कशेरुक रेटिना में आंतरिक परमाणु परत न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर फ्लैटमाउंट तैयारी के रूप में रेटिना को विभाजित करें
Summary
यह काम एक वैकल्पिक फ्लैटमाउंट रेटिना तैयारी प्रस्तुत करता है जिसमें फोटोरिसेप्टर सेल निकायों को हटाने से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, सीटू संकरण और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए आंतरिक रेटिना न्यूरॉन्स तक तेजी से एंटीबॉडी प्रसार और बेहतर पैच पिपेट पहुंच सक्षम होती है।
Abstract
द्विध्रुवी कोशिकाएं और कशेरुक रेटिना की क्षैतिज कोशिकाएं फोटोरिसेप्टर द्वारा फोटॉन का पता लगाने के बाद दृश्य जानकारी को संसाधित करने वाले पहले न्यूरॉन्स हैं। वे प्रकाश अनुकूलन, विपरीत संवेदनशीलता, और स्थानिक और रंग प्रतिरोध जैसे मौलिक संचालन करते हैं। सटीक सर्किटरी और जैव रासायनिक तंत्र की पूरी समझ जो उनके व्यवहार को नियंत्रित करती है, दृश्य तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान और नेत्र विज्ञान चिकित्सा को आगे बढ़ाएगी। हालांकि, द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं (रेटिना पूरे माउंट और ऊर्ध्वाधर स्लाइस) की जांच के लिए वर्तमान तैयारी इन कोशिकाओं की शारीरिक रचना और शरीर विज्ञान को पकड़ने की उनकी क्षमता में सीमित है। इस काम में, हम जीवित, फ्लैटमाउंट माउस रेटिना से फोटोरिसेप्टर सेल निकायों को हटाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, कुशल पैच क्लैंपिंग और तेजी से इम्यूनोलेबलिंग के लिए द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं तक बढ़ी हुई पहुंच प्रदान करते हैं। विभाजित रेटिना नाइट्रोसेल्यूलोज के दो टुकड़ों के बीच एक पृथक माउस रेटिना को सैंडविच करके तैयार किए जाते हैं, फिर धीरे से उन्हें अलग कर देते हैं। पृथक्करण नाइट्रोसेल्यूलोज के दो टुकड़े उत्पन्न करने के लिए बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत के ठीक ऊपर रेटिना को विभाजित करता है, एक में फोटोरिसेप्टर सेल बॉडी होती है और दूसरे में शेष आंतरिक रेटिना होता है। ऊर्ध्वाधर रेटिना स्लाइस के विपरीत, विभाजित रेटिना तैयारी आंतरिक रेटिना न्यूरॉन्स की डेंड्राइटिक प्रक्रियाओं को अलग नहीं करती है, जिससे द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग की अनुमति मिलती है जो गैप जंक्शन-युग्मित नेटवर्क और वाइड-फील्ड एमोक्राइन कोशिकाओं के योगदान को एकीकृत करते हैं। यह काम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और सीटू संकरण प्रयोगों में क्षैतिज और द्विध्रुवी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए इस तैयारी की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है।
Introduction
रेटिना पीछे की आंख में स्थित एक पतली तंत्रिका ऊतक है जहां प्रकाश को अवरुद्ध किया जाता है और एक विद्युत रासायनिक संकेत में संसाधित किया जाता है जिसे मस्तिष्क द्वारा व्याख्या किया जा सकता है। रेटिना के पीछे, रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर प्रकाश द्वारा उत्तेजित होते हैं, जो न्यूरोट्रांसमीटर, ग्लूटामेट1 की टॉनिक रिलीज दर को कम करता है। ग्लूटामेट एकाग्रता में इस प्रकाश-प्रेरित परिवर्तन का अनुभव करने और प्रतिक्रिया करने वाले पहले न्यूरॉन्स द्विध्रुवी य कोशिकाएं (बीसी) और क्षैतिज कोशिकाएं (एचसी) हैं, जिनके सोम आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) के सबसे बाहरी क्षेत्र में रहते हैं। ये दूसरे क्रम के न्यूरॉन्स रेटिना में सिग्नल प्रोसेसिंग के पहले चरण का प्रदर्शन करते हैं और दृष्टि की महत्वपूर्ण विशेषताओं जैसे प्रकाश अनुकूलन, कंट्रास्ट संवेदनशीलता और स्थानिक / जबकि इन कार्यों को बीसी और एचसी के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, इन प्रक्रियाओं के अंतर्निहित सर्किटरी और जैव रासायनिक तंत्र पूरी तरहसे समझ में नहीं आते हैं। इसलिए, बीसी और एचसी फिजियोलॉजी की खोज के लिए उपकरणों और विधियों की उन्नति सर्वोपरि महत्व की है।
