JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

Published: October 27, 2023
doi:
10.3791/65733
, , , ,
1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development,NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering,NIH

Summary

يمكن أن يكون التلاعب البصري الوراثي لمسارات الإشارات استراتيجية قوية للتحقيق في كيفية فك تشفير الإشارات في التطور والتجديد والتوازن والمرض. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عملية لاستخدام منشطات إشارات البروتين العقدي ومورفوجينيك (BMP) القائم على مجال استشعار الجهد الخفيف والأكسجين في جنين الزرد المبكر.

Abstract

تنظم مسارات الإشارات العمليات البيولوجية الأساسية ، بما في ذلك التطور والتجديد والتوازن والمرض. هناك حاجة إلى طرق لمعالجة الإشارات تجريبيا لفهم كيفية تفسير الإشارات في هذه السياقات واسعة النطاق. يمكن أن توفر الأدوات البصرية الوراثية الجزيئية معالجات عكسية وقابلة للضبط لنشاط مسار الإشارات بدرجة عالية من التحكم الزماني المكاني وقد تم تطبيقها في المختبر وخارج الجسم الحي وفي الجسم الحي. تجمع هذه الأدوات بين مجالات البروتين المستجيبة للضوء ، مثل مجال استشعار جهد الأكسجين والأكسجين الضوئي (LOV) للضوء الأزرق ، مع مستجيبات الإشارات لمنح التحكم التجريبي المعتمد على الضوء في الإشارات. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عملية لاستخدام البروتين المورفولوجي العظمي القائم على LOV(BMP) ومنشطات الإشارات العقدية bOpto-BMP و bOpto-Nodal في جنين الزرد المبكر الذي يمكن الوصول إليه بصريا. يصف تجربتين تحكميتين: مقايسة النمط الظاهري السريع لتحديد الظروف التجريبية المناسبة ، ومقايسة التألق المناعي لتقييم الإشارات مباشرة. معا ، يمكن أن تساعد تجارب التحكم هذه في إنشاء خط أنابيب لاستخدام أدوات علم البصريات الوراثية في أجنة الزرد المبكرة. توفر هذه الاستراتيجيات منصة قوية للتحقيق في أدوار الإشارات في التنمية والصحة وعلم وظائف الأعضاء.

Introduction

تسمح مسارات الإشارات للخلايا بالاستجابة لبيئتها وتنسيق الأنشطة على نطاق الأنسجة والكائنات الحية. تشمل الإشارات الحاسمة للتطور الجنيني البروتين المورفولوجي العظمي لأعضاء عائلة TGF-beta الفائقة (BMP) والعقدي1،2،3. أثناء التطور الجنيني ، تقوم المسارات التي تنظمها هذه الإشارات وغيرها بتصميم خطة الجسم من خلال التحكم في التعبير الجيني والعمليات الإضافية لضمان تطور الأنسجة والأعضاء المتنوعة والتفاعل بشكل صحيح. يمكن أن تحدث الأمراض ، بما في ذلك العيوب الخلقية والسرطان ، عندما تكون الإشارات أو الاستجابات للإشارة مضطربة4،5،6،7. على الرغم من التحقيق الدقيق في الإشارات ، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين اكتشافه حول كيفية فك تشفير المستويات والديناميكيات في مجموعة متنوعة من السياقات8،9،10،11 ، خاصة أثناء التطوير 12،13،14،15،16،17،18،19.

