2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

이 연구는 헬싱키 선언의 지침에 따라 수행되었으며 바르샤바 의과대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다(KB/7/2022). 연구에 참여한 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 주의: 고급 피부 모델 준비의 설명된 절차는 상업적으로 이용 가능한 일차 피부 세포 및 세포주를 사용하거나 환자로부터 분리한 일차 세포를 사용하여 수행할 수 있습니다. 상업용 셀은 관련 문서와 함께 제공되며 대부분의 국가에서 연구에서 사용하는 데 추가 승인이 필요하지 않습니다. 그러나 일부 국가에서는 의무 사항이므로 현지 윤리 위원회 규정에 따라 확인해야 합니다. 환자로부터 분리한 일차 세포를 연구에 사용해야 하는 경우, 먼저 연구는 지역 윤리 위원회의 승인을 받아야 하며, 엄격한 지침에 따라 수행되어야 합니다. 또한 모든 피부 조직 기증자로부터 서면 동의서를 수집해야 합니다. 일차 피부 세포의 분리는 이 논문의 주제가 아니었지만, Kosten et al. (keratinocytes)18, Ścieżyńska et al. (melanocytes)19, Kröger et al. (fibroblasts and mast cells)20에서 예시적인 분리 절차를 찾을 수 있습니다. 대부분의 정상적인 피부 세포와 세포주는 BSL1 등급의 안전 수준을 가지고 있습니다. 그들은 어떤 위협도 일으키지 않습니다. 그러나 사용된 실험실 장비는 통제된 조건에서 동물 및 인간 세포 배양 표준을 충족해야 합니다. 1. 피부 세포 배양 참고: 피부 세포 배양은 37°C에서 인큐베이터에서 이산화탄소 함량이 5%인 부착 세포 또는 부유 세포(세포 유형에 따라 다름) 전용 플라스크에서 수행해야 합니다. 재배 및 연구 사용과 관련된 활동은 멸균 상태가 필요하며 자외선 C(UVC)에 15-30분 동안 노출된 후 층류 챔버에서 수행해야 합니다. 2차원 및 3차원 모델을 만드는 데 사용되는 세포 현탁액을 얻으려면 세포 유형에 따라 절차를 구현해야 합니다(각질세포, 섬유아세포, 멜라닌세포와 같은 부착 세포의 경우 – 1.1단계, 비만 세포의 비부착 세포의 경우 – 1.2단계)(그림 3). 다양한 배양 플라스크 크기의 경우, 설명된 방법에 사용된 모든 시약(예: 매체, 인산염 완충 식염수 또는 트립신 용액)의 부피가 표 3에 나열되어 있습니다. 세포의 종류에 따른 파라미터(예: 시약의 농도 및 조성, 원심분리 방법 등)는 표 4에 정렬되어 있습니다. 파종에 사용되는 세포 밀도는 표 5에 나와 있습니다. 이러한 모든 표는 이 섹션의 끝에 포함되어 있습니다. 그림 3: 부착 및 비부착 세포 배양. 부착 및 비부착 세포 배양의 일반적인 단계별 절차(숫자는 1.1 및 1.2 단계의 설명에 해당). 이 그림은 MS PowerPoint로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 부착 세포의 현탁액 얻기배양 플라스크에서 배지를 제거합니다. 인산염 완충 식염수로 세포를 부드럽게 세척합니다(PBS, 표 3). 에틸렌 디아민 테트라 아세트산(trypsin-EDTA 용액, 표 3)에 트립신 용액을 첨가합니다. 37°C에서 플라스크를 배양하고 광학 현미경의 표면에서 세포가 분리되는 과정을 제어합니다. 트립신을 비활성화하기 위해 분리된 세포를 최소 2배의 전성장 배지 또는 트립신 중화제에 현탁시킵니다(부피의 경우 표 3 참조, 시약의 경우 표 4 참조). 플라스크의 내용물을 15mL 튜브로 정량적으로 옮깁니다. 