ऊर्ध्वाधर (अनुप्रस्थ) रेटिना अनुभाग ों ने लंबे समय से बीसी और एचसी का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यावहारिक मॉडल साबित किया है; हालांकि, बीसी और एचसी फिजियोलॉजी के कुछ पहलू इस मॉडल के तहत प्रयोगकर्ता के लिए दुर्गम हैं। एचसी से प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग या बीसी पर उनके प्रभावों के अप्रत्यक्ष माप रेटिना की अंतर्जात कनेक्टिविटी को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं क्योंकि इन कोशिकाओं की पार्श्व प्रक्रियाएं टुकड़े करने के दौरान अलग हो जाती हैं। पूरे माउंट रेटिना की तैयारी इन पार्श्व प्रक्रियाओं को संरक्षित करके इस मुद्दे को दरकिनार करती है, लेकिन आसपास की रेटिना परतेंइन कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए एक चुनौती पैदा करती हैं। जबकि पूरे माउंट रेटिना में आईएनएल न्यूरॉन्स से इम्यूनोस्टेनिंग 5,6,7,8 और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग 9 के प्रचुर उदाहरण हैं, इन आंकड़ों के संग्रह को तेज और सरल बनाने का अवसर है। अनुप्रस्थ वर्गों की अंतर्निहित सीमाओं और पूरे माउंट मॉडल की चुनौतियों ने इस वैकल्पिक फ्लैटमाउंट रेटिना तैयारी के विकास को प्रेरित किया।
निम्नलिखित कार्य सरलीकृत पैच क्लैंपिंग और तेज, अधिक कुशल इम्यूनोलेबलिंग के लिए बीसी और एचसी तक पहुंच बढ़ाने के लिए लाइव, फ्लैटमाउंट रेटिना से फोटोरिसेप्टर परत को आसानी से हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। एक पृथक रेटिना के दोनों ओर जुड़े नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के दो टुकड़ों को छीलने से फोटोरिसेप्टर अक्षतंतु के माध्यम से ऊतक को आँसू आते हैं, जिससे एक विभाजित रेटिना निकलता है जो बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत (ओपीएल) और सभी आंतरिक रेटिना परतों को बरकरार रखता है। जबकि अन्य लोगों ने रेटिना की परतों को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, ये विधियां या तो पैच क्लैंपिंग और माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए खराब अनुकूल हैं या ऊतक के थकाऊ हेरफेर की आवश्यकता होती है। इनमें से कई विधियों को परत पृथक्करण के लिए जमे हुए या लियोफिलाइज्ड ऊतक की आवश्यकता होती है, जिससे उन्हें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों10,11,12 के साथ असंगत बना दिया जाता है। अन्य जीवित ऊतक के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, लेकिन फोटोरिसेप्टर को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर 4,11 या ट्रिप्सिन 13 के साथ उपचार के साथ 5-15 अनुक्रमिक छिलके की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित तकनीक फोटोरिसेप्टर हटाने की प्रक्रिया को सरल बनाकर और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के प्रदर्शनों का विस्तार करके अपने पूर्ववर्तियों पर सुधार करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