لفهم كيفية فك تشفير الإشارات ، ستكون التجربة المثالية هي معالجة مستويات الإشارات والتوقيت و / أو الديناميات – بدرجة عالية من التحكم المكاني والزماني – وتقييم النتائج. على سبيل المثال ، تم اقتراح تدرجات الإشارات المكانية الدقيقة لنمط الأنسجة النامية20،21. سيساعد تغيير التوزيعات المكانية المتدرجة للإشارات في اختبار هذه الفرضية22. بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت أهمية ديناميكيات الإشارات في توليد استجابات خلوية متنوعة أكثر وضوحا: يمكن لمسار الإشارات نفسه أن يوجه الخلايا إلى التمايز أو التكاثر اعتمادا على تردد الإشارة ، على سبيل المثال 9,23. ستكون النماذج التجريبية التي يمكن من خلالها التلاعب بديناميكيات الإشارات بسهولة ذات قيمة لاستكشاف العلاقة بين الديناميات وقرارات مصير الخلية8،12،13،14،15.

تاريخيا ، تم استخدام طرق متعددة لمعالجة الإشارات في السياقات التنموية ، مما أدى إلى اكتشافات أساسية1،2،3. يمكن حظر الإشارات باستخدام طفرات فقدان الوظيفة في المسار أو تعبير مثبط خارج الرحم أو الأدوية المضادة. تشمل طرق تنشيط الإشارات الأدوية الناهضة ، والروابط المؤتلفة ، والتعبير خارج الرحم للروابط أو المستقبلات النشطة بشكل أساسي ، ومثبطات المسار التي تفقد وظيفتها. تتراوح هذه الطرق على طول سلسلة متصلة من التحكم التجريبي. على سبيل المثال ، قد تقع الطفرات والتعبير خارج الرحم على جانب المطرقة الثقيلة من السلسلة المتصلة: مع هذه الأساليب ، قد تتسبب التغييرات الدراماتيكية والنظامية في نشاط المسار في الوفاة المبكرة وتمنع التحقيقات في مراحل لاحقة ، أو بمرور الوقت قد تؤدي إلى تأثيرات متعددة الاتجاهات يصعب فصلها. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون من الصعب التعامل بشكل مستقل مع ميزة إشارة واحدة في كل مرة ، مثل المستوى أو المدة. نحو الطرف الآخر من السلسلة المستمرة ، تقدم بعض الطرق تحكما تجريبيا أكثر دقة ، مثل أجهزة الموائع الدقيقة التي تعرض العينات للأدوية أو البروتينات المؤتلفة مع التحكم الزماني وأحيانا المكاني18،24،25 ، أو الطرق الجينية ، بما في ذلك المحفزات المسببة للصدمة الحرارية والأنسجة الخاصة التي يمكن أن تقدم فوائد مماثلة16،26،27. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ هذه الطرق ، وقد لا تكون قابلة للعكس ، وقد يكون لها حركية بطيئة نسبيا أو دقة ضعيفة ، وقد لا تكون متوفرة في بعض أنظمة النماذج.

تعد الأساليب البصرية الجينية الجزيئية إضافة قوية لمجموعة الأدوات هذه. تستخدم هذه الأساليب البروتينات التي تستجيب لأطوال موجية ضوئية مختلفة لمعالجة العمليات البيولوجية ، بما في ذلك الإشارات8،12،13،14،15 ، وقد تم تطويرها على مدى عقود لاستخدامها في مجموعة متنوعة من الأنظمة من زراعة الخلايا إلى الكاملة12،13،28. بالمقارنة مع الأساليب التاريخية ، يمكن أن يوفر علم البصريات الجزيئي الوراثي في كثير من الأحيان درجة أعلى من التحكم الزماني المكاني في العمليات البيولوجية: وحدة التحكم في الأنظمة البصرية الوراثية هي الضوء ، والتحكم في الطول الموجي للضوء وشدته ومدته وتكرار التعرض واضح نسبيا. مع أنظمة متطورة مثل المجاهر البؤرية والفوتونية ، يمكن التحكم المكاني في النطاق تحت الخلوي29،30،31. وقد تم تطوير وتطبيق أدوات لمعالجة الإشارات بصريا في العديد من النظم، بما في ذلك تلك الموصوفة في Johnson et al.22 و Čapek et al.32 و Krishnamurthy et al.33 و Huang et al.34. على سبيل المثال ، باستغلال التحكم المكاني الذي يوفره علم البصريات الوراثي ، تم استخدام هذه الاستراتيجية مؤخرا لتعديل تدرج الإشارات في أجنة ذبابة الفاكهة ، مما يدل على أن التطور الجنيني للذباب قوي بشكل مدهش للتغيرات في هذاالتدرج 22. كما أن قابلية الانعكاس وحركية التشغيل / الإيقاف السريعة لمنشطات الإشارات البصرية الجينية جعلتها أيضا أدوات جذابة للتحقيق في فك تشفير ديناميكيات الإشارات8،12،13،14،15،34،35،36.