소량(20μL)의 세포 현탁액을 1.5mL 튜브에 넣고 수동 또는 자동 혈구계로 세포를 계수합니다. 튜브를 원심분리하고( 표 4의 매개변수) 대부분의 상층액을 제거하고, 소량의 나머지 액체에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 그런 다음, 세포 밀도가 새 배지의 필요한 부피를 파종하거나 다시 계산하기에 적합한 경우 사전 원심분리 부피( 표 3의 부피)를 얻기 위해 충분한 새 배지를 추가합니다.참고: 멜라닌 세포와 같은 일부 세포는 원심분리에 매우 민감하므로 짧은 시간 내에 다시 원심분리할 필요가 없습니다. 실험(피부 세포의 2D/3D 단층 또는 다중 배양)에 필요한 밀도(세포/mL, 표 5의 세포 밀도)의 세포 현탁액을 준비합니다.참고: 세포를 추가로 배양해야 하는 경우 5,000-8,000 cells/mL를 새 플라스크에 넣고 새 배지를 추가합니다( 표 3의 부피). 비부착 세포의 현탁액 얻기배양 플라스크에서 세포 현탁액이 있는 배지를 제거하고 15mL 튜브에 정량적으로 옮깁니다. 소량(20 μL)의 세포 현탁액을 새 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 수동 또는 자동 혈구계로 세포를 세십시오. 튜브를 원심분리하고( 표 4의 매개변수) 대부분의 상층액을 제거하고, 소량의 나머지 액체에 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포 밀도가 새 배지의 필요한 부피를 파종하거나 다시 계산하기에 적합한 경우 새 배지를 추가하여 사전 원심분리 부피( 표 3에 표시됨)를 얻습니다. 실험(피부 세포의 2D/3D 단일 또는 다중 배양)에 필요한 밀도( 표 5에 제안된 mL당 세포)의 세포 현탁액을 준비합니다.참고: 세포를 추가로 배양하려면 5,000-8,000 cells/mL를 새 플라스크에 넣고 새 배지를 추가하십시오.      25cm 배양용 플라스크2 개 75cm 배양용 플라스크2 개 배양 배지 [mL] 4–5 8–12 PBS [mL] 5 10 트립신–EDTA [mL] 0.5–1 1–2 중화제[mL] 1–2 2–4 표 3: 세포 현탁액의 배양 및 준비 중에 사용된 시약의 부피. 피부 세포의 단일 배양 트립신 트립신 비활성화제 원심 분리 2D 단일 배양을 위한 미디엄 타입 각질형성세포 0.25% 트립신 중화제 사용 300 x g, 5분, RT 각질 세포 성장 배지 2 섬유아세포(Fibroblasts) 0.25% 매체 포함 300 x g, 5분, RT DMEM, 10% FBS 멜라닌 세포 0.025% 트립신 중화제 사용 300 x g, 3분, RT Medium 254, PMA-Free 인간 멜라닌 세포 성장 보충제-2 비만 세포 필요 없음 필요 없음 300 x g, 3분, RT IMDM, 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 226 μM α-모노티오글리세롤 표 4: 트립신화, 원심분리 파라미터 및 배지 유형은 세포 유형에 따라 다릅니다. 모델 유형 세포 밀도 [cell/mL] 2차원 단층 섬유아세포(Fibroblasts) 2 엑스 105 비만 세포 각질형성세포 멜라닌 세포 3차원 구체 (행잉 드롭 방식) 섬유아세포(Fibroblasts) 5 엑스 105 비만 세포 각질형성세포 멜라닌 세포 세포의 혼합 Sphere (리미팅 셀 접착 방법) 섬유아세포(Fibroblasts) 2 엑스 105 비만 세포 각질형성세포 멜라닌 세포 세포의 혼합 해당 섬유아세포(Fibroblasts) 1 엑스 105 비만 세포 1 엑스 104 각질형성세포 8 엑스 105 멜라닌 세포 5 엑스 104 표 5: 다양한 유형의 피부 모델에 대한 세포 파종 밀도. 2. 