Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.
Abstract
La red de microtúbulos es un componente esencial del sistema nervioso. Las mutaciones en muchas proteínas reguladoras de los microtúbulos se asocian con trastornos del neurodesarrollo y enfermedades neurológicas, como la proteína Tau asociada a microtúbulos a enfermedades neurodegenerativas, la proteína cortante de microtúbulos Spastin y Katanin 60 causan paraplejia espástica hereditaria y anomalías del neurodesarrollo, respectivamente. La detección de redes de microtúbulos en las neuronas es ventajosa para dilucidar la patogénesis de los trastornos neurológicos. Sin embargo, el pequeño tamaño de las neuronas y la densa disposición de los haces de microtúbulos axonales dificultan la visualización de las redes de microtúbulos. En este estudio, describimos un método para la disección de la unión neuromuscular larvaria y las células musculares, así como la inmunotinción de α-tubulina y la proteína Futsch asociada a microtúbulos para visualizar redes de microtúbulos en Drosophila melanogaster. La unión neuromuscular nos permite observar los microtúbulos pre y postsinápticos, y el gran tamaño de las células musculares en la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Aquí, mutando y sobreexpresando Katanin 60 en Drosophila melanogaster, y luego examinando las redes de microtúbulos en la unión neuromuscular y las células musculares, revelamos con precisión el papel regulador de Katanin 60 en el neurodesarrollo. Por lo tanto, combinado con las poderosas herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.
Introduction
Los microtúbulos (MT), como uno de los componentes estructurales del citoesqueleto, desempeñan un papel importante en diversos procesos biológicos, incluida la división celular, el crecimiento y la motilidad celular, el transporte intracelular y el mantenimiento de la forma celular. La dinámica y la función de los microtúbulos están moduladas por interacciones con otras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin y Kinesin 1,2,3,4,5.
En las neuronas, los microtúbulos son esenciales para el desarrollo y mantenimiento de axones y dendritas. Las anomalías en los microtúbulos conducen a la disfunción e incluso a la muerte de las neuronas. Por ejemplo, en el cerebro de los pacientes con Alzheimer, la hiperfosforilación de la proteína Tau reduce la estabilidad de la red de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas6. Por lo tanto, el examen de las redes de microtúbulos contribuirá a la comprensión del neurodesarrollo y la patogénesis de las enfermedades neurológicas.
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica formada entre el terminal axonal de una neurona motora y una fibra muscular, que es un excelente y potente sistema modelo para estudiar la estructura y las funciones sinápticas7. Futsch es una proteína de Drosophila que es homóloga a la proteína de unión a microtúbulos MAP1B que se encuentra en los mamíferos8. Se expresa solamente en las neuronas y desempeña un papel en el desarrollo de los botones sinápticos de la NMJ 8,9. En el tipo salvaje, los haces filamentosos que corren a lo largo del centro de los procesos NMJ se visualizan mediante inmunotinción con anti-Futsch. Al llegar al final de NMJ, este haz tiene la capacidad de formar un bucle formado por microtúbulos o de perder su estructura filamentosa, lo que da lugar a un aspecto difuso y punteado10. Los bucles de microtúbulos se asocian con conos de crecimiento en pausa, lo que sugiere que la matriz de microtúbulos es estable11. Por lo tanto, podemos determinar indirectamente el desarrollo estable de microtúbulos en NMJ mediante tinción de Futsch. El gran tamaño de las células musculares de la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Los factores que afectan la estabilidad de la red de microtúbulos se pueden encontrar analizando la densidad y la forma de los microtúbulos. Al mismo tiempo, el estado de la red de microtúbulos de las células musculares se puede verificar de forma cruzada con el resultado de la NMJ para obtener conclusiones más completas.
Se han empleado muchos protocolos para investigar la red y la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, estas investigaciones muchas veces se han centrado en estudios in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, algunos experimentos in vivo han empleado microscopía electrónica para detectar el citoesqueleto17. De acuerdo con la unión específica de anticuerpos marcados con fluorescencia o colorantes químicos a proteínas o ADN, los métodos aquí presentados permiten la detección de redes de microtúbulos en NMJ a nivel de neuronas individuales in vivo, con resultados corroborados por observaciones en células musculares. Este protocolo es simple, estable y repetible cuando se combina con las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila melanogaster, lo que permite una amplia gama de exámenes fenotípicos y exámenes genéticos para el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un protocolo para la disección e inmunotinción de las uniones neuromusculares y las células musculares de las larvas de Drosophila . Hay varios puntos esenciales a tener en cuenta. En primer lugar, evitar lesiones en los músculos observados es crucial durante el proceso de disección. Puede valer la pena arreglar el filete antes de extraer los órganos internos para evitar el contacto directo entre las pinzas y los músculos. Para evitar daños musculares o la separación de la epidermis la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Ying Xiong por las discusiones y comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias de China (NSFC) a C. M. (31500839).
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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