फोटोरिसेप्टर फोटॉन अवशोषण को न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में ट्रांसड्यूस करने के बाद, बीसी और एचसी दृश्य संकेत23 को संसाधित करने वाले पहले रेटिना न्यूरॉन्स हैं। जबकि इन न्यूरॉन्स के महत्व की अच्छी तरह से सराहना की जाती है, उनके कई कार्यों को पूरी तरह से समझा या अस्पष्टीकृत किया जाता है। कई बीसी और एचसी फिजियोलॉजी अध्ययनों को एक फ्लैटमाउंट रेटिना तैयारी से लाभ होगा जो पार्श्व कनेक्टिविटी को संरक्षित करते हुए आईएनएल न्यूरॉन्स तक पहुंच में सुधार करता है। विभाजित रेटिना विधि का विकास एक फ्लैटमाउंट अभिविन्यास में बीसी और एचसी से उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और माइक्रोस्कोपी डेटा प्राप्त करने के लिए एक आसान प्रोटोकॉल प्रदान करने के प्रयास का प्रतिनिधित्व करता है। यहां वर्णित विभाजित रेटिना तैयारी विशेष उपकरणों के उपयोग के बिना, रेटिना अलगाव के बाद लगभग 20 मिनट प्रति माउस (10 मिनट प्रति रेटिना) में की जा सकती है। विधि मौजूदा फोटोरिसेप्टर हटाने की प्रक्रियाओं से प्रेरणा लेती है लेकिन सादगी, गति और बहुमुखी प्रतिभा 4,10,11,12,13 में महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करती है। रेटिना परतों को अलग करने के पिछले तरीकों के विपरीत, रेटिना विभाजन को रेटिना में ठंड, लियोफिलाइजेशन, या चिपकने वाले पदार्थों के बार-बार आवेदन की आवश्यकता नहीं होती है। अभ्यास के साथ, लगभग सभी फोटोरिसेप्टर को नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के साथ एक आंसू में हटाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की गति और आसानी रेटिना को कार्बोजेनेटेड एम्स से बाहर खर्च होने वाले समय को कम करने की अनुमति देती है, जिससे लंबे समय तक उच्च सेल व्यवहार्यता सक्षम होती है; विभाजित रेटिना को विभाजन के बाद कई घंटों तक कार्बोजेनेटेड एम्स मीडिया में बनाए रखा जा सकता है। इस तैयारी में आईएनएल न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य के प्रमाण के रूप में, एक जीवित / मृत सेल दाग (चित्रा 4) और पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (चित्रा 6) विभाजन के बाद आरबीसी और एचसी की व्यवहार्यता की पुष्टि करते हैं।
विभाजित रेटिना में फोटोरिसेप्टर परत को हटाने से आईएनएल में एंटीबॉडी के प्रसार समय को नाटकीय रूप से कम करके इम्यूनोलेबलिंग के दौरान एक महत्वपूर्ण लाभ मिलता है। प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी लेबलिंग 2 घंटे के भीतर पूरी की जा सकती है, पारंपरिक फ्लैटमाउंट स्टेनिंग में पर्याप्त सुधार जो लक्ष्य 5,6,7,8,20,22 के आधार पर 72 घंटे या उससे अधिक समय ले सकता है। नतीजतन, माइक्रोस्कोपी डेटा को ऊतक तैयारी के रूप में उसी दिन प्राप्त किया जा सकता है, जिससे इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों की गति में काफी तेजी आती है। एमआरएनए जांच एनीलिंग की सुविधा के लिए, फिश प्रयोग आमतौर पर इम्यूनोलेबलिंग18 की तुलना में बहुत लंबे समय तक निर्धारण समय (~ 24 घंटे) की सिफारिश करते हैं। हालांकि, यहां प्रस्तुत प्रयोगों से पता चलता है कि 2 घंटे का निर्धारण अभी भी असाधारण मछली लेबलिंग (चित्रा 5) का उत्पादन करता है। निर्धारण समय को 30 मिनट से 2 घंटे तक बढ़ाने के बावजूद, उत्कृष्ट इम्यूनोलेबलिंग प्राप्त करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरणों को करना आवश्यक नहीं था, लेकिन यह एंटीबॉडी या एंटीजन के साथ भिन्न हो सकता है। फिश प्रोटोकॉल में प्रोटीज उपचार एंटीबॉडी लेबलिंग में हस्तक्षेप कर सकता है, संभवतः लक्ष्य एपिटोप्स के विनाश के कारण। इस मुद्दे को पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके दरकिनार कर दिया गया था जो कई एपिटोप्स को लक्षित करते हैं, जिससे संभावना कम हो जाती है कि एपिटोप विनाश इम्यूनोलेबलिंग में बाधा डालेगा। इसके अतिरिक्त, एक मध्यम प्रोटीज उपचार (एसीडी प्रोटीज III) का उपयोग अत्यधिक एपिटोप परिवर्तन को रोकने के लिए किया गया था, जबकि अभी भी पर्याप्त ऊतक प्रवेश प्रदान किया गया था।