피부 세포구의 준비 참고: 구를 만들기 위해 행잉 드롭 방법의 사용은 2.1단계(그림 4)에 설명되어 있으며, 셀 접착을 제한하는 데 중점을 둔 접근 방식은 2.2단계(그림 5)에 나와 있습니다. 그럼에도 불구하고 구체는 매우 작고 불안정할 수 있기 때문에 이러한 방법으로 수행되는 활동에는 인내심, 섬세함 및 느린 행동이 필요합니다. 행잉 드롭 방식원하는 구 크기를 얻기 위해 적절한 세포 밀도를 사용하십시오(권장 세포 밀도 5 x 105 cells/mL, 표 5). 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트의 뚜껑에 있는 셀 현탁액 20μL를 피펫팅합니다(그림 4A). 접시/접시를 바닥 부분으로 덮고 부드럽게 뒤집습니다(뚜껑에 매달린 방울이 자동으로 생성됩니다, 그림 4B). 물방울에서 매체가 증발하는 것을 방지하기 위해 플레이트의 페트리 접시/우물을 멸균수/PBS 용액으로 채웁니다. 37 °C에서 48-72 시간 동안 액적을 배양합니다.참고: 중력은 세포를 아래로 끌어내리고 접근 가능한 표면이 없기 때문에 세포가 혈관에 부착되는 것을 방지하고 세포 응집을 촉진합니다. 그러나 일부 세포 유형은 더 긴 배양이 필요할 수 있습니다. 다음 단계를 수행하기 전에 새 플레이트의 웰을 채우십시오(또는 웰에서 물/PBS를 제거한 기존 플레이트 사용) 전체 성장 매체(100μL)를 채웁니다.참고: 다음 단계를 위해 200μL 팁을 가져다가 각 팁 끝의 1/5을 제거하고 사용하기 전에 멸균하십시오. 끝이 절단된 멸균 피펫 팁을 사용하여 cell sphere를 multi-well plate의 well로 옮깁니다. 200μL 팁을 가져다가 각 팁 끝의 1/5을 제거하고 사용하기 전에 멸균합니다(그림 4C).알림: 접시/접시를 뒤집는 동안 액체 흐름이 구를 손상시킬 수 있으므로 이 단계가 어려울 수 있습니다. 추가 실험(예: 화합물 추가, 세포 독성 분석, 등가물에 대한 구 소개)을 수행하기 전에 37°C의 멀티웰 플레이트에서 1일 동안 이송된 구를 배양합니다(그림 4D). 세포 접착을 제한하는 방법세포 파종 전에 U-바닥 플레이트의 웰을 계면활성제 용액(예: Pluronic F-127, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올)으로 덮습니다.21. PBS에서 100μL의 1% 계면활성제 용액을 준비하고 각 웰에 추가합니다. 37 ° C에서 24 시간 동안 용액으로 플레이트를 배양합니다 (그림 5A-C). 필요한 경우 플레이트를 더 오래 보관하되 PBS 버퍼를 더 추가하여 유체 레벨을 유지합니다. 웰당 50 μL의 원하는 세포 밀도로 세포 현탁액을 준비합니다(2 x 105/mL 파종 시 권장 세포 밀도, 표 5). 용해에 의한 세포막 파괴를 방지하기 위해 세포를 파종하기 전에 웰에서 계면활성제 용액을 제거합니다(그림 5D). 세포 용액을 플레이트에 추가하고 세포 응집체에 도달하기 위해 37°C에서 24시간 동안 배양합니다(그림 5E). 약 1-3일 후에 구가 형성되고(그림 5F) 추가 실험에 사용할 준비가 됩니다. 그림 4: 행잉 드롭 방법. (A) 뚜껑에 피펫팅 셀 현탁액을 넣고 뚜껑을 접시의 바닥 부분으로 덮는 단계; (B) 접시를 회전시켜 매달린 방울을 만듭니다. (C) 접시의 바닥 부분에 물/PBS 추가(액체 증발 제한); (D) 세포 구를 만들기 위해 매달린 방울로 접시를 배양합니다. (E) 구가 형성된 액적의 수집 및 multi-well plate에서 이송된 구의 안정화. 