Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Adrianna Maria Piasek; Iryna Levkovych; Paulina Musolf; Hanna Chmielewska; Aneta &#346;cie&#380;y&#324;ska; Anna Sobiepanek

doi:10.3791/65773

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengenharia

بناء نماذج الجلد للعديد من التطبيقات - من الزراعة الأحادية ثنائية الأبعاد (2D) إلى الثقافات المتعددة ثلاثية الأبعاد (3D)

Published: October 20, 2023

doi:

10.3791/65773

Adrianna Maria Piasek*¹, Iryna Levkovych*¹, Paulina Musolf¹, Hanna Chmielewska¹, Aneta Ścieżyńska², Anna Sobiepanek¹

¹Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology, Faculty of Chemistry,Warsaw University of Technology, ²Department of Histology and Embryology,Medical University of Warsaw

Summary

هنا ، نقدم إجراءات غير مكلفة وبسيطة لتقديم نماذج الجلد 3D المختلفة للبحث الروتيني في مختبر زراعة الخلايا. يمكن للباحثين إنشاء نماذج مصممة خصيصا لاحتياجاتهم دون الاعتماد على النماذج المتاحة تجاريا.

Abstract

نظرا للبنية المعقدة والوظائف المهمة للجلد ، فهو نموذج بحثي مثير للاهتمام للصناعات التجميلية والصيدلانية والطبية. في الاتحاد الأوروبي ، كان هناك حظر تام على اختبار مستحضرات التجميل ومكوناتها على. في حالة الطب والمستحضرات الصيدلانية ، فإن هذا الاحتمال محدود باستمرار. وفقا لمبدأ 3Rs ، أصبح من الشائع أكثر فأكثر اختبار المركبات الفردية وكذلك التركيبات الكاملة على النماذج التي تم إنشاؤها بشكل مصطنع. أرخص والأكثر استخداما هي نماذج 2D ، والتي تتكون من خلية أحادية الطبقة ولكنها لا تعكس التفاعلات الحقيقية بين الخلايا في الأنسجة. على الرغم من أن نماذج 3D المتاحة تجاريا توفر تمثيلا أفضل للأنسجة ، إلا أنها لا تستخدم على نطاق واسع. هذا لأنها باهظة الثمن ، ووقت الانتظار طويل جدا ، وغالبا ما تقتصر النماذج المتاحة على تلك المستخدمة عادة فقط.

من أجل نقل البحوث التي أجريت إلى مستوى أعلى، قمنا بتحسين إجراءات مختلف الاستعدادات نموذج الجلد 3D. الإجراءات الموصوفة رخيصة وسهلة التحضير حيث يمكن تطبيقها في العديد من المختبرات ومن قبل الباحثين ذوي الخبرات المختلفة في زراعة الخلايا.

Introduction

الجلد عبارة عن بنية مستمرة مع تفاعلات متعددة الخلايا تكشف عن الأداء السليم والتوازن لهذا العضو المعقد. وهي مبنية من طبقات مختلفة شكليا: الطبقة الداخلية – الأدمة ، والطبقة الخارجية – البشرة. في الجزء العلوي من البشرة ، نميز بالإضافة إلى ذلك الطبقة القرنية (التي تتكون من خلايا ميتة مسطحة – الخلايا القرنية) ، والتي توفر أكبر حماية ضد البيئة الخارجية. بعض من أهم الوظائف السلبية والنشطة للجلد هي حماية الجسم ضد العوامل الخارجية ، والمشاركة في العمليات المناعية ، والإفراز ، والارتشاف ، والتنظيم الحراري ، والاستشعار¹^،²^،³. لأنه يعتبر واحدا من أكبر الأعضاء في الجسم ، فمن المستحيل تجنب ملامسة مسببات الأمراض المختلفة ، والمواد المثيرة للحساسية ، والمواد الكيميائية ، وكذلك الأشعة فوق البنفسجية (UV). وبالتالي ، فهي منظمة مع العديد من أنواع الخلايا ذات الوظائف المحددة. الأنواع الرئيسية من الخلايا الموجودة في البشرة هي الخلايا الكيراتينية (ما يقرب من 90 ٪ من جميع الخلايا ، مع وظائف هيكلية ومناعية في الأجزاء العميقة من البشرة ، ولكنها تخضع لاحقا لعملية التقرن للتحول إلى الخلايا القرنية في الطبقة العليا من البشرة) ، والخلايا الصباغية (فقط 3 ٪ -7 ٪ من خلايا البشرة ، والتي تنتج الميلانين الصباغ الواقي من الأشعة فوق البنفسجية) وخلايا لانجرهانز (من الجهاز المناعي). في حالة الأدمة ، الخلايا الرئيسية هي الخلايا الليفية (إنتاج عوامل النمو والبروتينات) ، والخلايا المتغصنة ، والخلايا البدينة (كلا النوعين من خلايا الجهاز المناعي)⁴^،⁵^،⁶. علاوة على ذلك ، تم تجهيز الجلد بالعديد من البروتينات خارج الخلية (مثل الكولاجين من النوع الأول والرابع ، والفبرونيكتين ، واللامينين. الشكل 1) وألياف البروتين (الكولاجين والإيلاستين) ، والتي تضمن البنية المحددة للجلد ولكنها تشجع أيضا على ربط الخلايا ، والتصاق الخلايا ، والتفاعلات الأخرى⁷.

الشكل 1: رسم تخطيطي يوضح بنية الجلد. تميز بنية الجلد بأربعة أنواع أساسية من الخلايا تحدث في طبقاتها الفردية والبروتينات المميزة للمصفوفة خارج الخلية. تم إنشاء هذا الرقم باستخدام MS PowerPoint. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تعد سلامة مستحضرات التجميل والمنتجات الصيدلانية قضية مهمة للغاية ، وحماية صحة المستهلكين والمرضى هي أولوية⁸. حتى وقت قريب ، كان من المفترض أن يتم ضمانه من خلال العديد من الاختبارات ، بما في ذلك الدراسات التي أجريت على. لسوء الحظ ، غالبا ما تتطلب هذه استخدام طرق جذرية ، مما يسبب الألم والمعاناة في المستخدمة لأغراض البحث (في كثير من الأحيان الفئران والجرذان والخنازير). في عام 1959 ، تم تقديم مبادئ التقنية التجريبية الإنسانية (مبدأ 3Rs): (1 – الاستبدال) استبدال في البحث بنماذج في المختبر أو في silico أو خارج الجسم الحي ، (2 – تخفيض) تقليل عدد المستخدمة في البحث ، و (3 – صقل) تحسين رفاهية التي لا تزال مطلوبة للبحث وفي نفس الوقت تحسين الأساليب البديلة المطورة⁹. علاوة على ذلك ، في الاتحاد الأوروبي (EU) ، ينظم القانون اختبار مستحضرات التجميل على. اعتبارا من 11 سبتمبر 2004 ، دخل الحظر المفروض على مستحضرات التجميل التي تم اختبارها على حيز التنفيذ. في 11 مارس 2009 ، حظر الاتحاد الأوروبي اختبار مكونات مستحضرات التجميل على. لم يسمح ببيع مستحضرات التجميل المصنوعة من مكونات تم اختبارها حديثا على ؛ ومع ذلك ، فإن اختبار المنتجات على لقضايا صحة الإنسان المعقدة مثل سمية الجرعة المتكررة ، والسمية الإنجابية ، والحركية السمية لا يزال مقبولا. بدءا من 11 مارس 2013 ، في الاتحاد الأوروبي ، من غير القانوني بيع مستحضرات التجميل حيث تم اختبار المنتج النهائي أو مكوناته على¹⁰. لذلك ، حاليا ، في مستحضرات التجميل ، يتم إجراء البحوث على ثلاثة مستويات: في المختبر (الخلايا) ، خارج الجسم الحي (الأنسجة الحقيقية) ، وفي الجسم الحي (المتطوعين)¹¹. في حالة المستحضرات الصيدلانية ، تظل الحاجة إلى إجراء اختبارات على قائمة. ومع ذلك ، يتم تخفيضه بشكل كبير والتحكم الصارم¹².

كطرق بديلة للاختبار على وللتقييم الأولي لفعالية عنصر نشط جديد ، يتم استخدام مزارع خلايا الجلد في المختبر . يسمح عزل أنواع مختلفة من خلايا الجلد وزراعتها في ظروف معملية معقمة بتقييم سلامة وسمية المواد الفعالة. خطوط خلايا الجلد هي أيضا نماذج معترف بها على نطاق واسع للبحث حيث يتم بيع الخلايا من قبل شركات معتمدة ويمكن أن تكون النتائج قابلة للمقارنة في مختبرات مختلفة. وعادة ما يتم إجراء هذه الاختبارات على نماذج 2D بسيطة من أحاديات خلايا الجلد البشري. بعض النماذج الأكثر تقدما هي ثقافاتها المشتركة (مثل الخلايا الكيراتينية ذات الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية ذات الخلايا الصباغية) ، بالإضافة إلى النماذج ثلاثية الأبعاد ، بما في ذلك الثقافات الخالية من السقالات (الكرات) ومكافئات الجلد القائمة على السقالات للبشرة أو الأدمة أو حتى البدائل كاملة السماكة للجلد¹³. ومن الجدير بالذكر أنه بصرف النظر عن النوع الأخير (مكافئات الجلد) ، فإن الباقي غير متوفر تجاريا ، وإذا لزم الأمر ، يجب على العالم إعدادها بمفرده.

على الرغم من صيانة الكثير من هذه النماذج وبيعها بشكل روتيني في الوقت الحاضر (الجدول 1) ، إلا أن هناك حاجة باستمرار إلى نماذج إضافية للتحقق من صحة معظم النتائج. وبالتالي ، يجب أن تعيد النماذج المصممة حديثا إنشاء التفاعلات الحقيقية التي تحدث في جسم الإنسان بشكل أفضل. عند استخدام مزيج من الخلايا من أنواع مختلفة لتشكيل مثل هذه النماذج ، يمكن تحقيق استنساخ الجانب متعدد الخلايا من الأنسجة في الجسم الحي . نتيجة لذلك ، يتم تطوير ثقافة النمط العضوي (الشكل 2).

	اسم	وصف
البشرة العادية	إبيسكين	البشرة البشرية المعاد بناؤها – الخلايا الكيراتينية على غشاء الكولاجين
	SkinEthic RHE	البشرة البشرية المعاد بناؤها – الخلايا الكيراتينية على غشاء البولي
	سكيندإيثيك آر إي-إل سي	خلايا لانجرهانز النموذجية للبشرة البشرية – الخلايا الكيراتينية وخلايا لانجرهانز على غشاء من البولي كربونات
	SkinEthic RHPE	البشرة المصطبغة البشرية المعاد بناؤها – الخلايا الكيراتينية والخلايا الصباغية على غشاء البولي كربونات
	تي سكين	نموذج الجلد البشري كامل السماكة المعاد بناؤه – الخلايا الكيراتينية على طبقة من الخلايا الليفية ، والتي نمت على غشاء من البولي كربونات
	نموذج الجلد فينيون FT	الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية في هيدروجيل
الجلد مع مرض	سرطان الجلد FT نموذج الجلد	الخلايا الكيراتينية الطبيعية المشتقة من الإنسان والخلايا الليفية مع خط خلايا سرطان الجلد الخبيث البشري A375
	نموذج أنسجة الصدفية	الخلايا الكيراتينية البشرية الطبيعية والخلايا الليفية

الجدول 1: مكافئات الجلد التجارية الأكثر شيوعا للدراسات المختلفة.