कभी-कभी, रेटिना इसके बजाय बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) के माध्यम से विभाजित हो जाएगा, जिससे फोटोरिसेप्टर सोमा की परतें पीछे छूट जाएंगी, जिसमें कोई आईएनएल कोशिकाएं दिखाई नहीं देंगी। इसे रोकने के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि रेटिना ग्लास पर पूरी तरह से सपाट है, और रेटिना के चारों ओर से किसी भी अवशिष्ट तरल को हटा दिया गया है। पेंटब्रश के साथ नाइट्रोसेल्यूलोज पर अधिक मजबूती से दबाने से ओएनएल के माध्यम से विभाजन को रोकने में भी मदद मिल सकती है। यदि झिल्ली बहुत गीली हो जाती है या रेटिना अपने आप मुड़ जाता है, तो एक सफल विभाजन की संभावना बहुत कम हो जाएगी। सेल नाभिक को दागने के लिए DAPI का उपयोग विभाजन की गुणवत्ता का आकलन करने और शेष फोटोरिसेप्टर के कवरेज का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है। फोटोरिसेप्टर नाभिक छोटे, उज्जवल और अधिक सतही होते हैं (पूरक चित्रा 3 ए), जबकि बीसी नाभिक बड़े, मंद और गहरे होते हैं (पूरक चित्रा 3 बी)। कुछ मामलों में, आंसू का विमान रेटिना के टुकड़े में थोड़ा भिन्न होगा, जिसके परिणामस्वरूप पैच होंगे जहां फोटोरिसेप्टर सेल बॉडी को पूरी तरह से हटाया नहीं गया है (पूरक चित्रा 3 सी)। माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में अनुप्रयोगों के लिए, यह उन क्षेत्रों से गुणवत्ता डेटा एकत्र करने की क्षमता में बाधा नहीं डालता है जहां फोटोरिसेप्टर को ठीक से हटा दिया गया है; पैच पिपेट के साथ इमेजिंग या रिकॉर्डिंग करते समय उजागर आंतरिक रेटिना के बड़े क्षेत्र आसानी से पाए जा सकते हैं। यदि अधिक पूर्ण फोटोरिसेप्टर हटाने की इच्छा है, तो नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के एक अतिरिक्त टुकड़े के साथ एक दूसरा आंसू किया जा सकता है, हालांकि 100% फोटोरिसेप्टर हटाने की गारंटी नहीं है। इसलिए जीन अभिव्यक्ति या प्रोटिओमिक्स अध्ययनों में विभाजित रेटिना का उपयोग करते समय सावधानी बरतने की सलाह दी जाती है जहां अवशिष्ट फोटोरिसेप्टर सामग्री परिणामों को प्रभावित कर सकती है। एकल सेल अनुप्रयोगों के लिए, यह चिंता अनुचित है, क्योंकि फोटोरिसेप्टर से डेटा को विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है।
विभाजित रेटिना तैयारी के फायदे शायद वाइड-फील्ड इंटरन्यूरॉन्स की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में सबसे प्रमुख हैं। जबकि पारंपरिक ऊर्ध्वाधर स्लाइस वाइड-फील्ड कोशिकाओं की व्यापक प्रक्रियाओं को अलग करते हैं, विभाजित रेटिना तैयारी ओपीएल और आईपीएल को बरकरार रखती है, जिससे एचसी24, ए 17 एस 25, टीएच एसी 26 और एनओएस -1 एसी27 जैसे वाइड-फील्ड कोशिकाओं से इनपुट कैप्चर करने की अनुमति मिलती है जो अन्यथा ऊर्ध्वाधर स्लाइस में अनदेखी की जाएगी। इसलिए, परिणामों की व्याख्या और रेटिना स्लाइस से एकत्र किए गए पिछले डेटा के साथ तुलना के लिए सावधानीपूर्वक विचार की आवश्यकता होती है। बहरहाल, प्रकाश उत्तेजना के औषधीय मिमिक्स का उपयोग करने