피규어는 Biorender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: Limiting Cell Adhesion 방법에 의한 구의 단계별 준비. (A) U-바닥 우물; (B,C) 계면활성제 용액에 의한 세포 부착 제한; (D) 우물에서 용액을 제거하는 단계; (E) 파종 세포; (F) 세포의 응집과 구의 형성. 피규어는 Biorender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. 전체 두께의 피부 등가물 준비 참고: 전체 두께(표피 및 진피) 등가물의 발달은 세 단계로 나눌 수 있습니다(그림 6): 전형적인 진피 세포(예: 섬유아세포 및 비만 세포, 그림 6A)의 발생을 통한 인공 진피층의 준비, 인공 표피에 포함된 세포(주로 각질 형성 세포 및 멜라닌 세포, 그림 6B)의 파종, 그림 6B) 및 가능한 각질화 과정(각질층의 형성, 그림 6C)을 동반한 각질세포의 수직 성장. 전체 두께 스킨 등가물의 제조는 단계 3.1(3.1.1-3.1.10)에 설명되어 있습니다. 덜 진행된 피부 등가물이 필요한 경우(예: 표피형만) 선택된 세포 유형(예: 각질형성세포)을 시판되는 콜라겐 또는 폴리카보네이트 멤브레인에 직접 파종할 수 있으며 각질화 과정을 유도할 수 있는 가능성으로 배양할 수도 있습니다(직접 3.1.9-3.1.10단계로 이동). 그림 6: 인서트에서 전체 두께 스킨 등가물의 단계별 준비. (A) 진피 세포를 가진 가성 진피층의 준비, (B) 표피 세포의 파종, (C) 배지에서 등가물의 추가 배양, (D) 공기-액체 계면 배양은 성층 상피의 형성을 촉진합니다. 피규어는 Biorender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 24-well plate에서 full-thickness skin 등가물 준비물, PBS(10x), 1M NaOH 및 I형 콜라겐 용액이 담긴 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 하이드로겔에 파종할 적절한 수의 진피 세포(예: 섬유아세포 및 비만 세포, 10:1 비율)를 결정합니다. 적절한 수의 진피 세포를 1.5mL 튜브( 표 5의 세포 밀도에 따라 500μL의 섬유아세포 및 500μL의 비만 세포)에 옮기고 세포를 원심분리합니다(300 x g, 3분, RT). 상층액을 제거하고 물 695μL/PBS(10x) 100μL/NaOH 5μL의 혼합물에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.참고: 총 용액 1mL가 충분하지 않은 경우 표 6 을 사용하여 각 시약의 부피를 다시 계산하십시오. 혼합물에 200μL의 콜라겐 용액을 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.알림: 혼합물의 농도가 조밀하므로 주의하십시오. 준비된 혼합물 200μL를 24웰 플레이트의 인서트에 추가합니다. 각질층이 없는 모델의 경우 24웰 플레이트의 각 웰에 500μL를 추가합니다. 플레이트를 실온(RT)에서 10분 동안 배양한 다음 인큐베이터로 30분 동안 옮깁니다.알림: 다른 조치를 취하기 전에 하이드로겔이 중합되었는지 확인하십시오. 하이드로겔 표면에 세포 파종을 하기 전에 PBS 완충액(500μL/웰)으로 헹굽니다. 하이드로겔 위에 파종할 표피 세포(예: 각질 세포 및 멜라닌 세포, 15:1 비율)의 적절한 수를 결정합니다. 10% FBS가 보충된 DMEM 배지 500μL에 세포 혼합물을 준비하고(각질세포 250μL 및 멜라닌세포 250μL 추가, 세포 밀도는 표 4에 언급됨) 웰에 부드럽게 첨가합니다.