الشكل 2: تعقيد النماذج المختلفة في المختبر . العلاقة بين تعقيد النماذج المختلفة في المختبر لإعادة إنشاء كائن حي والتفاعلات الحقيقية التي تحدث مباشرة في جسم الإنسان. تم تعديل الشكل من مجموعة “علم الأحياء الدقيقة وزراعة الخلايا” من Servier Medical Art بواسطة Servier (https://smart.servier.com/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أحد أهم قيود المكافئات التجارية هو توفر نماذج بحث عامة جدا فقط مع أنواع قليلة من الخلايا (عادة 1-2 ، نادرا 3). ومع ذلك ، هناك العديد من الخلايا الموجودة في الجلد ، ويمكن أن يضمن تفاعلها مع بعضها البعض تحملا أفضل أو أسوأ للمكونات المختلفة¹⁴. يمكن أن يؤدي نقص بعض المكونات المناعية إلى تقليل قيمته في عدة أنواع من الأبحاث ، بما في ذلك العلاج المناعي. هذه مشكلة خطيرة لأن سرطان الجلد هو سرطان الجلد الذي يهدد الحياة بسبب الظهور المبكر للورم الخبيث والمقاومة المتكررة للعلاج المطبق¹⁵. لتحسين نموذج الجلد الاصطناعي ، يحاول الباحثون إنشاء ثقافة مشتركة للخلايا المناعية مع خطوط الخلايا والمواد العضوية¹⁶ وهذا يعتبر تحسنا كبيرا في النماذج المدروسة. على سبيل المثال ، تشارك الخلايا البدينة في العديد من العمليات الفسيولوجية (التئام الجروح ، إعادة تشكيل الأنسجة) والمرضية (الالتهاب ، تولد الأوعية ، وتطور الورم) في الجلد¹⁷. وبالتالي ، فإن حدوثها في النموذج يمكن أن يغير بشكل كبير استجابة النموذج للمركب المدروس. أخيرا ، لا يزال الكثير من المعلومات المتعلقة بالجلد مفقودا ، والتي لا يمكن اكتشافها إلا من خلال إجراء البحوث الأساسية. هذا هو السبب في أن إنشاء وصقل نماذج مختلفة من الجلد الاصطناعي (الجدول 2) هو مسعى مهم. تقدم هذه المقالة العديد من الإجراءات لإنشاء نماذج بشرة متقدمة ، بما في ذلك المجالات وما يعادلها من الجلد.

*نموذج الجلد في المختبر*	محاولة إعادة إنشاء التفاعلات التي تحدث في الأنسجة	أمثلة على الخلايا المستخدمة
2D أو 3D ثقافة الخلية	بشرة	الخلايا الكيراتينية
		الخلايا الصباغية
		الخلايا الكيراتينية + الخلايا الصباغية
	الادمه	الخلايا الليفية
		الخلايا البدينة
		الخلايا الليفية + الخلايا البدينة
	جلد	الخلايا الكيراتينية + الخلايا الليفية
		الخلايا الكيراتينية + الخلايا البدينة
		الخلايا الصباغية + الخلايا الليفية
		الخلايا الصباغية + الخلايا البدينة
		الخلايا الكيراتينية + الخلايا الليفية + الخلايا الصباغية
		الخلايا الكيراتينية + الخلايا الليفية + الخلايا البدينة

الجدول 2: أمثلة على خليط نوع الخلية لإعادة إنشاء أنسجة الجلد في ثقافة 2D و 3D.

