Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano
Summary
Este protocolo demuestra el aislamiento de una sola fibra del músculo esquelético humano liofilizado y la clasificación del tipo de fibra de acuerdo con la isoforma de la cadena pesada de miosina (MHC) utilizando la técnica de transferencia de puntos. Las muestras de fibra MHC I y II identificadas se pueden analizar más a fondo para detectar diferencias específicas del tipo de fibra en la expresión de proteínas mediante Western blot.
Abstract
La técnica descrita aquí se puede utilizar para identificar isoformas específicas de la cadena pesada de miosina (MHC) en segmentos de fibras musculares individuales mediante transferencia de puntos, en lo sucesivo denominada detección de la cadena pesada de la osina mediante laasignación de Dot Bpara la entificación de IDdel tipo de fibra muscular (MyDoBID). Este protocolo describe el proceso de liofilización del músculo esquelético humano y el aislamiento de segmentos de fibras musculares individuales. Con MyDoBID, las fibras de tipo I y II se clasifican con anticuerpos específicos de MHCI y IIa, respectivamente. Luego, las fibras clasificadas se combinan en muestras específicas para cada tipo de fibra para cada biopsia.
La proteína total en cada muestra se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) y tecnología de gel activado por UV. El tipo de fibra de las muestras se valida mediante Western blot. También se describe la importancia de realizar la normalización de la carga de proteínas para mejorar la detección de proteínas diana a través de múltiples Western blots. Los beneficios de consolidar las fibras clasificadas en muestras específicas del tipo de fibra en comparación con las Western blots de una sola fibra, incluyen la versatilidad de la muestra, el aumento del rendimiento de la muestra, la menor inversión de tiempo y las medidas de ahorro de costos, todo mientras se conserva la valiosa información específica del tipo de fibra que con frecuencia se pasa por alto utilizando muestras musculares homogeneizadas. El propósito del protocolo es lograr una identificación precisa y eficiente de las fibras de tipo I y tipo II aisladas de muestras de músculo esquelético humano liofilizado.
Estas fibras individuales se combinan posteriormente para crear muestras específicas de tipo de fibra de tipo I y tipo II. Además, el protocolo se amplía para incluir la identificación de fibras de tipo IIx, utilizando Actina como marcador de fibras que fueron negativas para MHCI y MHCIIa, que se confirman como fibras IIx por Western blot. A continuación, se utiliza cada muestra específica de tipo de fibra para cuantificar la expresión de varias proteínas diana mediante técnicas de Western blot.
Introduction
El músculo esquelético es un tejido heterogéneo, con distintas propiedades celulares metabólicas y contráctiles que dependen de si la célula (fibra) es de contracción lenta (tipo I) o de contracción rápida (tipo II). El tipo de fibra se puede identificar examinando las isoformas de la cadena pesada de miosina (MHC), que difieren entre sí de varias maneras, incluido el tiempo de contracción, la velocidad de acortamiento y la resistencia a la fatiga1. Las principales isoformas del MHC incluyen el tipo I, el tipo IIa, el tipo IIb y el tipo IIx, y sus perfiles metabólicos son oxidativos (tipo I y IIa) o glucolíticos (IIx, IIb)1. La proporción de estos tipos de fibra varía según el tipo de músculo y entre especies. El tipo IIb se encuentra ampliamente en el músculo de los roedores. Los músculos humanos no contienen fibras de tipo IIb y consisten predominantemente en isoformas MHC de fibras de tipo I y IIa, con una pequeña proporción de fibras IIx2. Los perfiles de expresión de proteínas varían entre los diferentes tipos de fibra y pueden alterarse con el envejecimiento3, el ejercicio 4,5 y la enfermedad 6.
La medición de las respuestas celulares en diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas a menudo se pasa por alto o no es posible debido al examen de los homogeneizados musculares (una mezcla de todos los tipos de fibras). El Western blot de una sola fibra permite la investigación de múltiples proteínas en fibras musculares individuales7. Esta metodología se ha utilizado previamente para producir características novedosas e informativas de una sola fibra que no eran posibles de obtener utilizando preparaciones homogeneizadas. Sin embargo, existen algunas limitaciones de la metodología original de Western blot de una sola fibra, incluida la naturaleza que consume mucho tiempo, la incapacidad de generar réplicas de muestras y el uso de reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) costosos y sensibles. Si se utiliza tejido fresco, este método se limita aún más debido a las limitaciones de tiempo de la necesidad de aislar fibras individuales dentro de un período de tiempo limitado (es decir, 1-2 h). Afortunadamente, esta restricción se mitiga aislando segmentos de una sola fibra del tejido liofilizado8. Sin embargo, la recolección de fibras de muestras liofilizadas está limitada por el tamaño y la calidad del tejido biopsiado.
La identificación del tipo de fibra mediante el método de transferencia de puntos9 se ha desarrollado y ampliado significativamente en este protocolo integral. Anteriormente, se ha demostrado que tan solo ~ 2-10 mg de tejido muscular de peso húmedo es adecuado para la liofilización y el análisis de proteínas isoformadas de MHC de fibraúnica 9. Christensen et al.9 utilizaron el 30% de un segmento de fibra de ~1 mm para detectar la isoforma MHC presente por transferencia de puntos, lo que se confirmó mediante Western blot. Este trabajo mostró que al sustituir la Western blot por la transferencia de puntos, los costos generales se redujeron en ~ 40 veces (para 50 segmentos de fibra). A continuación, las fibras se “agruparon” en muestras de tipo I y II, lo que permitió la replicación experimental9. Sin embargo, una limitación fue que solo se obtuvieron dos muestras específicas para cada tipo de fibra: tipo I (fibras MHCI positivas) y tipo II (fibras MHCII positivas), con muestras de tipo II que contenían una mezcla de MHCIIa y MHCIIx 6,10. En particular, el protocolo actual demuestra cómo se pueden identificar las fibras puras de tipo IIx y proporciona un flujo de trabajo muy detallado (resumido en la Figura 1), incluidas las estrategias de solución de problemas para problemas comunes del protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recolección de fibra
Sobre la base de varios años de experiencia, la mayoría de los investigadores pueden dominar esta técnica; Sin embargo, la práctica conduce a una recolección de fibra más rápida y eficiente para los análisis posteriores. Para poder aislar 30 segmentos de fibra individuales de una calidad para agrupar, se recomienda recolectar 50 segmentos de fibra por muestra. Se recomienda estudiar cuidadosamente el video de recolección de fibras y después de realizar dos sesiones de p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los anticuerpos contra MHC I (A4.840) y MHCIIa (A4.74) utilizados en este estudio fueron desarrollados por el Dr. H. M. Blau y el anticuerpo contra MHCIIx (6H1) fue desarrollado por el Dr. C. A. Lucas y obtenido del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB), gracias a los auspicios del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano y mantenido por la Universidad de Iowa. Departamento de Ciencias Biológicas (Iowa City, IA). Agradecemos a Victoria L. Wyckelsma por proporcionar las muestras de músculo humano para este estudio. La mayoría de las imágenes de la Figura 1 provienen de BioRender.com.
Financiación:
Este estudio no recibió financiación externa.
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
Referências
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