جنين الزرد المبكر هو نظام في الجسم الحي مناسب تماما للدراسات الوراثية البصرية لأنه مخصب خارجيا وشفاف وصديق للفحص المجهري وقابل للتتبع وراثيا. يسهل توصيل التعرض للضوء إلى الأجنة التي تتطور خارج الأم ، ويمكن للضوء اختراق أنسجتها غير المعتمة والوصول إليها ، وتتحمل أجنة الزرد الحية التصوير جيدا (بالإضافة إلى كونها شفافة) ، وتوفر الطرق الجينية الحالية فرصا مباشرة لتجارب الضربة القاضية والإفراط في التعبير ، بالإضافة إلى تطوير علم الجينات المحورة المفيدة37.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير أدوات علم البصريات الوراثية لتنشيط إشارات BMP38 وNodal 39 في أجنة الزرد مع التعرض للضوء الأزرق (الشكل 1). نشير إلى هذه الأدوات باسم bOpto-BMP و bOpto-Nodal (b للضوء الأزرق المنشط و Opto للبصريات الوراثية). يعتمد bOpto-BMP / Nodal على آليات تنشيط مسار مماثلة. يؤدي ارتباط BMP أو الروابط العقدية بمستقبلاتها سيرين ثريونين كينازات إلى تفاعلات مجال مستقبلات كيناز التي تؤدي إلى فسفرة مستجيبات الإشارة (Smad1/5/9 ل BMP و Smad2/3 للعقدي). ثم تنتقل مستجيبات الإشارات المفسفرة إلى النواة وتنظم التعبير الجيني المستهدف3 (الشكل 1 أ ، د). يمكن جعل تفاعلات كيناز المستقبلات هذه مستجيبة للضوء عن طريق اقتران كينازات المستقبلات ببروتينات مثبطة مستجيبة للضوء: مع التعرض للضوء ، يجب أن تتلاشى هذه البروتينات الخيمرية ، مما يتسبب في تفاعل مجالات مستقبلات كيناز وتنشيط الإشارات (الشكل 1B ، C ، E ، F). الأهم من ذلك ، على عكس المستقبلات الداخلية ، لا يحتوي bOpto-BMP / Nodal على مجالات ربط ليجند خارج الخلية ، مما يضمن نشاطا مستقلا عن الليجند (الشكل 1C ، F). تم تحقيق استراتيجية التنشيط البصري هذه لأول مرة باستخدام مستقبلات التيروزين كينازات40،41،42 ثم تم تطبيقها على مستقبلات كينازات سيرين ثريونين.