Protocol

أجريت الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية لإعلان هلسنكي ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات بجامعة وارسو الطبية (KB / 7/2022). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأشخاص المشاركين في الدراسة. ملاحظة: يمكن تنفيذ الإجراءات الموصوفة لإعداد نموذج الجلد المتقدم باستخدام إما خلايا الجلد الأولية وخطوط الخلايا المتاحة تجاريا أو مع الخلايا الأولية المعزولة عن المرضى. يتم تزويد الخلايا التجارية بالوثائق ذات الصلة ، ولا يتطلب استخدامها في البحث لمعظم البلدان أي موافقة إضافية. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض البلدان ، فهو إلزامي ، وبالتالي ، يجب التحقق منه مع لوائح لجنة الأخلاق المحلية. إذا كان يجب استخدام الخلايا الأولية المعزولة عن المرضى في البحث ، أولا ، يجب أن تتم الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية ، ويجب إجراؤها وفقا لإرشاداتها الصارمة. علاوة على ذلك ، يجب جمع موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين بأنسجة الجلد. لم يكن عزل خلايا الجلد الأولية موضوع هذه المقالة ، ولكن يمكن العثور على إجراءات عزل مثالية في Kosten et al. (الخلايا الكيراتينية)18 ، Ścieżyńska et al. (الخلايا الصباغية)19 ، Kröger et al. (الخلايا الليفية والخلايا البدينة)20. معظم خلايا الجلد الطبيعية وخطوط الخلايا لديها مستوى أمان من فئة BSL1. أنها لا تسبب أي تهديدات. ومع ذلك ، فإن معدات المختبرات المستخدمة تحتاج إلى تلبية معايير زراعة الخلايا الحيوانية والبشرية في ظل ظروف خاضعة للرقابة. 1. زراعة خلايا الجلد ملاحظة: يجب إجراء زراعة خلايا الجلد في قوارير مخصصة للخلايا الملتصقة أو المعلقة (حسب نوع الخلية) عند 37 درجة مئوية ومحتوى ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في الحاضنة. تتطلب الأنشطة المتعلقة بزراعتها واستخدامها للبحث ظروفا معقمة ويجب إجراؤها في غرفة رقائقية بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية C (UVC) لمدة 15-30 دقيقة. يتطلب الحصول على معلقات الخلايا ، والتي تستخدم بعد ذلك لإنشاء النماذج ثنائية وثلاثية الأبعاد ، تنفيذ إجراءات اعتمادا على نوع الخلية (للخلايا الملتصقة مثل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية والخلايا الصباغية – الخطوة 1.1 ، للخلايا غير الملتصقة بالخلايا البدينة – الخطوة 1.2) (الشكل 3). بالنسبة لأحجام قارورة الاستزراع المختلفة ، يتم سرد أحجام جميع الكواشف (مثل محلول ملحي متوسط أو مخزن بالفوسفات أو محلول التربسين) المستخدمة في الطرق الموصوفة في الجدول 3. يتم فرز المعلمات التي تعتمد على نوع الخلايا (على سبيل المثال ، تركيز وتكوين الكواشف ، وطريقة الطرد المركزي ، وما إلى ذلك) في الجدول 4. كثافات الخلايا المستخدمة في البذر موضحة في الجدول 5. يتم تضمين جميع هذه الجداول في نهاية هذا القسم. الشكل 3: زراعة الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة. الإجراء العام خطوة بخطوة لزراعة الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة (تتوافق الأرقام مع أوصاف الخطوتين 1.1 و 1.2). تم إنشاء الرقم باستخدام MS PowerPoint. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الحصول على تعليق للخلايا الملتصقةقم بإزالة الوسيط من قارورة الثقافة. اغسل الخلايا برفق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، الجدول 3). أضف محلول التربسين في حمض الخليك رباعي ثنائي الأمين الإيثيلين (محلول التربسين-EDTA ، الجدول 3). احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية والتحكم في انفصال الخلايا عن السطح على المجهر الضوئي. تعليق الخلايا المنفصلة في كمية مزدوجة على الأقل من وسط النمو الكامل أو معادل التربسين لإلغاء تنشيط التربسين (2: 1) (بالنسبة للأحجام ، راجع الجدول 3 ، وبالنسبة للكواشف ، راجع الجدول 4). انقل محتوى القارورة كميا إلى الأنبوب سعة 15 مل. خذ حجما صغيرا (20 ميكرولتر) من تعليق الخلية في أنبوب سعة 1.5 مل وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم اليدوي أو التلقائي. جهاز طرد مركزي الأنبوب (المعلمات في الجدول 4) ، وإزالة معظم المواد الطافية ، وإعادة تعليق بيليه الخلية في كمية صغيرة من السائل المتبقي. بعد ذلك ، أضف ما يكفي من الوسط الطازج للحصول على حجم ما قبل الطرد المركزي (الحجم في الجدول 3) إذا كانت كثافة الخلية مناسبة للبذر أو إعادة حساب الحجم المطلوب للوسط الجديد.ملاحظة: بعض الخلايا ، مثل الخلايا الصباغية ، حساسة للغاية للطرد المركزي ، وبالتالي تجنب الحاجة إلى الطرد المركزي مرة أخرى في مسافة زمنية قصيرة. تحضير معلق الخلية للكثافة المطلوبة (الخلايا / مل ، كثافة الخلية في الجدول 5) للتجربة (2D / 3D أحادي أو متعدد الثقافات لخلايا الجلد).ملاحظة: إذا كان سيتم زراعة الخلايا بشكل أكبر ، فقم بإرجاع 5000-8000 خلية / مل إلى دورق جديد وإضافة وسط جديد (الحجم في الجدول 3). الحصول على تعليق للخلايا غير الملتصقةقم بإزالة الوسط باستخدام تعليق الخلية من دورق الثقافة وانقله كميا إلى أنبوب 15 mL. خذ حجما صغيرا (20 ميكرولتر) من معلق الخلية في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم اليدوي أو التلقائي. جهاز طرد مركزي الأنبوب (المعلمات في الجدول 4) ، وإزالة معظم المواد الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من السائل المتبقي. بعد ذلك ، أضف وسيطا جديدا للحصول على حجم ما قبل الطرد المركزي (كما هو موضح في الجدول 3) إذا كانت كثافة الخلية مناسبة للبذور أو إعادة حساب الحجم المطلوب للوسط الجديد. تحضير معلق الخلية للكثافة المطلوبة (خلايا لكل مل ، كما هو مقترح في الجدول 5) للتجربة (2D / 3D أحادي أو متعدد الثقافات لخلايا الجلد).ملاحظة: إذا كان سيتم زراعة الخلايا بشكل أكبر ، فقم بإعادة 5000-8000 خلية / مل إلى دورق جديد وإضافة وسط جديد. 25 سم2 قارورة ثقافة 75 سم2 قارورة ثقافة وسط الثقافة [مل] 4–5 8–12 برنامج تلفزيوني [مل] 5 10 التربسين – EDTA [مل] 0.5–1 1–2 وسيط التحييد [مل] 1–2 2–4 الجدول 3: أحجام الكواشف المستخدمة أثناء زراعة وإعداد معلقات الخلايا. الزراعة الأحادية لخلايا الجلد التربسين معطل التربسين الطرد المركزي نوع متوسط للزراعة الأحادية 2D الخلايا الكيراتينية 0.25% مع التربسين محايد 300 × جم ، 5 دقائق ، RT متوسط نمو الخلايا الكيراتينية 2 الخلايا الليفية 0.25% مع المتوسطة 300 × جم ، 5 دقائق ، RT DMEM ، 10٪ FBS الخلايا الصباغية 0.025% مع التربسين محايد 300 × جم ، 3 دقائق ، RT متوسط 254 ، مكمل نمو الخلايا الصباغية البشرية الخالية من PMA-2 الخلايا البدينة غير مطلوب غير مطلوب 300 × جم ، 3 دقائق ، RT IMDM, 10٪ FBS, 1٪ أحماض أمينية غير أساسية, 226 ميكرومتر α-مونوثيوجلسرين الجدول 4: تعتمد التربسينات ومعلمات الطرد المركزي ونوع الوسائط على نوع الخلية. نوع النموذج كثافة الخلية [خلية / مل] 2D أحادي الطبقة الخلايا الليفية 2 س 105 الخلايا البدينة الخلايا الكيراتينية الخلايا الصباغية 3D الكرة (طريقة الإسقاط المعلق) الخلايا الليفية 5 س 105 الخلايا البدينة الخلايا الكيراتينية الخلايا الصباغية مزيج من الخلايا المجال (طريقة الحد من التصاق الخلية) الخلايا الليفية 2 س 105 الخلايا البدينة الخلايا الكيراتينية الخلايا الصباغية مزيج من الخلايا المكافئ الخلايا الليفية 1 س 105 الخلايا البدينة 1 س 104 الخلايا الكيراتينية 8 س 105 الخلايا الصباغية 5 س 104 الجدول 5: كثافة بذر الخلايا لأنواع مختلفة من نماذج الجلد. 2. تحضير كرات خلايا الجلد ملاحظة: لإنشاء كرات ، يتم وصف استخدام طريقة الإسقاط المعلق في الخطوة 2.1 (الشكل 4) ، بينما يظهر النهج الذي يركز على الحد من التصاق الخلايا في الخطوة 2.2 (الشكل 5). ومع ذلك ، نظرا لأن المجالات صغيرة جدا ويمكن أن تكون غير مستقرة ، فإن الأنشطة التي يتم تنفيذها بموجب هذه الأساليب تتطلب الصبر والحساسية والإجراءات البطيئة. طريقة شنق إسقاطاستخدم كثافة خلية مناسبة لتحقيق حجم الكرة المطلوب (كثافة الخلية الموصى بها 5 × 105 خلايا / مل ، الجدول 5). ماصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية على غطاء طبق بتري أو لوحة متعددة الآبار (الشكل 4 أ). قم بتغطية الطبق / الطبق بالجزء السفلي واقلبه برفق (سيتم إنشاء قطرات معلقة تلقائيا على الأغطية ، الشكل 4 ب). املأ طبق / آبار بتري في الطبق بمحلول معقم / PBS لتجنب تبخر الوسط من القطرات. احتضان القطرات لمدة 48-72 ساعة عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: تسحب الجاذبية الخلايا لأسفل ، ويمنع عدم وجود سطح يمكن الوصول إليه ارتباط الخلية بالوعاء ويعزز تراكم الخلايا. ومع ذلك ، قد تتطلب بعض أنواع الخلايا حضانة أطول. قبل تنفيذ الخطوة التالية ، املأ آبار اللوحة الجديدة (أو استخدم اللوحة القديمة بالماء الذي تمت إزالته / PBS من الآبار) بوسط النمو الكامل (100 ميكرولتر).ملاحظة: قبل الخطوة التالية ، خذ 200 ميكرولتر من أطراف ، وقم بإزالة 1/5 من كل طرف طرف ، وقم بتعقيمه قبل الاستخدام. انقل كرات الخلية إلى آبار اللوحة متعددة الآبار باستخدام أطراف ماصة معقمة ذات نهاية مقطوعة. خذ 200 طرف ميكرولتر ، وقم بإزالة 1/5 من كل طرف طرف ، وقم بتعقيمه قبل الاستخدام (الشكل 4C).ملاحظة: قد تكون هذه الخطوة صعبة ، لأن تدفق السائل أثناء تقليب الطبق / اللوحة يمكن أن يتلف الكرات. احتضان الكرات المنقولة لمدة 1 يوم في لوحة متعددة الآبار عند 37 درجة مئوية قبل إجراء أي تجارب أخرى (على سبيل المثال ، إضافة مركب ، مقايسات السمية الخلوية ، مقدمة كروية إلى مكافئات) (الشكل 4 د). طريقة الحد من التصاق الخليةقبل بذر الخلية ، قم بتغطية آبار الصفيحة السفلية U بمحلول خافض للتوتر السطحي (على سبيل المثال ، Pluronic F-127 ، البولي إيثيلين جلايكول ، كحول البولي فينيل)21. تحضير وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الفاعل بالسطح 1٪ في برنامج تلفزيوني في كل بئر. احتضان اللوحة بالمحلول لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية (الشكل 5A-C). قم بتخزين اللوحة لفترة أطول إذا لزم الأمر ولكن حافظ على مستوى السائل عن طريق إضافة المزيد من المخزن المؤقت PBS. تحضير معلق الخلية في كثافة الخلية المطلوبة في 50 ميكرولتر لكل بئر (كثافة الخلية الموصى بها أثناء البذر 2 × 105 / مل ، الجدول 5). قم بإزالة محلول الفاعل بالسطح من الآبار قبل بذر الخلايا لتجنب تعطل غشاء الخلية عن طريق التحلل (الشكل 5 د). أضف محلول الخلية إلى اللوحة واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية للوصول إلى مجاميع الخلايا (الشكل 5E). بعد حوالي 1-3 أيام ، سيتم تشكيل الكرات (الشكل 5F) وتكون جاهزة للاستخدام في أي تجارب أخرى. الشكل 4: طريقة الإسقاط المعلق. (أ) تعليق خلية ماصة على الغطاء وتغطية الغطاء بالجزء السفلي من الطبق ؛ (ب) تدوير الطبق لإنشاء قطرات معلقة ؛ (ج) إضافة الماء / PBS إلى الجزء السفلي من الطبق (الحد من تبخر السائل) ؛ د: حضانة الأطباق بقطرات معلقة لإنشاء كرات خلوية؛ (ه) جمع القطرات ذات الكرات المشكلة وتثبيت الكرات المنقولة في ألواح متعددة الآبار. تم إنشاء الرقم مع Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تحضير الكرات خطوة بخطوة بطريقة التصاق الخلايا المحددة. (أ) بئر قاع U؛ (B,C) الحد من ارتباط الخلية بمحلول خافض للتوتر السطحي؛ (د) إزالة