क को डिस्ट्रेटो रोटारैक्ट 2031 और विशेष रूप से, रोटारैक्ट क्लब टोरिनो नॉर्ड-एस्ट के दयालु दान द्वारा समर्थित किया गया है। हम अपनी पांडुलिपि की प्रूफरीडिंग के लिए ऐलेन मिलर को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
Referências
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