참고: 경우에 따라 먼저 멜라닌 세포를 파종하고 하이드로겔에 잘 퍼지도록 하고 추가 24시간 후에 배지를 제거하고 각질 세포를 파종하는 것이 좋습니다. 이 경우 250μL의 셀 현탁액과 250μL의 배지를 추가합니다. 세포 성장 속도에 따라 37°C에서 2-5일 동안 플레이트를 배양하고 48시간마다 배지 교환(FBS 농도가 10%에서 최대 1%로 감소)하고 광학 현미경에서 세포 모니터링을 수행합니다. 하이드로겔 위에 각질형성 단층을 얻은 후 각질화 과정을 유도하려면 칼슘 이온과 L-아스코르브산이 추가로 보충된 FBS-free 배지를 추가로 2-7주 동안 사용합니다(1.5μM CaCl2 및 50μg/mL L-아스코르브산 농도).참고: 배양 시간은 사용된 각질세포와 분화 속도에 따라 다릅니다. 시약 시약의 부피를 계산하는 방정식 계산 예시 (최종 부피 = V총 1mL) I형 콜라겐 용액 (C콜라겐 = 10mg/mL) 0.2mL = 200μL PBS(10개) 0.1mL = 100μL 1개 M NaOH 0.005mL = 5μL 멸균 H2O 0.695mL = 695μL 표 6: 2mg/mL 콜라겐 유형 I 하이드로겔 제제에 필요한 시약 부피 계산. 4. 세포 염색 방법에 의한 3D 피부 모델의 세포 유형 식별 참고: 개발된 피부 모델이 예상되는 세포로 구성되어 있는지 확인하려면 세포 염색을 수행하는 것이 좋습니다. 이는 주어진 모델(22)에 대해 임의의 표적 실험을 수행할 수 있기 전에 중요한 단계이다. 3D 피부 모델의 경우, 주어진 모델을 파라핀에 삽입하고 세포 염색 전에 마이크로톰에 인공 조직을 절단한 현미경 슬라이드를 준비해야 합니다(단계 4.1). 그림 7: 3D 피부 모델 임베딩, 세포 염색 및 현미경 관찰의 기본 단계. 피규어는 Biorender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3D 스킨 모델 임베딩PBS에 해당하는 피부를 RT에서 5분 동안 두 번 세척하고 PBS(30분, RT)에 3.7% 파라포름알데히드 용액을 사용하여 고정합니다. PBS로 세탁 단계를 반복합니다. 매립하기 전에 50%(15분), 70%(15분), 96%(2x, 30분) 및 99.8%(2x, 30분)의 농도를 높인 에탄올 용액으로 배양하여 피부를 탈수합니다. 고정 피부와 탈수 피부에 해당하는 것을 파라핀으로 채워진 틀에 넣으십시오.알림: 등가물을 적절한 방향으로 놓으십시오. 카세트로 금형을 덮고 그 위에 파라핀을 더 추가합니다. RT에서 최대 30분 동안 굳히십시오. 파라핀이 함유된 피부를 -80°C에서 최소 1시간 동안 동결합니다. 마이크로톰을 켜고 파라핀이 내장된 피부에 해당하는 제품을 삽입한 다음 5μm 조각을 자릅니다. 절단된 인공 조직 조각을 현미경 슬라이드에 놓고 37°C에서 8시간 이상 건조시킵니다. 슬라이드를 크실렌(2회, 10분)에 담그고 에탄올 농도 99.8%(5분), 96%(5분), 70%(5분) 및 50%(5분)로 슬라이드를 재수화합니다. 에탄올 용액에서 슬라이드를 제거하고 물로 두 번 헹굽니다(5분).참고: 전통적인 세포 염색은 특정 염료(Hematoxylin, Eosin23)를 적용하거나 바이오마커(섬유아세포의 경우 콜라겐 1A2, 각질형성세포의 경우 사이토케라틴 14, 멜라닌세포의 경우 멜라닌 A 또는 티로시나아제24 포함)를 선택적으로 표적으로 하는 항체를 사용하여 수행됩니다. 일상적인 헤마톡실린 및 에오신 염색은 여러 회사에서 준비한 프로토콜에 따라 수행할 수 있습니다(단계 4.2). 반면에, 면역형광 또는 면역조직화학적 염색이 필요한 경우, 절차가 다르고 훨씬 더 오래 걸립니다(단계 4.3 및 4.4). 