المحلول من الآبار؛ ه: خلايا البذر؛ (و) تجمع الخلايا وتكوين كرة. تم إنشاء الرقم مع Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 3. تحضير مكافئات الجلد كاملة السماكة ملاحظة: يمكن تقسيم تطور مكافئات الجلد كاملة السماكة (البشرة والأدمة) إلى ثلاث خطوات (الشكل 6): تحضير طبقة الأدمة الاصطناعية مع ظهور خلايا جلدية نموذجية (مثل الخلايا الليفية والخلايا البدينة ، الشكل 6 أ) ، بذر الخلايا المدرجة في البشرة الاصطناعية (معظمها الخلايا الكيراتينية والخلايا الصباغية ، الشكل 6 ب) والنمو الرأسي للخلايا الكيراتينية مع عملية التقرن المحتملة (تكوين الطبقة القرنية ، الشكل 6C). يتم وصف تحضير مكافئات الجلد كاملة السماكة في الخطوة 3.1 (3.1.1-3.1.10). إذا كانت هناك حاجة إلى مكافئ جلدي أقل تقدما (على سبيل المثال ، نوع البشرة فقط) ، يمكن زرع نوع الخلية المحدد (مثل الخلايا الكيراتينية) مباشرة على أغشية الكولاجين أو البولي كربونات المتاحة تجاريا وزراعتها أيضا مع إمكانية تحفيز عملية التقرن (انتقل مباشرة إلى الخطوات 3.1.9-3.1.10). الشكل 6: التحضير خطوة بخطوة لمعادلات الجلد كاملة السماكة في الحشوات. (أ) تحضير طبقة الأدمة الزائفة بالخلايا الجلدية، (ب) بذر خلايا البشرة، (ج) زراعة أخرى مكافئة في الوسط، (د) تعزز ثقافة السطح البيني الهوائي والسائل تكوين ظهارة طبقية. تم إنشاء الرقم مع Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تحضير مكافئات الجلد كاملة السماكة في صفيحة من 24 بئراضع الأنابيب بالماء ، PBS (10x) ، 1 M NaOH ، ومحلول الكولاجين من النوع الأول على الثلج. حدد العدد المناسب من الخلايا الجلدية (على سبيل المثال ، الخلايا الليفية والخلايا البدينة ؛ بنسبة 10: 1) ليتم زرعها في الهيدروجيل. نقل عدد مناسب من الخلايا الجلدية إلى أنبوب 1.5 مل (500 ميكرولتر من الخلايا الليفية و 500 ميكرولتر من الخلايا البدينة ، وفقا لكثافات الخلايا في الجدول 5) وأجهزة الطرد المركزي للخلايا (300 × جم ، 3 دقائق ، RT). قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا برفق في خليط 695 ميكرولتر من الماء / 100 ميكرولتر من PBS (10x) / 5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم.ملاحظة: إذا لم يكن 1 مل من المحلول الكلي كافيا ، فاستخدم الجدول 6 لإعادة حساب أحجام كل كاشف. أضف 200 ميكرولتر من محلول الكولاجين إلى الخليط واخلطه برفق عن طريق الماصة.ملاحظة: كن حذرا ، لأن قوام الخليط سيكون كثيفا. أضف 200 ميكرولتر من الخليط المحضر إلى الملحق في لوحة 24 بئرا. بالنسبة للنموذج الذي لا يحتوي على الطبقة القرنية ، أضف 500 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة 24 بئرا. احتضن اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم انقلها إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.ملاحظة: تحقق مما إذا كان الهيدروجيل قد بلمر قبل أي إجراء آخر. قبل بذر الخلية على سطح الهيدروجيل ، اشطفه بمخزن مؤقت PBS (500 ميكرولتر / بئر). حدد العدد المناسب من خلايا البشرة (على سبيل المثال ، الخلايا الكيراتينية والخلايا الصباغية ؛ بنسبة 15: 1) ليتم زرعها فوق الهيدروجيل. تحضير خليط الخلية في 500 ميكرولتر من وسط DMEM المكمل ب 10٪ FBS (أضف 250 ميكرولتر من الخلايا الكيراتينية و 250 ميكرولتر من الخلايا الصباغية ، كثافات الخلايا مذكورة في الجدول 4) وأضفه برفق إلى الآبار.ملاحظة: في بعض الحالات ، من الأفضل أولا زرع الخلايا الصباغية والسماح لها بالانتشار بشكل جيد على الهيدروجيل ، وبعد 24 ساعة إضافية ، قم بإزالة الخلايا الكيراتينية المتوسطة والبذور. في هذه الحالة ، أضف 250 ميكرولتر من معلق الخلية و 250 ميكرولتر من الوسط. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 أيام ، اعتمادا على سرعة نمو الخلايا ، مع تبادل متوسط (مع انخفاض تركيز FBS من 10٪ إلى 1٪) كل 48 ساعة ومراقبة الخلايا على المجهر الضوئي. إذا كان سيتم تحفيز عملية التقرن بعد الحصول على طبقة أحادية من الخلايا الكيراتينية أعلى الهيدروجيل ، فاستخدم الوسط الخالي من FBS المكمل بالإضافة إلى أيونات الكالسيوم وحمض الأسكوربيك لمدة 2-7 أسابيع إضافية (بتركيز 1.5 ميكرومتر CaCl2 و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك).ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على الخلايا الكيراتينية المستخدمة وسرعة تمايزها. الكاشف معادلة حساب حجم الكاشف أمثلة على العمليات الحسابية (للحجم النهائي =V إجمالي 1 مل) محلول الكولاجين من النوع الأول (كولاجين C = 10 مجم / مل) 0.2 مل = 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني (10x) 0.1 مل = 100 ميكرولتر 1 م هيدروكسيد الصوديوم 0.005 مل = 5 ميكرولتر معقمة H2O 0.695 مل = 695 ميكرولتر الجدول 6: حساب أحجام الكاشف المطلوبة لإعداد هيدروجيل الكولاجين من النوع الأول 2 ملغ / مل. 4. تحديد أنواع الخلايا في نموذج الجلد 3D عن طريق طرق تلطيخ الخلايا ملاحظة: للتأكد من أن نموذج الجلد المطور يتكون من الخلايا المتوقعة ، من الجيد إجراء تلطيخ الخلايا. إنها خطوة حاسمة قبل إجراء أي تجارب مستهدفة على نموذجمعين 22. في حالة نماذج الجلد ثلاثية الأبعاد ، من الضروري تضمين نموذج معين في البارافين وإعداد شرائح مجهرية مع قطع الأنسجة الاصطناعية على ميكروتوم (الخطوة 4.1) قبل تلطيخ الخلايا (الشكل 7). الشكل 7: الخطوات الأساسية لتضمين نموذج الجلد 3D ، وتلطيخ الخلايا ، والملاحظات المجهرية. تم إنشاء الرقم مع Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تضمين نماذج الجلد 3Dاغسل ما يعادل الجلد مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT مرتين وإصلاحه باستخدام محلول بارافورمالدهيد 3.7٪ في PBS (30 دقيقة ، RT). كرر خطوة الغسيل مع برنامج تلفزيوني. قبل التضمين ، قم بتجفيف ما يعادل الجلد عن طريق الحضانة بتركيزات متزايدة من محاليل الإيثانول: 50٪ (15 دقيقة) ، 70٪ (15 دقيقة) ، 96٪ (2x ، 30 دقيقة) ، و 99.8٪ (2x ، 30 دقيقة). ضع ما يعادل الجلد الثابت والمجفف في القالب المملوء بالبارافين.ملاحظة: ضع المكافئ في الاتجاه المناسب. غطي القالب بالكاسيت وأضف المزيد من البارافين في الأعلى. اتركه يتماسك لمدة تصل إلى 30 دقيقة في RT. قم بتجميد ما يعادل الجلد المضمن بالبارافين لمدة 1 ساعة على الأقل عند -80 درجة مئوية. قم بتشغيل الميكروتوم ، وأدخل ما يعادل الجلد المضمن بالبارافين ، وقطع شرائح 5 ميكرومتر. ضع شرائح الأنسجة الاصطناعية المقطوعة على الشرائح المجهرية وجففها لمدة 8 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية. اغمر الشرائح في الزيلين (2x ، 10 دقائق) ، ثم أعد ترطيب الشرائح بتركيزات الإيثانول المتناقصة 99.8٪ (5 دقائق) و 96٪ (5 دقائق) و 70٪ (5 دقائق) و 50٪ (5 دقائق). قم بإزالة الشرائح من محلول الإيثانول واشطفها مرتين بالماء (5 دقائق).ملاحظة: يتم إجراء تلطيخ الخلايا التقليدي إما عن طريق تطبيق أصباغ معينة (الهيماتوكسيلين ، Eosin23) أو باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف المؤشرات الحيوية بشكل انتقائي (بما في ذلك الكولاجين 1A2 للخلايا الليفية ، السيتوكيراتين 14 للخلايا الكيراتينية ، الميلان-A أو التيروزيناز للخلايا الصباغية24). يمكن إجراء تلطيخ روتيني للهيماتوكسيلين ويوزين باتباع البروتوكولات التي أعدتها شركات مختلفة (الخطوة 4.2). من ناحية أخرى ، إذا كان التلوين المناعي أو المناعي الكيميائي مطلوبا ، فإن الإجراء مختلف وأطول بكثير (الخطوتان 4.3 و 4.4). لتجنب التفاعلات غير المحددة، استخدم الأجسام المضادة الأولية المنتجة في أنواع مختلفة، ثم الأجسام المضادة الثانوية المخصصة. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين لنماذج الجلد 3Dقم بتلطيخ الشريحة المجهرية في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق في RT. اغسل الشرائح في محلول كحول محمض لمدة 1 دقيقة.ملاحظة: تحضير محلول الكحول المحمض عن طريق خلط 2 مل من 35٪ -38٪ حمض الهيدروكلوريك مع 98 مل من 99.8٪ كحول إيثيلي. بعد ذلك ، اغسل الشريحة في محلول بيكربونات الصوديوم بنسبة 0.1٪ للحصول على لون أزرق بنفسجي مرئي ودقيق.ملاحظة: للحصول على محلول بيكربونات الصوديوم 0.1٪ ، قم بإذابة 100 مجم من بيكربونات الصوديوم في 100 مل من الماء عالي النقاء. اغسل الشرائح بنسبة 95٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة. تلطيخ الشريحة المجهرية في محلول eosin لمدة 1 دقيقة في RT. اغسل الشرائح بإيثانول 95٪ لمدة 1 دقيقة و 99.8٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة. اغسل الشرائح بالزيلين لمدة 2 دقيقة لكل مرتين. جبل في بلسم ووضع غطاء في الجزء العلوي من الشريحة. العينات جاهزة للملاحظات المجهرية. تلطيخ المناعي لنماذج الجلد 3Dشطف الشريحة مع برنامج تلفزيوني (5 دقائق). تحضير محلول الحجب (3٪ ألبومين مصل البقر [BSA] أو الحليب الخالي من الدسم في مخزن مؤقت PBS مع إضافة 0.1٪ Triton X-100 و 0.1٪ Tween 20) واحتضان الشريحة فيه لمدة 1 ساعة في RT. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت PBS (5 دقائق). تمييع الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت PBS (وفقا لتوصيات المنتج ، الجدول 7) واحتضان الشرائح لمدة 1-2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن مؤقت PBS (5 دقائق). تمييع الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت PBS (وفقا لتوصيات المنتج ، الجدول 7) واحتضان الشرائح لمدة 1 ساعة في RT. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني (5 دقائق). قم بإعداد محلول الصبغة لتلطيخ النوى (على سبيل المثال ، Hoechst 33342 أو DAPI ، الجدول 7) واحتضان الشرائح لمدة تصل إلى 15 دقيقة في RT. اغسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني (5 دقائق). قم بتركيب البلسم ، وقم بتغطية القسم بغطاء ، وتصور آثار تلطيخ الخلية باستخدام مجهر الفلورسنت. تلطيخ الكيمياء المناعية لنماذج الجلد 3Dنفذ الخطوات من 4.3.1 إلى 4.3.5. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء خطوة غسيل باستخدام مخزن مؤقت مناسب للإنزيم الذي يقترن به الجسم المضاد الثانوي. تمييع الجسم المضاد الثانوي في مخزن مؤقت مناسب للإنزيم المترافق (وفقا لتوصيات المنتج) واحتضان الشرائح لمدة 1 ساعة في RT. اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني (5 دقائق). تحضير محلول الركيزة المناسبة للإنزيم المستخدم واحتضان الشرائح وفقا لتوصيات المنتج. اغسل الشرائح بمخزن مؤقت (5 دقائق) وقم بتركيبها في البلسم. تصور آثار تلطيخ الخلية باستخدام المجهر مشرق المجال. نوع الخلية / الخلية العضوية المكتشفة عامل تلطيخ التمدد / التركيز الخلايا البدينة أفيدين – سلفورهودامين 101 1 ميكروغرام / مل الخلايا الليفية الجسم المضاد Col1A2 المنتج في الأرانب 1:50 الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب للماعز مترافقة مع FITC 1:250 الخلايا الكيراتينية إنتاج الجسم المضاد Cytokeratin 14 في الماوس 1:50 الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر للماعز المترافق مع FITC 1:250 الخلايا الصباغية إنتاج الجسم المضاد Melan-A في الماوس 1:50 الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر للماعز المترافق مع FITC 1:250 النوي هويشت 33342 1 ميكروغرام / مل دابي 1 ميكروغرام / مل الجدول 7: تركيزات وتخفيفات الكواشف المستخدمة في تلطيخ الخلايا.