يستخدم bOpto-BMP / Nodal مجال استشعار جهد الأكسجين الضوئي (LOV) المستجيب للضوء الأزرق (~ 450 نانومتر) من بروتين الطحالب Vaucheria fridiga AUREO1 (VfLOV) 43,44. تتكون هذه التركيبات من شكل myristoylation يستهدف الغشاء متبوعا إما بمجالات كيناز مستقبلات BMP أو العقدية ، مدمجة في مجال LOV (الشكل 1B ، E). يجب أن يتسبب التعرض للضوء الأزرق في تجانس LOV ، مما يؤدي إلى تفاعلات مجال مستقبلات كيناز تؤدي إلى فسفرة Smad وتنشيط المسار (الشكل 1C ، F). بالنسبة ل bOpto-BMP ، تم العثور على مزيج من التركيبات مع مجالات كيناز مستقبلات النوع الأول من Acvr1l (المعروف أيضا باسم Alk8) و BMPR1aa (المعروف أيضا باسم Alk3) ومجال كيناز مستقبلات النوع الثاني من BMPR2a لتنشيط الإشارات38 على النحو الأمثل (Addgene # 207614 و # 207615 و # 207616). بالنسبة إلى bOpto-Nodal ، يتم استخدام مزيج من التركيبات مع مجال كيناز مستقبلات النوع الأول من Acvr1ba ومجال كيناز مستقبلات النوع الثاني من Acvr2ba39.

تم إدخال bOpto-BMP / Nodal في أجنة الزرد المبكرة عن طريق حقن mRNA في مرحلة الخلية الواحدة ، واستخدم للتحقيق في دور مدة الإشارة في التفسير العقدي39 ، لتحديد سبب فقدان الزرد القدرة على الاستجابة للعقد45 ، وفحص كيفية استجابة الجينات المستهدفة BMP لمستويات إشارات BMP المختلفة38. ومن المرجح أن تظل هذه الأدوات مفيدة في مجموعة متنوعة من التحقيقات المستقبلية. ومع ذلك ، فإن قوة منشطات الإشارات الضوئية الجينية هي أيضا ضعفها: يجب معالجة العينات الحساسة للضوء بعناية لتجنب نشاط الإشارات خارج الرحم غير المقصود. يمكن أن يؤدي التعرض لضوء الغرفة أو أشعة الشمس إلى تنشيط bOpto-BMP / Nodal.

يقدم هذا البروتوكول اقتراحات عملية لاستخدام منشطات BMP والعقدية المستندة إلى الحمض النووي الريبوزي المرسال (LOV) في أجنة الزرد المبكرة. يبدأ بتفصيل استراتيجية واحدة لبناء صندوق إضاءة للتحكم في التعرض المنتظم للضوء ودرجة الحرارة (الشكل 2 ، الملف التكميلي 1 ، الملف التكميلي 2 ، الملف التكميلي 3 ، الملف التكميلي 4 ، الملف التكميلي 5 ، الملف التكميلي 6 ، الملف التكميلي 7 ، الملف التكميلي 8). ثم يصف تجربتين تحكمين رئيسيتين تحددان ما إذا كان منشط الإشارات البصرية الوراثية يتصرف كما هو متوقع – أي تنشيط نشاط المسار فقط عند تعرضه للضوء (الشكل 3). يتضمن اختبار التحكم الأول فحص الأنماط الظاهرية في يوم واحد بعد الإخصاب في الأجنة المعرضة للضوء وغير المعرضة (الشكل 3 أ). يجب على الأجنة المعرضة للضوء المحقونة بالحمض النووي الريبوزي المرسال ، ولكن ليس الأجنة غير المعرضة ، أن تنسخ الفينو BMP أو الإفراط في التعبير العقدي (الشكل 4 أ ، ب ؛ يمكن تمييز الأنماط الظاهرية BMP على وجه الخصوص بوضوح في هذه النقطةالزمنية 46). يوفر هذا الفحص قراءة سريعة للنشاط. في اختبار التحكم الثاني ، لتحديد ما إذا كانت الأنماط الظاهرية ناتجة على وجه التحديد عن BMP الزائد أو الإشارات العقدية ولمراقبة التغير في مستويات الإشارات بشكل مباشر ، يتم استخدام تلطيخ التألق المناعي للكشف عن مستجيبات الإشارات المفسفرة (pSmad1/5/9 أو pSmad2/3 ، على التوالي) بعد التعرض للضوء لمدة 20 دقيقة حول مرحلة البلاستولا المتأخرة / المعدة المبكرة ، عندما تم وصف نشاط الإشارة جيدا12 ، 16،17،47،48،49،50 (الشكل 3 ب والشكل 4 ج). (لاحظ أنه على الرغم من إثبات التنشيط الموضعي مكانيا لكل من bOpto-BMP38 و bOpto-Nodal39 ، فإن هذا البروتوكول يصف فقط التعرض للضوء الموحد واستراتيجيات تنشيط الإشارات.) ينصح بإجراء تجارب التحكم هذه قبل تطبيق bOpto-BMP / Nodal على أسئلة بحثية محددة من أجل تحديد الظروف التجريبية المحلية المثالية.

