Användning av Drosophila Larval Neuromuscular Junction och muskelceller för att visualisera mikrotubulinätverk
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att visualisera mikrotubulinätverken i neuromuskulära korsningar och muskelceller. I kombination med de kraftfulla genetiska verktygen hos Drosophila melanogaster, underlättar detta protokoll i hög grad genetisk screening och mikrotubulidynamisk analys för rollen som mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet.
Abstract
Mikrotubulinätverket är en viktig komponent i nervsystemet. Mutationer i många mikrotubuliregulatoriska proteiner är associerade med utvecklingsneurologiska funktionsnedsättningar och neurologiska sjukdomar, såsom mikrotubuli-associerat protein Tau till neurodegenerativa sjukdomar, mikrotubuliavskiljande protein Spastin och Katanin 60 orsakar ärftlig spastisk paraplegi respektive utvecklingsneurologiska avvikelser. Detektion av mikrotubulinätverk i nervceller är fördelaktigt för att belysa patogenesen av neurologiska sjukdomar. Den lilla storleken på neuroner och det täta arrangemanget av axonala mikrotubulibuntar gör det dock utmanande att visualisera mikrotubulinätverken. I denna studie beskriver vi en metod för dissektion av larvneuromuskulära förbindelser och muskelceller, samt immunfärgning av α-tubulin och mikrotubuli-associerat protein Futsch för att visualisera mikrotubulinätverk i Drosophila melanogaster. Den neuromuskulära förbindelsen gör det möjligt för oss att observera både pre- och postsynaptiska mikrotubuli, och den stora storleken på muskelcellerna i Drosophila-larven möjliggör tydlig visualisering av mikrotubulinätverket. Här, genom att mutera och överuttrycka Katanin 60 i Drosophila melanogaster, och sedan undersöka mikrotubulinätverken i den neuromuskulära förbindelsen och muskelcellerna, avslöjar vi exakt den reglerande rollen för Katanin 60 i neuroutveckling. Därför, i kombination med de kraftfulla genetiska verktygen hos Drosophila melanogaster, underlättar detta protokoll i hög grad genetisk screening och analys av mikrotubulidynamik för rollen som mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet.
Introduction
Mikrotubuli (MT), som en av de strukturella komponenterna i cytoskelettet, spelar en viktig roll i olika biologiska processer, inklusive celldelning, celltillväxt och motilitet, intracellulär transport och underhåll av cellform. Mikrotubulidynamik och funktion moduleras av interaktioner med andra proteiner, såsom MAP1, MAP2, Tau, Katanin och Kinesin 1,2,3,4,5.
I neuroner är mikrotubuli viktiga för utveckling och underhåll av axoner och dendriter. Avvikelser i mikrotubuli leder till dysfunktion och till och med neuronerdöd. Till exempel, i hjärnan hos Alzheimerspatienter, minskar Tau-proteinhyperfosforylering stabiliteten i mikrotubulinätverket, vilket orsakar neurologiska oregelbundenheter6. Således kommer undersökning av mikrotubulinätverk att bidra till en förståelse av neuroutveckling och patogenesen av neurologiska sjukdomar.
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är den perifera synapsen som bildas mellan en motorneuronaxonterminal och en muskelfiber, vilket är ett utmärkt och kraftfullt modellsystem för att studera synaptisk struktur och funktioner7. Futsch är ett protein i Drosophila som är homologt med det mikrotubulibindande proteinet MAP1B som finns hosdäggdjur8. Det uttrycks endast i neuroner och spelar en roll i utvecklingen av NMJ:s synaptiska knappar 8,9. I vildtyp visualiseras filamentösa buntar som löper längs mitten av NMJ-processer genom immunfärgning med anti-Futsch. När den når NMJ:s ände har denna bunt förmågan att antingen bilda en slinga bestående av mikrotubuli eller förlora sin trådformiga struktur, vilket resulterar i ett diffust och punkterat utseende10. Mikrotubulislingor är associerade med pausade tillväxtkoner, vilket tyder på att mikrotubulimatrisen är stabil11. Därför kan vi indirekt bestämma den stabila mikrotubuliutvecklingen i NMJ genom Futsch-färgning. Den stora storleken på muskelcellerna i Drosophila-larven möjliggör en tydlig visualisering av mikrotubulinätverket. De faktorer som påverkar stabiliteten i mikrotubulinätverket kan hittas genom att analysera mikrotubulis densitet och form. Samtidigt kan muskelcellernas mikrotubulinätverksstatus korsverifieras med resultatet av NMJ för att få mer omfattande slutsatser.
Många protokoll har använts för att undersöka nätverket och dynamiken hos mikrotubuli. Dessa undersökningar har dock ofta fokuserat på in vitro-studier 12,13,14,15,16. Alternativt har vissa in vivo-experiment använt elektronmikroskopi för att detektera cytoskelettet17. Enligt den specifika bindningen av fluorescerande märkta antikroppar eller kemiska färgämnen till proteiner eller DNA, möjliggör de metoder som presenteras här detektion av mikrotubulinätverk i NMJ på nivån av enskilda neuroner in vivo, med resultat som bekräftas av observationer i muskelceller. Detta protokoll är enkelt, stabilt och repeterbart när det kombineras med de kraftfulla genetiska verktyg som finns tillgängliga i Drosophila melanogaster, vilket möjliggör ett brett spektrum av fenotypiska undersökningar och genetiska screeningar för rollen av mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs ett protokoll för dissektion och immunfärgning av neuromuskulära neuromuskulära förbindelser och muskelceller hos Drosophila-larver . Det finns flera viktiga punkter att tänka på. För det första är det viktigt att undvika skador på de observerade musklerna under dissektionsprocessen. Det kan vara värt att fixa filén innan man tar bort inre organ för att förhindra direktkontakt mellan pincetten och musklerna. För att undvika muskelskador eller separation från larvepidermis är det v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Ying Xiong för diskussioner och kommentarer om manuskriptet. Detta arbete stöds av ett anslag från National Science Foundation of China (NSFC) till C. M. (31500839).
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
Referências
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