Representative Results

قبل البدء في إنشاء نماذج جلدية في المختبر ، يجب اتخاذ قرار بشأن نوع الخلايا التي سيتم استخدامها (خط الخلية الأساسي / الخلوي) واختيار وسيط مناسب لهذه الخلايا. توصي معظم بنوك الخلايا ويمكن أن توفر وسائط لجميع أنواع زراعة الخلايا. في حالة نموذج متعدد الثقافات ، من الضروري اختيار وسيط واحد يناسب جميع أنواع الخلايا الموجودة في الثقافة. تم جمع بعض وسائط الخلايا النموذجية المستخدمة لكل من زراعة خلايا الجلد الأولية وخطوط خلايا الجلد الأكثر شيوعا في الجدول 818،19،20،25،26،27. الوسائط النموذجية المستخدمة في ثقافات الخلايا الأولية باهظة الثمن إلى حد ما ، وتكوينها معقد. من ناحية أخرى ، عادة ما تكون خطوط الخلايا راضية عن الوسائط ذات التركيبة البسيطة. يمكن لبعض أنواع الخلايا (الخلايا الليفية والخلايا البدينة بشكل أساسي) إنتاج وإفراز عوامل تحفز نمو الخلايا الأخرى (مثل الخلايا الكيراتينية والخلايا الصباغية)28,29. إذا تم التخطيط لوجودها في نموذج ، فإن المكملات الإضافية للوسيط ليست ضرورية. نوع الخلية اسم الخلية متوسط مرجع الخلايا الكيراتينية خط HaCaT cel DMEM, 10٪ FBS، 100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين وفقا للبائع الخلايا الكيراتينية البشرية الطبيعية الأولية (NHEK) متوسط نمو الخلايا الكيراتينية 2 (الوسط القاعدي + مزيج الملحق) وفقا للبائع الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية ؛ عادي ، بالغ (HEKa) وسط الخلايا الجلدية القاعدي, 0.4٪ مستخلص الغدة النخامية البقري, 0.5 نانوغرام/مل العامل المفصلي – عامل النمو المحول ألفا, 6 ملليمتر إل-جلوتامين, 100 نانوغرام/مل هيدروكورتيزون هيميسوتشينات, 5 ملغ/مل أر هيدرولينين, 1 مللي إمبلينفرين, 5 ملغ/مل آبو-ترانسفيرين, 100 وحدة / مل بنسلين (إذا لزم الأمر), 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين (إذا لزم الأمر) وفقا للبائع الخلايا الكيراتينية الأولية DMEM / F-12 (3: 1) ، 1٪ Ultroser G ، 1 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، 1 ميكرومتر إيزوبروتيرينول ، 0.1 ميكرومتر أنسولين ، 1 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الكيراتينية ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين 18 الخلايا الصباغية الخلايا الصباغية الأولية متوسط 254 ، مكمل نمو الخلايا الصباغية البشرية الخالية من PMA -2 ، محلول مضاد حيوي 1٪ 19 الخلايا الصباغية الأولية RPMI-1640, 10٪ FBS، 14.7 ميكروغرام/مل محلول الفينول الأحمر، 1٪ إل-جلوتامين، 1٪ بنسلين/ستربتومايسين 27 خط خلية HEMa-LP متوسط 254، 5 ميكروغرام/مل من الأنسولين الريسوسي، 50 ميكروغرام/مل حمض الأسكوربيك، 6 ملليمتر إل-جلوتامين، 1 ميكرومتر إبينفرين، 1.5 ملليمتر كلوريد الكالسيوم، 100 وحدة / مل من البنسلين (إذا لزم الأمر)، 100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين (إذا لزم الأمر) وفقا للبائع الخلايا الصباغية البشرية الطبيعية الأولية (NHEM) وسط نمو الخلايا الصباغية (وسط قاعدي + مزيج مكمل) وفقا للبائع الخلايا الليفية الخلايا الليفية الأولية للتينون البشري (HTFs) EMEM, 5٪ FBS، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية ذات القيمة النسبية 5 نانوغرام/مل، 5 ميكروغرام/مل من الأنسولين الريسوري، 50 ميكروغرام/مل حمض الأسكوربيك، 7 ملليمتر إل-جلوتامين، 100 وحدة لتر/مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين، 0.25 ميكروغرام/مل أمفوتريسين ب 28 HTFs الأولية ، و DMEM, 10٪ FBS، 100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين، 0.25 ميكروغرام/مل أمفوتريسين ب 20.28 الخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية خط خلية HFF-1 DMEM, 15٪ FBS، 100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين وفقا للبائع خط خلية BJ EMEM, 10٪ FBS، 100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين وفقا للبائع الخلايا البدينة الخلايا البدينة الأولية للجلد البشري (hsMCs) IMDM, 10٪ FBS، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية، 226 ميكرومتر α-مونوثيوجلسرين، 100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين 20 خط خلية LAD2 StemPro-34, 2.5٪ StemPro-34 مكمل غذائي، 2 ملليمتر إل-جلوتامين، 100 نانوغرام/مل عامل الخلايا الجذعية rh، 100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين 29 HMC-1.1 و 1.2 خطوط الخلايا IMDM, 10٪ FBS، 2 ملليمتر إل-جلوتامين، 25 مللي مول هيبس، 100 وحدة / مل بنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين 29 الجدول 8: نظرة عامة على الوسائط الأكثر استخداما لزراعة خلايا الجلد الأولية وخطوط الخلايا.أسطورة: الحد الأدنى من الوسط الأساسي من Dulbecco (DMEM) ، الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر (EMEM) ، مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، خليط المغذيات Ham’s F-12 (F12) ، وسيط Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) ، الإنسان المؤتلف (rh) ، معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI). في هذه المقالة ، تم إنشاء نماذج الجلد مع الخلايا الأولية للخلايا الكيراتينية والخلايا الصباغية والخلايا الليفية والخلايا البدينة. إنها أكثر تطلبا بقليل من خطوط الخلايا ، والوسائط الموصى بها لثقافتها ، والتي تم استخدامها لثقافة الخلية الواحدة ، هي: وسط نمو الخلايا الكيراتينية المكمل 2 (للخلايا الكيراتينية) ، المكمل المتوسط 254 (للخلايا الصباغية) ، المكمل DMEM المتوسط (للخلايا الليفية) ومتوسط IMDM المكمل (للخلايا البدينة). على هذه الوسائط ، تقدم الخلايا مورفولوجيتها النموذجية المخصصة لنوعها (تظهر الصور التمثيلية في الشكل 8). في حالة الثقافات المتعددة من نوعين أو أكثر من الخلايا ، كان من المهم اختيار وسيط يمكن أن تنمو فيه جميع أنواع الخلايا المستزرعة. بعد بضعة اختبارات ، تم اختيار وسيط DMEM مع 10٪ FBS وخليط مضاد حيوي 1٪ لإعداد نماذج ثلاثية الأبعاد أكثر تقدما من المجالات وما يعادلها. الشكل 8: تقدم خلايا الجلد مورفولوجيا مختلفة لوحظت خلال الزراعة الأحادية 2D. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. المجالات (تسمى عادة كروية) هي واحدة من أبسط نماذج 3D التي طورها باحثو هندسة الخلايا والأنسجة ، على الرغم من أن المجالات التي تم إنشاؤها من خلايا الجلد ليست شائعة. ضمن هذا النموذج ، يمكن إنشاء كل من الثقافات الأحادية والمتعددة للمجالات. تم وصف طرق متعددة لإعداد الكرات (على سبيل المثال ، مع قطرة معلقة ، والحد من التصاق الخلية ، والرفع المغناطيسي ، والدوران ، وعلم الموائع الدقيقة ، وما إلى ذلك) في الأدبيات30. نظرا لسهولة التحضير ، والتكلفة المنخفضة ، والمواد والمعدات المتاحة بسهولة ، يوصى باستخدام الطريقتين الأوليين للمبتدئين في نموذج الخلية ثلاثية الأبعاد (3D) ويمكن العثور على بروتوكولات لأدائهم أعلاه (الخطوة 2.1 و 2.2). وفقا للأدبيات31,32 ، فإن أهم المعلمات في هذه الطرق هي رقم الخلية وحجم تعليق الخلية ووقت الحضانة. يمكن إنشاء الكرات بأعداد مختلفة من الخلايا ، ولكن يجب تحسين كثافة الخلايا للبذر لكل نوع خلية على حدة وكذلك للمزارع المشتركة للخلية. كشفت عملية التحسين التي أجريت للزراعة الأحادية للخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية أن بذر 1 × 104 خلايا لكل بئر قدم أفضل النتائج لكلا النوعين من الخلايا. تم تحضير الكرات المعروضة في الشكل 9 باستخدام طريقة الحد من التصاق الخلايا في الألواح السفلية U (الخطوة 2.2). ينصح بإعداد 4 آبار على الأقل مع التكرار الفني (الأمثل هو 6 آبار). كانت المجالات التي تتكون من 1 × 104 خلايا أسهل في التلاعب لأنها كانت مرئية في الآبار. نتيجة لذلك ، كان من الممكن إزالة الوسط القديم من الآبار أثناء المقايسات دون تصريف المجالات. بعد العمليات الموصوفة ، كانت أشكال الكرات في الغالب دون تغيير وقابلة للتكرار. كان استقرار المجالات الأكبر منخفضا أثناء العملية. ومن الجدير بالذكر أيضا أن أنواع الخلايا المختلفة يمكن أن تشكل كرات بألوان مختلفة (على سبيل المثال ، تشكل الخلايا الكيراتينية كرات أغمق ، في حين أن كرات الخلايا الليفية أخف بكثير). الشكل 9: إنشاء الكرات. المجالات التي تم إنشاؤها بواسطة أنواع وأعداد مختلفة من خلايا الجلد باستخدام طريقة التصاق الخلايا المحددة. قضبان المقياس (اللوحة العلوية): 200 ميكرومتر. قضبان المقياس (اللوحة السفلية): 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. كما هو مذكور في طريقة الإسقاط المعلق (الخطوة 2.1) ، عند نقطة معينة تتطلب الكرات النقل من الغطاء إلى البئر. يمكن أن تكون هذه العملية ضارة للمجالات. وبالتالي ، لهذه الخطوة ، دقة عالية في العمل ضرورية. المجالات التي تم إنشاؤها عرضة لفقدان الشكل المناسب إذا لم يتم التعامل معها بعناية (الشكل 10). تقدم الصورة الأولى (الشكل 10 أ) كرة جيدة مستديرة بالتساوي من جميع الجوانب. في الصورتين الثانية والثالثة (الشكل 10B ، C) لوحظ فقدان لطيف للشكل بواسطة الكرة ، لكن مجموع الخلايا يظل مستديرا. تظهر الصور الثلاث الأخيرة (الشكل 10D-F) مراحل مختلفة من تلف الكرة. هناك حاجة إلى اكتساب الخبرة للحصول على تكرار أشكال وهياكل المجال التي تم إنشاؤها. مع المحاولات الأولى لتطوير المجالات ، يوصى باستخدام طريقة الحد من التصاق الخلايا للباحثين عديمي الخبرة (الخطوة 2.2) لأنها توفر نتائج أكثر قابلية للمقارنة مع التأثير المحدود لنشاط الباحث. الشكل 10: الصعوبات المحتملة في نقل الكرة من الغطاء إلى البئر – طريقة الإسقاط المعلق. (أ) كرة جيدة ، (ب ، ج) كرات تالفة قليلا ، (D-F) كرات تالفة للغاية. تم التقاط الصور بعد 24 ساعة من النقل. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ما يعادلها هي نماذج 3D أكثر تقدما بكثير من الجلد الاصطناعي من المجالات. أثناء عملية بناء نموذج الجلد ، يجب مراعاة جوانب مختلفة ، بما في ذلك عدد الطبقات في النموذج (البشرة فقط ، الأدمة فقط ، الأدمة ذات البشرة والطبقة القرنية) ، أنواع الخلايا المستخدمة ، المواد التطبيقية ، الحجم المفضل للمكافئ ، نوع البحث الذي سيتم استخدامه فيه مرة أخرى ، إلخ.14. يمكن ترتيب مكافئات الجلد في إدخالات خاصة موضوعة في الألواح القياسية متعددة الآبار بالحجم المطلوب (96 ، 48 ، 24 بئرا ، إلخ). على الرغم من سهولة نقل الإدخالات من بئر إلى آخر وأثناء التبادل الوسيط ، لا يمكن أن يتلف المكافئ ؛ أنها مكلفة للغاية. إذا كان النموذج لا يتطلب وجود الطبقة القرنية ، فإن الحل الأرخص هو إعداد ما يعادلها في بئر من الصفيحة متعددة الآبار. عادة ما يتم بناء طبقة الأدمة الاصطناعية كنموذج قائم على السقالة باستخدام الهلاميات المائية الطبيعية (الجيلاتين ، الكولاجين ، الفيبرين ، حمض الهيالورونيك ، الشيتوزان الجينات ، إلخ) أو الهلاميات المائية الاصطناعية (البولي إيثيلين جلايكول دياكريلات وحمض اللبنيك)33. لكي تكون مشابهة لأدمة الجلد الحقيقية ، يجب أن تحتوي هذه الطبقة في الغالب على الماء مع بعض مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) (بما في ذلك الكولاجين أو الفبرونيكتين) ، والتي تتوسط في ربط الخلايا ، والتفاعلات بين الخلايا والخلايا ، وإجراءات الخليةالأخرى 34. في هذا البحث ، تم اختيار الكولاجين من النوع الأول لأنه سهل التحضير على شكل هيدروجيل ، ويضمن هيكله المرن سهولة المزيد من الأنشطة البحثية المحتملة (على سبيل المثال ، نقل المكافئ من طبق إلى آخر). عادة ما يتم تحضير محلول الكولاجين من النوع الأول الذي يتم الحصول عليه من ذيل الفئران عن طريق إذابة المسحوق في حمض الخليك 20 مللي متر. لتحقيق خطوة بلمرة الكولاجين ، من الضروري توفير ظروف الأس الهيدروجيني المناسبة التي تتراوح بين 6.5-7.5. يمكن ضمان ذلك بإضافة كمية صارمة من هيدروكسيد الصوديوم. من أجل السهولة ، أدخلت بعض الشركات حسابات محددة ، والتي قد تساعد في تحديد الأحجام الدقيقة اللازمة لإعداد مثل هذه الهلاميات المائية (الجدول 6). على الرغم من أنه في الأدبيات ، يمكن مواجهة تركيزات مختلفة من الكولاجين في الهلاميات المائية (على سبيل المثال ، 0.5-2 مجم / مل35 ؛ 5-30 مجم / مل36 ؛ محتوى كولاجين منخفض وعالي37) ، في النموذج الموصوف ، تم استخدام محلول 2 مجم / مل لأن الهيدروجيل كان لا يزال يتمتع بهيكل مرن ، ولكنه كان مضغوطا بما يكفي لنقله من البئر إذا لزم الأمر. لتحضير جلد كامل السماكة واقعي تماما ، يجب زرع الخلايا المكافئة بنسبة ربما تكون قريبة من هذا الموجود في أجسامنا. في حالة البشرة ، اعتمادا على موقع الجسم ، تكون العلاقة بين الخلايا الصباغية ومجموعة من الخلايا الكيراتينية المرتبطة بها حوالي 1:36 ، والتي تعرف بأنها وحدة الميلانين للبشرة (EMU)38. وهكذا ، كانت النسبة المطبقة في البشرة الاصطناعية 1 الخلايا الصباغية إلى 15 الخلايا الكيراتينية (الجدول 5). لإنشاء طبقة من الأدمة الاصطناعية ، تم استخدام هيدروجيل الكولاجين من النوع 1 حيث تم دمج الخلايا الليفية والخلايا البدينة في نسبة خلية بدينة واحدة إلى 10 خلايا ليفية. يمكن مراقبة كل طبقة من المكافئ المبني في الوقت الفعلي على المجهر الضوئي المقلوب عن طريق تغيير عمق العينة المرصودة (تظهر الصور النموذجية في الشكل 11). الشكل 11: المراقبة في الوقت الحقيقي للخلايا المختلفة في طبقات معينة من مكافئ الجلد كامل السمك الذي تم إنشاؤه. (أ) الأدمة الزائفة و (ب) البشرة الزائفة) كما تصورها المجهر مشرق المجال. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. يمكن إجراء ملاحظات أكثر دقة مع تأكيد الحصول على الهيكل المقصود للنموذج عن طريق إجراء تلطيخ المكافئ. يجب تضمين المكافئ الثابت أولا في البارافين ثم قطعه بعد ذلك على ميكروتوم. يمكن تلطيخ الشرائح ذات الأنسجة الاصطناعية الرقيقة لاحقا بأصباغ مختلفة ، بما في ذلك الهيماتوكسيلين ويوزين (تلطيخ أساسي يتم إجراؤه في المختبرات الطبية). بفضل هذا الإجراء ، من الممكن التمييز بين الأدمة الاصطناعية والبشرة في المكافئات وكذلك تحديد خلايا الجلد الفردية (الشكل 12). في الشكل 12، لا تظهر أنواع الخلايا المحددة فحسب، بل من الممكن أيضا رؤية الخلايا الكيراتينية في مراحل مختلفة من عملية الانقسام الخلوي (الطور النهائي والطور الاستوائي). في حالة الخلايا البدينة ، يمكن التعرف على حبيبات معينة داخل الخلية. تؤكد هذه الصور في البداية أن مكافئ الجلد الذي تم إنشاؤه على قيد الحياة (الخلايا تنمو فيه) وأنها قادرة على العمل بشكل طبيعي في النموذج المطور. ومع ذلك ، مع البشرة 3D ونماذج سمك كامل من الجلد ، من المهم بشكل خاص للتحقق من جودة ووظائف البناء الذي تم الحصول عليه. للتحقق من نفاذية الطبقة القرنية ، يجب تطبيق قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) أو تلطيخ لوسيفر الأصفر39,40. علاوة على ذلك ، في الجلد الاصطناعي المكون بشكل صحيح ، يجب أن تكون هناك علامات محددة بما في ذلك علامات التمايز (على سبيل المثال ، Filaggrin ، Involucrin ، Loricrin ، Keratin 10 ، Keratin 5 ، فئات الدهون التي تتكون من السيراميد) ، علامات تقاطع البشرة الجلدية (على سبيل المثال ، الكولاجين من النوع الرابع ، Laminin V ، Alpha6Beta4-integrin ، مستضد BP) 41 ، علامات الوصلة الضيقة في طبقات البشرة (على سبيل المثال ، claudin-1 ، occludin ، zonula occludens protein (ZO) -1)42 وكذلك علامات انتشار الطبقة القاعدية (Ki67) 41. الشكل 12: مورفولوجيا خلايا الجلد وعملها. نظرة عامة على مورفولوجيا خلايا الجلد وعملها (مراقبة انقسامات الخلايا) في الجلد المكافئ كامل السماكة الملون بالهيماتوكسيلين والإيوزين. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (اللوحة العلوية) ، 50 ميكرومتر (اللوحة الوسطى ، اليسار) ، 100 ميكرومتر (اللوحة الوسطى ، اليمين) ، 50 ميكرومتر (اللوحة السفلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الطريقة الأكثر استخداما لتأكيد وجود علامة حيوية هي عن طريق إجراء تلطيخ معين ، مثل المناعة المناعية أو المناعية. يمكن تطبيق أجسام مضادة مختلفة وأصباغ فلورية للتصور المجهري لخلايا معينة في النماذج. يمكن رؤية نتيجة التلوين المثالي للخلايا في الثقافة في الشكل 13. لمراقبة الخلايا الكيراتينية ، تم استخدام جسم مضاد ضد السيتوكيراتين 14. في حالة الخلايا الصباغية ، كان الجسم المضاد المحدد لميلان أ. تم استخدام الجسم المضاد للكولاجين 1A2 لتلطيخ الخلايا الليفية و Sulforhodamine 101 الفلوري المترافق مع الهيبارين المكتشف في الخلايا البدينة. الشكل 13: نتائج تلطيخ الخلايا الفلورية. أ: السيتوكيراتين 14 في الخلايا الكيراتينية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (ب) ميلان-أ في الخلايا الصباغية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (ج) الكولاجين 1A2 في الخلايا الليفية. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (د) الهيبارين في الخلايا البدينة. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تقدم هذه المقالة المنهجية التي يمكن تطبيقها لإعداد نماذج الجلد الاصطناعي المتقدمة الخاصة بك. إنه حل جيد عندما يحتاج البحث المخطط له إلى نماذج بحث محددة بدقة قد يتبين أنها غير متوفرة في السوق أو مكلفة للغاية. كما ذكرنا سابقا ، تتوفر العديد من مكافئات الجلد التجارية في السوق (على سبيل المثال ، EpiSkin و EpiDerm FT). ومع ذلك ، فإن تكلفتها (100 يورو – 400 يورو للقطعة الواحدة) ووقت التسليم (بضعة أيام – أسابيع) قد تشجع الباحث على محاولة إعداد مثل هذا النموذج بمفرده. الإجراءات المقترحة سهلة التنفيذ حتى بالنسبة للعلماء عديمي الخبرة ، وفي الوقت نفسه ، تسمح بالحصول على نماذج بشرة متقدمة جدا. تجدر الإشارة إلى أن القرار بشأن التركيب الخلوي لنموذج معين يعتمد بشكل كامل على الباحث. بصرف النظر عن النموذج الذي تم إنشاؤه ، يمكن تطويره وتحسينه ، مما يفتح آفاقا بحثية جديدة تماما. في حالة النماذج التجارية ، من الضروري شراء مكافئ مختلف.