Protocol

تمت مراجعة بروتوكولات أبحاث الزرد والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام NICHD في المعاهد الوطنية للصحة (ASP 21-008). أجريت جميع دراسات الزرد وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر. 1. بناء صندوق الضوء للتحكم في التعرض للضوء ودرجة الحرارة ، قم ببناء صندوق إضاءة يستخدم مصباح الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) كمصدر للضوء (الشكل 2 أ ، جدول المواد ، الملف التكميلي 1 ، الملف التكميلي 2). يوفر هذا المصباح القابل للتخصيص تحكما ديناميكيا وقابلا للبرمجة على أطوال موجية متعددة.ملاحظة: هناك العديد من الاستراتيجيات الممكنة لبناء صندوق ضوئي ، وقد يكون النهج البديل أكثر ملاءمة (انظر على سبيل المثال ، Gerhardt et al.51 و Bugaj et al.52 و Kumar and Khammash 53 والمزيد في https://www.optobase.org/materials/). قم بتضمين الميزات التالية في صندوق الضوء: التحكم في درجة الحرارة (28 درجة مئوية مثالية لأجنة الزرد) ، واستبعاد الضوء غير المرغوب فيه (على سبيل المثال ، ضوء الغرفة وضوء الشمس) ، والتوصيل الموحد للضوء الأزرق الذي يغطي المنطقة المستهدفة (على سبيل المثال ، لوحة 6 آبار) ، والتحكم في شدة الضوء وديناميكيات التعرض.ملاحظة: يتم تنشيط bOpto-BMP / Nodal بواسطة الضوء الأزرق ، لكن بعض الأدوات البصرية الوراثية تستجيب للأطوال الموجية الأخرى. استخدم الطول الموجي المناسب للأداة البصرية الوراثية. احفر حفرة في الجزء العلوي من الحاضنة (الشكل 2 ب) أعرض قليلا من عدسة إخراج LED.تأكد من عدم وجود مكونات كهربائية في الجزء العلوي من الحاضنة سيتم تدميرها عن طريق الحفر (جدول المواد). يمكن التأكد من ذلك عن طريق الاتصال بالشركة المصنعة للحاضنة والسؤال مباشرة. إذا كان هناك ثقب موجود على اللوحة العلوية للحاضنة ، فاستخدم مثقابا متدرجا لزيادة حجم الثقب إلى 1.25 بوصة. خلاف ذلك ، استخدم منشارا ثقبا مقاس 1.25 بوصة مع شجرة. إذا كانت هناك ألواح داخلية تحجب مصدر الضوء ، فقم بحفر حجم الفتحة المناسب لضمان عدم انسداد مخروط الضوء (الشكل 2 أ). عادة ما تكون الألواح مصنوعة من صفائح معدنية رقيقة ، لذا استخدم سرعات بطيئة ولقم ثقب معدنية لمنع التلف (يوصى باستخدام مثقاب الكوبالت). قم ببناء حامل LED لتثبيت مصباح الصفيحة الدقيقة LED في الجزء العلوي من الحاضنة (الشكل 2C ، الملف التكميلي 3 ، الملف التكميلي 4 ، الملف التكميلي 5 ، الملف التكميلي 6 ، الملف التكميلي 7 ، الملف التكميلي 8).