वाले प्रयोगों में, ये परिणाम रेटिना स्लाइस19 से दर्ज किए गए डेटा से मिलते जुलते हैं। सेल-विशिष्ट प्रमोटरों के तहत सीएचआर 2 को व्यक्त करके, ऊर्ध्वाधर सूचना मार्ग पर वांछित सेल के प्रभाव की जांच करने के लिए आईएनएल में बीसी से रिकॉर्डिंग करते समय वांछित सेल आबादी को उत्तेजित किया जा सकता है। गहरे आईएनएल न्यूरॉन्स से सीधे रिकॉर्डिंग, जैसे कि एमोक्राइन कोशिकाएं, विभाजित रेटिना में भी संभव हैं। जबकि इस मामले में पैच इलेक्ट्रोड को पहले अधिक सतही आईएनएल न्यूरॉन्स के माध्यम से यात्रा करनी चाहिए, पारंपरिक पूरे माउंट तैयारी की तुलना में इसके मार्ग में बाधा डालने वाले काफी कम ऊतक हैं।
अन्य न्यूरॉन्स पर वाइड-फील्ड कोशिकाओं के प्रभाव को मापने के अलावा, यह विधि एचसी से सीधे एकल-सेल पैच क्लैंपिंग को सक्षम करती है, जिनके डेंड्राइट ओपीएल28 में एक व्यापक अंतर-जंक्शन युग्मित नेटवर्क बनाते हैं। क्षैतिज कोशिकाएं फोटोरिसेप्टर को महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया भेजती हैं जो रेटिना के माध्यम से ऊर्ध्वाधर जानकारी के संचरण को आकार देती हैं। हालांकि, चूंकि एचसी के डेंड्राइटिक क्षेत्रों को ऊर्ध्वाधर स्लाइस में काट दिया जाता है, इसलिए एकल सेल रिकॉर्डिंग डेटा की कमी होती है। यह काम शारीरिक और शारीरिक रूप से बरकरार एचसी प्रस्तुत करता है जिसमें से सीएचआर 2-इवोकेटेड धाराओं को ट्रिपल ट्रांसजेनिक माउस लाइन (चित्रा 6 सी-ई) में दर्ज किया जाता है। सीएचआर 2 उत्तेजना के बाहर, विभाजित रेटिना का उपयोग अंतर्जात एचसी धाराओं और गैप जंक्शन युग्मन28 का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि विभाजित रेटिना रासायनिक अनुप्रयोग या सीएचआर 2 उत्तेजना द्वारा प्रेरित सिनैप्टिक कनेक्टिविटी और न्यूरोनल गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल प्रदान करता है, फोटोरिसेप्टर की कमी प्राकृतिक प्रकाश प्रतिक्रियाओं या प्रकाश अनुकूलन तंत्र के किसी भी प्रत्यक्ष अन्वेषण को रोकती है।
रेटिना में सीटू इमेजिंग ने हाल के वर्षों में सराहनीय प्रगति की है। हालांकि, अधिकांश इमेजिंग अध्ययन पूरे माउंट रेटिना तैयारी29 में गैंग्लियन सेल परत तक सीमित हैं। लेखकों की कल्पना है कि विभाजित रेटिना में फोटोरिसेप्टर की अनुपस्थिति इसे ओपीएल और आईएनएल में लाइव कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक आदर्श मॉडल बना देगी। कैल्शियम इमेजिंग से परे, इस मॉडल में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर जैसे iGluSnFR30,31, iGABASnFR32, और pHluorin 33 के साथ उपयोग की बहुत संभावना है। विभाजित रेटिना तैयारी के साथ संयुक्त, ये शक्तिशाली उपकरण बीसी और एचसी के सिनैप्टिक इंटरैक्शन और बायोफिज़िकल गुणों की खोज के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं जो रेटिना में प्रकाश प्रसंस्करण में योगदान करते हैं।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम निम्नलिखित एनआईएच अनुदानों द्वारा समर्थित था: एनआईएच अनुदान R01EY031596 (सीएम को); एनआईएच अनुदान R01EY029985 (सीएम को); एनआईएच अनुदान P30EY010572 (सीएम को); एनआईएच अनुदान R01EY032564 (बीएस को)। हम रेटिना सेक्शन तैयार करने में उनके तकनीकी समर्थन के लिए टैमी हेली को धन्यवाद देते हैं, और डॉ चार्ल्स एलन इस काम में उपयोग किए जाने वाले एमआरएनए फिश जांच में उदारतापूर्वक योगदान देने के लिए।
Materials
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
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