على الرغم من أن ثقافات الخلايا 3D قد تكون متقدمة مع أنواع متعددة من الخلايا ، ويسهل التعامل معها ويمكن الوصول إليها ، إلا أنها لا تزال مجرد نماذج اصطناعية لا يمكنها إعادة إنشاء تعقيد ووظائف الأنسجة بشكل كامل (على سبيل المثال ، الوظائف المناعية ، الأوعية الدموية). لهذا السبب ، في معظم الدراسات ، هناك حاجة إلى عدة نماذج لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها. تم جمع بعض مزايا وعيوب هذه النماذج في الجدول 9 ، وكذلك قيودها. من ناحية أخرى ، تضمن النماذج التجارية معايير نوعية عالية مع إمكانية تكرار التجارب وإمكانية مقارنة البيانات بين المختبرات. لتنفيذ استخدام مركب جديد للبحث ، سيكون من الضروري بالتأكيد شراء المكافئ التجاري المناسب. ولكن في المرحلة التحضيرية ، يمكن أن يساعد نموذج 3D المصنوع ذاتيا للجلد (كرة متعددة الخلايا أو ما يعادلها) في تقليل عدد التجارب اللازمة لتنفيذها على مكافئ تجاري. الهدف من إنتاج واستخدام النماذج الموصوفة ليس تجاوز الحاجة إلى تطبيق نماذج بحثية معتمدة ولكن لتسهيل البحث وتقليل النفقات ذات الصلة.

مقارنة زوج من النماذج	مزايا	مساوئ
زراعة الخلايا مقابل	الحد الأدنى من معاناة	معلومات محدودة عن تأثير عامل تم اختباره على الجسم كله
	توحيد التجربة العالية – استنساخ أفضل للنتائج	نموذج واحد لا يكفي ليعكس العمليات التي تحدث في الجسم
	لا آثار جانبية للكائن الحي كله	–
	تحكم أفضل في ظروف التجربة	–
	إمكانية الأتمتة (على سبيل المثال ، الطباعة الحيوية)	–
	تكاليف أقل	–
	صغر حجم العينة المطلوبة	–
	كمية محدودة من النفايات المتولدة	–
ثقافات 3D مقابل 2D	تعكس بشكل أفضل الكائن الحي الكامل	ثقافة تستغرق وقتا طويلا
	إمكانية إنشاء نسيج وظيفي	تكاليف أعلى
	إمكانية إنشاء نموذج مصمم خصيصا لاحتياجات البحوث التي أجريت	تشكيل عفوي لهيكل 3D يكاد يكون غير ممكن
	–	عدم وجود اختبارات موحدة لتحديد آثار المركبات المختلفة
	–	محدودية الوصول إلى ثقافات 3D المختلفة المتاحة في السوق
خط الخلية مقابل الخلايا الأولية	النماذج المعتمدة والمعتمدة	يتوفر عدد محدود فقط من خطوط الخلايا
	توحيد التجربة العالية – استنساخ أفضل للنتائج	إمكانية محدودة للحصول على عدة أنواع من الخلايا من نفس المتبرع
	عمر أطول	قد تمتلك خصائص متغيرة من الخلايا الأصلية
	معدل انتشار سريع إلى حد ما	وظائف مضطربة بشكل متكرر للخلايا
	أقل حساسية للعديد من الأنشطة (مثل التجميد والطرد المركزي)	–

الجدول 9: مقارنة بين استخدام النماذج المختلفة في البحث – المزايا مقابل العيوب

تصف العديد من المقالات كيفية إعداد نماذج الجلد ثلاثية الأبعاد (بصرف النظر عن مقالات المراجعة التي تلخص النماذج المتاحة تجاريا¹⁴^،⁴³^،⁴⁴ ، فإنها تركز عادة على منهجية واحدة للحصول على المجالات⁴⁵ أو ما يعادلها⁴⁶).