비특이적 반응을 피하려면 다른 종에서 생성된 1차 항체를 사용하고 그 다음으로 전용 2차 항체를 사용하십시오. 3D 피부 모델의 Hematoxylin 및 eosin 염색RT에서 3분 동안 헤마톡실린 용액에 미세한 슬라이드를 염색합니다. 산성화된 알코올 용액에 슬라이드를 1분 동안 세척합니다.알림: 2%-35% 염산 38mL와 98% 에틸알코올 98mL를 혼합하여 산성화된 알코올 용액을 준비합니다. 다음으로, 0.1% 중탄산나트륨 용액으로 슬라이드를 세척하여 눈에 잘 띄고 섬세한 청자색을 얻습니다.참고: 0.1% 중탄산나트륨 용액을 얻으려면 중탄산나트륨 100mg을 초순수 100mL에 녹입니다. 슬라이드를 95% 에탄올로 1분 동안 세척합니다. 미세한 슬라이드를 에오신 용액에 넣고 RT에서 1분 동안 염색합니다. 슬라이드를 95% 에탄올로 1분 동안 세척하고 99.8% 에탄올로 2분 동안 세척합니다. 슬라이드를 크실렌으로 각각 2분씩 두 번씩 세척합니다. 발삼에 장착하고 슬라이드 상단에 커버 슬립을 놓습니다. 샘플은 현미경 관찰을 위해 준비되었습니다. 3D 피부 모델의 면역형광 염색PBS로 슬라이드를 헹굽니다(5분). 차단 용액(3% Triton X-0.1 및 0.1% Tween 20을 첨가한 PBS 완충액에 0.1% 소 혈청 알부민[BSA] 또는 무지방 우유)을 준비하고 RT에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. PBS 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다(5분). PBS 완충액에 1차 항체를 희석하고(생산자의 권장 사항, 표 7에 따름) 슬라이드를 RT에서 1-2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다(5분). PBS 완충액에 2차 항체를 희석하고(생산자의 권장 사항, 표 7에 따름) RT에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. PBS로 슬라이드를 두 번 세척합니다(5분). 핵 염색을 위한 염료 용액을 준비하고(예: Hoechst 33342 또는 DAPI, 표 7) RT에서 최대 15분 동안 슬라이드를 배양합니다. PBS로 슬라이드를 세척합니다(5분). 발삼에 장착하고 커버슬립으로 절편을 덮고 형광 현미경을 사용하여 세포 염색의 효과를 시각화합니다. 3D 피부 모델의 면역조직화학 염색4.3.1-4.3.5단계를 수행합니다. 또한, 2차 항체가 접합되는 효소에 적합한 완충액을 사용하여 세척 단계를 수행합니다. 2차 항체를 접합 효소에 적합한 완충액에 희석하고(생산자의 권장 사항에 따라) RT에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. PBS로 슬라이드를 두 번 세척합니다(5분). 사용된 효소에 적합한 기질의 용액을 준비하고 생산자의 권장 사항에 따라 슬라이드를 배양합니다. 버퍼로 슬라이드를 세척하고(5분) 발삼에 장착합니다. 명시야 현미경을 사용하여 세포 염색의 효과를 시각화합니다. 세포 유형/세포 오가노이드 검출 염색제 희석 / 농축 비만 세포 아비딘−설포로다민 101 1μg/mL 섬유아세포(Fibroblasts) 토끼에서 생산된 Col1A2 항체 1:50 FITC와 결합된 염소 항토끼 2차 항체 1:250 각질형성세포 마우스에서 생성된 Cytokeratin 14 항체 1:50 FITC와 결합된 염소 항 마우스 2차 항체 1:250 멜라닌 세포 마우스에서 생성된 Melan-A 항체 1:50 FITC와 결합된 염소 항 마우스 2차 항체 1:250 핵 회흐스트 33342 1μg/mL 다피 1μg/mL 표 7: 세포 염색에 사용되는 시약의 농도 및 희석.