في هذه المقالة ، تم وصف منهجيتين لتشكيل الكرة مع خلايا الجلد. تستخدم طريقة الإسقاط المعلق على نطاق واسع ، ولكن قد تكون قابليتها للتكرار والاستقرار غير كافية في بعض الحالات. تتطلب معظم الخطوات إجراءات محددة ، مثل العمل عالي السرعة بسبب تبخر الماء من القطرات أثناء النقل. يوصى أيضا بالحركات اللطيفة ، لأن الافتقار إلى مثل هذه المهارة قد يؤدي إلى تلف إجمالي الخلايا^31,32. وبالتالي ، فإن الطريقة الأسهل لإعداد الكرة تركز على الحد من التصاق الخلايا. يؤدي عدم وجود سطح جيد لارتباط الخلية إلى زيادة التفاعلات بين الخلايا. نتيجة لذلك ، يتم إنشاء مجاميع الخلايا. تكرارها أعلى بكثير حيث لا توجد ضرورة لنقل الكرة. باستخدام هذه الطرق ، تم تحديد العدد الأمثل لخلايا الجلد لإنشاء كرة عند 1 × 10⁴ خلايا / كرة.

بعد ذلك ، تم عرض الإجراءات التي تصف إعداد مكافئات الجلد. قد يعتمد مظهرها ووظائفها في البحث بشدة على العناصر التي تم بناؤها منها ، بما في ذلك الخلايا (الجدول 2) والسقالات والوسائط. يمكن تقسيم السقالات 3D المستخدمة لإعداد الجلد الاصطناعي إلى الهلاميات المائية الاصطناعية وتلك التي تشكلت من مصادر طبيعية. اعتمادا على المواد المستخدمة وخصائصها لتكوين هيدروجيل ، قد تحدث ضرورة لتكملة الوسط بشكل إضافي. تتطلب الهلاميات المائية الاصطناعية دمج جزيئات نشطة بيولوجيا (البروتينات والإنزيمات وعوامل النمو) في شبكة الهيدروجيل الاصطناعية للتوسط في وظائف خلية معينة⁴⁷. تشمل الأساليب الرئيسية المقدمة في الأدبيات لتحقيق التسليم المتحكم فيه لعوامل النمو إلى الهلاميات المائية التحميل المباشر ، والتفاعل الكهروستاتيكي ، والربط التساهمي ، واستخدام الناقلات⁴⁸. الهلاميات المائية التي تشكلت من مصادر طبيعية مثل بروتينات ECM والبوليمرات يمكن أن تولد مسارات السوائل في جميع أنحاء سقالة 3D ، وتسريع توزيع المواد الغذائية. وبالتالي ، ليست هناك حاجة لمكملات إضافية من الوسط. أظهرت التحقيقات أن الجزيئات الصغيرة (مثل السيتوكينات وعوامل النمو) والجزيئات الكبيرة (بما في ذلك الجليكوزامينوجليكان والبروتيوغليكان) يمكن نقلها عبر ECM عن طريق الانتشار⁴⁷. ومع ذلك ، قد يتم إعاقة الانتشار الجزيئي للأكسجين والمواد الغذائية والجزيئات النشطة بيولوجيا الأخرى بسبب خصائص هيدروجيل ECM نفسه. ارتبط الانتشار المنخفض بسمك أعلى للهيدروجيل ولكن أيضا بتركيز عال جدا من الكولاجين³⁷. في هذه الدراسة ، لإنشاء مكافئ الجلد ، تم استخدام تركيز منخفض من الكولاجين يساوي 2 مجم / مل ، مما يشير إلى أن الانتشار الجزيئي عبر الهيدروجيل يجب أن يكون جيدا وسريعا. وبالتالي ، لم يتم توفير مكملات إضافية للوسط في هذه المرحلة ولا للهيدروجيل نفسه. لتقليد الأدمة ، تم تضمين الخلايا البدينة والخلايا الليفية (1:10) في هيدروجيل الكولاجين. بعد ذلك ، تم زرع الخلايا الصباغية والخلايا الكيراتينية (1:15) على الهيدروجيل وتم استزراع المكافئ بالكامل في الوسط. تجدر الإشارة إلى أن الوسط الأساسي يتكون من العديد من الأحماض الأمينية والأحماض غير العضوية والفيتامينات ، بالإضافة إلى ذلك يتم استكماله بالمصل (يتكون من عوامل متعددة: النمو والتعلق للخلايا والدهون والهرمونات والمواد المغذية ومصادر الطاقة والناقلات والبروتينات الملزمة والمنقولة ، وما إلى ذلك). لتحقيق البنية المناسبة للبشرة ، يجب إضافة مكملات مختلفة إلى الوسط في وقت معين. أهم محفز لبدء تمايز البشرة هو الكالسيوم ، لأنه ينشط الإشارات داخل الخلايا. يحفز حمض الأسكوربيك مسارا مشابها للإشارات مثل المسار الذي يتوسطه الكالسيوم ، ولكن تأثيره مصحوب أيضا بنقل الأسكوربات المعزز والوقاية من استنفاد مضادات الأكسدة المحبة للماء⁴¹. علاوة على ذلك ، تم تحسين تمايز الخلايا عند إضافة مكونات أخرى إلى الوسط (مثل الكافيين والهيدروكورتيزون وثلاثي يودوثيرونين والأدينين وتوكسين الكوليرا)^41,44. من المهم دائما فحص النماذج المعدة لوجود نوع خلية معين في الطبقة المناسبة. تم تأكيد وجود جميع الأنواع الأربعة من خلايا الجلد في بنية المكافئ الذي تم إنشاؤه بواسطة تلطيخ H&E.

المشكلة الأكثر شيوعا التي تواجهها هي الحساسية والحدس في التعامل مع النماذج التي تم الحصول عليها. قد تكون بعض الصعوبات مرتبطة بتكوين كرة الخلية وكذلك مع إعداد هيدروجيل. أثناء زراعة الخلايا ، يمكن أن تحدث العديد من المشاكل الأخرى أيضا ؛ وتشمل هذه الالتهابات الميكروبية ، وانخفاض معدل تكاثر الخلايا ، وشيخوخة الخلايا الأولية المستخدمة في النماذج ، والحد الأقصى لوقت زراعة نماذج 2D و 3D المعاد بناؤها من الخلايا الأولية مقابل خطوط الخلايا ، إلخ. في الجدول 10 ، تم جمع بعض النصائح العملية حول ما يجب القيام به عند مواجهة إحدى المشكلات التالية.

المشاكل الشائعة في زراعة الخلايا	اقتراحات
العدوى الميكروبية	في حالة حدوث عدوى ميكروبية في إحدى القوارير / الأطباق التي تحتوي على خلايا ، فمن الأفضل إزالة المزرعة المصابة في أسرع وقت ممكن (عدم تلويث القوارير / الأطباق المتبقية بالخلايا). أعد تجميد قارورة جديدة بالخلايا. إذا عادت العدوى ، فمن الجيد محاولة توسيع أطياف المضادات الحيوية المطبقة وزيادة تركيزها.
انخفاض معدل انتشار الخلايا	بعض الخلايا لديها وقت مضاعفة طويل. لتحفيز انتشارها ، يمكن إضافة العديد من عوامل النمو الخاصة بالخلايا إلى الوسط الأساسي. كما أن زيادة تركيز FBS أو L-glutamine في الوسط القاعدي قد يساعد على تحفيز نمو الخلايا.
شيخوخة الخلايا الأولية المستخدمة في النماذج	بعد بضعة مقاطع ، تدخل الخلايا الأولية الشيخوخة وتتوقف عن الانقسام. للتغلب على هذه المشكلة في النماذج ، يوصى باستخدام الخلايا من المرور المبكر قدر الإمكان لبناء النموذج.
الحد الأقصى لوقت زراعة نماذج 2D و 3D المعاد بناؤها من الخلايا الأولية مقابل خطوط الخلايا	يعتمد وقت زراعة النموذج بشدة على نوع الخلايا المستخدمة. مع الخلايا الأولية ، سيكون وقت الزراعة أقصر بسبب عمرها القصير.
صعوبات في تكوين كرة الخلية	قد تتطلب بعض الخلايا وقتا أطول لتشكيل الكرة. إذا لم يتم تشكيل الكرات بعد بضعة أيام أخرى ، فقم بجمع الخلايا من العينة وتحقق من صلاحيتها ، على سبيل المثال ، تلطيخ التريبان الأزرق.
مشاكل في استقرار المجال	إذا كانت الكرات غير مستقرة وتم تدميرها أثناء المناولة ، فحاول إنشاء كرات من عدد أقل من الخلايا. تأكد دائما من نقل الأطباق التي تنمو فيها المجالات برفق.
صعوبات في إعداد هيدروجيل	تحقق مما إذا كانت نسبة المكونات (الماء ، PBS [10x] ، هيدروكسيد الصوديوم ، الكولاجين من النوع 1) صحيحة. عادة ما يكون محلول الكولاجين كثيفا جدا ، لذا تأكد من سحبه ببطء. تزعج فقاعات الهواء مورفولوجيا الهيدروجيل ، وبالتالي فإن السحب العكسي للهلام قد يساعد في حل هذه المشكلة.

الجدول 10: استكشاف أخطاء زراعة الخلايا وإصلاحها

يمكن استخدام النماذج المعمول بها بعد التصنيع في مجالات متعددة ، بدءا من (1) تجارب السمية الخلوية والسمية الجينية للمركبات الجديدة ذات النشاط البيولوجي للاستخدام في الأدوية ومستحضرات التجميل⁴⁹ ، (2) تجارب مع تحفيز العوامل المختلفة⁵⁰ ، (3) البحوث الأساسية التي تزيد من معرفتنا بخلايا الجلد ووظائفها البيولوجية والتفاعلات مع الخلايا الأخرى والبيئة⁵¹ ^،⁵² ، (4) بحث عن كيانات مرضية مختارة حيث يمكن إدخال نوع معين من الخلايا في النموذج الذي تم إنشاؤه (الخلايا السرطانية ، الخلايا ذات الطفرة في جين معين ، إلخ.14^،⁵³) وغيرها الكثير. وغني عن القول أن تطبيق هذه النماذج يظل متفقا مع مبدأ 3Rs للاستخدام الأكثر أخلاقية للحيوانات في اختبار المنتج والبحث العلمي ولا ينتهك قانون حظر اختبار منتجات مستحضرات التجميل على.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدعم المالي الذي قدمته جامعة وارسو للتكنولوجيا من برنامج “مبادرة التميز – جامعة البحوث” في شكل منحتين: POB BIB BIOTECHMED-2 START (رقم 1820/2 / ZO1 / POB4/2021) ومنحة رئيس الجامعة لمجموعات البحث الطلابية (SKIN-ART ، رقم 1820/116 / Z16/2021). علاوة على ذلك ، يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدعم الذي تلقوه من البروفيسور جوانا سيسلا ورئيس قسم التكنولوجيا الحيوية للأدوية ومستحضرات التجميل وكذلك نادي علوم التكنولوجيا الحيوية “Herbion” في كلية الكيمياء بجامعة وارسو للتكنولوجيا. شكر خاص للدكتور ميشال ستيبولاك لتوفير مركب Pluronic F-127.

Materials

24-well plate for adherent cell culture	Biologix Europe GmbH	07-6024	–
35%–38% HCL	Chempur	115752837	–
60 mm cell culture Petri dish	Nest	705001	–
Avidin−Sulforhodamine 101	Sigma Aldrich	A2348-5MG	–
Bright-field inverted microscope	Olympus	CKX41	–
Calcium chloride	Avantor	874870116	–
Cell culture flask T75 for adherent cells	Genoplast	G77080033	–
Centrifuge tube 15 mL	GoogLab Scientific	G66010522	–
CO2 Incubator	Heal Force	Galaxy 170R	–
Col1A2 antibody produced in rabbit	Novus	NBP2-92790	–
Corning(R) Transwell(R) Polycarbonate	Corning	CLS3422-48EA	–
Cytokeratin 14 antibody produced in mouse	Novus	NBP1-79069	–
DPX Mountant for histology	Sigma Aldrich	06522-100ML	–
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	VWR Chemicals	L0102-500	–
Eosine Y	Kolchem	–	0.5 % aquatic solution
Eppendorf tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001	–
Eppendorf tube 2 mL	Sarstedt	72.691	–
Ethyl alcohol absolute 99.8%	Avantor	396480111	diluted in ultrapure water to the needed concentrations
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	–
Fluorescent inverted microscope	Olympus	IX71	–
Goat anti-mouse secondary antibody conjugated with FITC	Sigma Aldrich	F0257-1mL
Goat anti-rabbit secondary antibody conjugated with FITC	Novus	NB7159	–
Harris Hematoxylin	Kolchem	–	1 mg/mL in 95% ethanol
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	–
Laminar chamber	Heal Force	HFSafe-1200	–
Melan-A antibody produced in mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-20032	–
Microtome	Microm	HM355S	–
NaOH	Avantor	810981997	–
Paraffin pastilles	Sigma Aldrich	1.07164	–
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	1581227	–
Penicillin/Streptomycin solution	Sigma Aldrich	P4333	–
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	–
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3021	–
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.303	–
Pluronic F-127	BASF	50401036	–
Serological pipette 10 mL	GoogLab Scientific	G33270011	–
Serological pipette 25 mL	GoogLab Scientific	G33280011	–
Serological pipette 5 mL	GoogLab Scientific	G33260011	–
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	–
Sodium bicarbonate	Chempur	118105307
Trypsin-EDTA 0.25% solution, phenol red	Sigma Aldrich	25200072	–
Type 1 collagen	IBIDI	50201	–
U-bottom 96-well plate	Sarstedt	83.3925500	–
Xylene	Sigma Aldrich	534056	–

Referências

Farage, M. A., Miller, K. W., Elsner, P., Maibach, H. I. Characteristics of the aging skin. Advances in Wound Care. 2 (1), 5-10 (2013).
Zhu, H., Alikhan, A., Maibach, H. I., Farage, M. A., Miller, K. W., Maibach, H. I. Biology of Stratum Corneum: Tape Stripping and Protein Quantification. Textbook of Aging Skin. , (2015).
Boer, M., Duchnik, E., Maleszka, R., Marchlewicz, M. Structural and biophysical characteristics of human skin in maintaining proper epidermal barrier function. Postepy Dermatogogii I Alergologii. 33 (1), 1-5 (2016).
De Falco, M., Pisano, M. M., De Luca, A., Baldi, A., Pasquali, P., Spugnini, E. P. Embryology and Anatomy of the Skin. In Skin Cancer: A Practical Approach. Current Clinical Pathology. , (2014).
Dehdashtian, A., Stringer, T. P., Warren, A. J., Mu, E. W., Amirlak, B., Shahabi, L., Riker, A. I. Anatomy and Physiology of the Skin. Melanoma: A Modern Multidisciplinary Approach. , 15-26 (2018).
Graham, H. K., Eckersley, A., Ozols, M., Mellody, K. T., Sherratt, M. J., Limbert, G. Human Skin: Composition, Structure and Visualisation Methods. Skin Biophysics; Studies in Mechanobiology, Tissue Engineering, and Biomaterials. 22, 1-18 (2019).
Piasek, A. M., Musolf, P., Sobiepanek, A. Aptamer-based advances in skin cancer research. Current Medicinal Chemistry. 30 (8), 953-973 (2023).
Bergfeld, W. F., Belsito, D. V., Marks, J. G., Andersen, F. A. Safety of ingredients used in cosmetics. Journal of the American Academy of Dermatology. 52 (1), 125-132 (2005).
Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
Sreedhar, D., Manjula, N., Ajay, P., Shilpa, P., Ligade, V. Ban of cosmetic testing on animals: A brief overview. International Journal of Current Research and Review. 12 (14), 113-116 (2020).
Silva, R. J., Tamburic, S. A state-of-the-art review on the alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics. Cosmetics. 9 (5), 90 (2022).
Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
Boelsma, E., Ponec, M., Gabard, B., Surber, C., Elsner, P., Treffel, P. Basics (Guidelines) on Cell Culture Testing for Topical/Dermatological Drugs/Products and Cosmetics With Regard to Efficacy and Safety of the Preparations. In Dermatopharmacology of Topical Preparations. , 37-57 (2000).
Suhail, S., Sardashti, N., Jaiswal, D., Rudraiah, S., Misra, M., Kumbar, S. G. Engineered skin tissue equivalents for product evaluation and therapeutic applications. Biotechnology Journal. 14 (7), 1900022 (2019).
Sobiepanek, A., et al. Novel diagnostic and prognostic factors for the advanced melanoma based on the glycosylation-related changes studied by biophysical profiling methods. Biosensors and Bioelectronics. 203, 114046 (2022).
Yang, H., Sun, L., Liu, M., Mao, Y. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
Baran, J., et al. Mast cells as a target-A comprehensive review of recent therapeutic approaches. Cells. 12 (8), 1187 (2023).
Kosten, I. J., Buskermolen, J. K., Spiekstra, S. W., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Gingiva equivalents secrete negligible amounts of key chemokines involved in langerhans cell migration compared to skin equivalents. Journal of Immunology Research. 2015, 627125 (2015).
cieżyńska, A., et al. A novel and effective method for human primary skin melanocytes and metastatic melanoma cell isolation. Cancers. 13 (24), 6244 (2021).
Kröger, M., et al. In vivo non-invasive staining-free visualization of dermal mast cells in healthy, allergy and mastocytosis humans using two-photon fluorescence lifetime imaging. Scientific Reports. 10 (1), 14930 (2020).
Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnology and Bioengineering. 118 (2), 542-554 (2021).
Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52576 (2015).
Kim, K., Kim, J., Kim, H., Sung, G. Y. Effect of α-lipoic acid on the development of human skin equivalents using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2160 (2021).
Curto, E. V., Lambert, G. W., Davis, R. L., Wilborn, T. W., Dooley, T. P. Biomarkers of human skin cells identified using DermArray DNA arrays and new bioinformatics methods. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 1052-1064 (2002).
Godwin, L. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Current Protocols in Cell Biology. 63, 1-20 (2014).
Przekora, A., Zarnowski, T., Ginalska, G. A simple and effective protocol for fast isolation of human tenon’s fibroblasts from a single trabeculectomy biopsy – a comparison of cell behaviour in different culture media. Cellular & Molecular Biology Letters. 22, 5 (2017).
Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M., Coligan, J. E., Bierer, B. E., Margulies, D. H., Shevach, E. M., Strober, W. Generation, Isolation, and Maintenance of Human Mast Cells and Mast Cell Lines Derived from Peripheral Blood or Cord Blood. Current Protocols in Immunology. , (2010).
Artuc, M., Muscha Steckelings, U., Henz, B. M. Mast cell-fibroblast interactions: Human mast cells as source and inducers of fibroblast and epithelial growth factors. Journal of Investigative Dermatology. 118 (3), 391-395 (2002).
Panos, R. J., Rubin, J. S., Csaky, K. G., Aaronson, S. A., Mason, R. J. Keratinocyte growth factor and hepatocyte growth factor/scatter factor are heparin-binding growth factors for alveolar type ii cells in fibroblast-conditioned medium. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 969-977 (1993).
Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Threedimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
Amaral, R. L. F., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
Gao, B., Jing, C., Ng, K., Pingguan-Murphy, B., Yang, Q. Fabrication of three-dimensional islet models by the geometry-controlled hanging-drop method. Acta Mechanica Sinica. 35 (2), 329-337 (2019).
Zhang, C., et al. 3D culture technologies of cancer stem cells: Promising ex vivo tumor models. Journal of Tissue Engineering. 11, (2020).
Sobiepanek, A., Paone, A., Cutruzzolà, F., Kobiela, T. Biophysical characterization of melanoma cell phenotype markers during metastatic progression. European Biophysics Journal: EBJ. 50 (3-4), 523-542 (2021).
Jin, G. -. Z., Kim, H. -. W. Effects of Type I collagen concentration in hydrogel on the growth and phenotypic expression of rat chondrocytes. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 383-391 (2017).
Osidak, E. O., et al. Concentrated collagen hydrogels: A new approach for developing artificial tissues. Materialia. 20, 101217 (2021).
Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: Characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
Jimbow, K., Salopek, T. G., Dixon, W. T., Searles, G. E., Yamada, K. The epidermal melanin unit in the pathophysiology of malignant melanoma. The American Journal of Dermatopathology. 13 (2), 179-188 (1991).
Van Den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: Good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
Idrees, A., et al. Fundamental in vitro 3D human skin equivalent tool development for assessing biological safety and biocompatibility – towards alternative for animal experiments. 4 Open. 4, (2021).
Park, H. -. Y., Kweon, D. -. K., Kim, J. -. K. Upregulation of tight junction-related proteins by hyaluronic acid in human HaCaT keratinocytes. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre. 30, 100374 (2023).
Choudhury, S., Das, A. Advances in generation of three-dimensional skin equivalents: Pre-clinical studies to clinical therapies. Cytotherapy. 23 (1), 1-9 (2021).
Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K. E., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. 49, 102048 (2020).
Ouwehand, K., Spiekstra, S. W., Waaijman, T., Scheper, R. J., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Technical advance: Langerhans cells derived from a human cell line in a full-thickness skin equivalent undergo allergen-induced maturation and migration. Journal of Leukocyte Biology. 90 (5), 1027-1033 (2011).
Akther, F., Little, P., Li, Z., Nguyen, N. -. T., Ta, H. T. Hydrogels as artificial matrices for cell seeding in microfluidic devices. RSC Advances. 10 (71), 43682-43703 (2020).
Silva, A. K. A., Richard, C., Bessodes, M., Scherman, D., Merten, O. -. W. Growth factor delivery approaches in hydrogels. Biomacromolecules. 10 (1), 9-18 (2009).
Lee, H. -. R., et al. Effect of Aronia extract on collagen synthesis in human skin cell and dermal equivalent. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 4392256 (2022).
Mulder, P. P. G., Raktoe, R. S., Vlig, M., Elgersma, A., Middelkoop, E., Boekema, B. K. H. L. Full skin equivalent models for simulation of burn wound healing, exploring skin regeneration and cytokine response. Journal of Functional Biomaterials. 14 (1), 29 (2023).
Goncalves, K., et al. Investigation into the effect of skin tone modulators and exogenous stress on skin pigmentation utilizing a novel bioengineered skin equivalent. Bioengineering & Translational Medicine. 8 (2), 10415 (2023).
Michel, M., L’Heureux, N., Pouliot, R., Xu, W., Auger, F. A., Germain, L. Characterization of a New Tissue-Engineered Human Skin Equivalent with Hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57500 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Piasek, A. M., Levkovych, I., Musolf, P., Chmielewska, H., Ścieżyńska, A., Sobiepanek, A. Building Up Skin Models for Numerous Applications – from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture. J. Vis. Exp. (200), e65773, doi:10.3791/65773 (2023).