قم بتركيب أربعة مواجهات مكعب M3 على قطعة القوس الرأسي باستخدام مسامير M3. قم بتوصيل القوسين الجانبيين على يسار ويمين مواجهات مكعب القوس الرأسي. قم بتركيب مواجهة مكعب آخر على الفتحة المتبقية على الأقواس الجانبية. قم بتركيب قطعة القوس الرأسي على مجموعة إضاءة الصفائح الدقيقة LED (جدول المواد) باستخدام مسامير M6. ضع حشية عدسة LED فوق عدسة نظام LED. قم بتركيب القطع المجمعة على حامل لوحة الحاضنة ، ثم على مواجهات M3 على الأقواس الرأسية والجانبية. ضع حشية الحاضنة فوق الفتحة المحفورة أعلى الحاضنة. ضع حامل لوحة الحاضنة أعلى حشية الحاضنة ، مما يضمن أن فتحات الحشية واللوحة متحدة المركز مع فتحة الحاضنة. قم بتركيب اللوحة على سطح الحاضنة باستخدام مسامير رقم 8. تأكد من أن هذا الختم محكم الغلق. ضع صفيحة من 6 آبار على الرف العلوي للحاضنة. حدد ما إذا كان شعاع الضوء يغطي اللوحة بشكل موحد (الشكل 2 أ). استخدم ورقة لتصور تغطية الضوء. إذا لم تكن اللوحة بأكملها مغطاة بالشعاع ، فقم بزيادة المسافة بين LED واللوحة عن طريق تحريك الرف لأسفل. بالنسبة للنظام الموضح هنا ، يكفي ~ 14 بوصة بين LED والرف. استخدم مقياس الضوء لتحديد مستوى الإشعاع والتوحيد المكاني (جدول المواد). لتجنب أشعة الشمس غير المقصودة والتعرض لضوء الغرفة ، استخدم تجريد الطقس للتأكد من أن باب الحاضنة محكم للضوء (الشكل 2 أ). تتطور أجنة الزرد بقوة عند 28 درجة مئوية54. استخدم مقياس حرارة بطاقة الذاكرة للتأكد من أن صندوق الضوء يستوعب 28 درجة مئوية. 2. توليد mRNA للحقن ملاحظة: pCS2 + هو العمود الفقري المتجه لبنيات bOpto-BMP38 و bOpto-Nodalيبني 39. هذا الناقل مقاوم للأمبيسيلين. يتكون bOpto-BMP من ثلاثة تركيبات (الشكل 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): مجال كيناز مفترض لمستقبلات BMPR1aa من النوع الأول (المعروف أيضا باسم Alk3) تنصهر مع LOV. Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): مجال كيناز مفترض لمستقبلات Acvr1l من النوع الأول (المعروف أيضا باسم Alk8) ينصهر مع LOV. و BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): مجال كيناز مفترض لمستقبلات BMPR2a من النوع الثاني والمجال الطرفي C التالي المنصهر مع LOV. يتكون bOpto-Nodal من بنيتين (الشكل 1E): Acvr1ba-LOV: مجال كيناز مفترض من النوع الأول لمستقبلات Acvr1ba (المعروف أيضا باسم Acvr1b) ينصهر مع LOV. Acvr2ba-LOV: مجال كيناز مفترض لمستقبلات Acvr2ba من النوع الثاني (المعروف أيضا باسم Acvr2b) يندمج مع LOV. لخطي البلازميدات ، هضم ما بين 2-5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد باستخدام إنزيم تقييد NotI عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعات (جدول المواد).ملاحظة: من الممكن أيضا إنشاء حمض نووي خطي باستخدام البلازميد كقالب PCR. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية قياسية قائمة على العمود (جدول المواد). استخدم مجموعة نسخ SP6 في المختبر مثل مجموعة mMessage mMachine لنسخ الحمض النووي الريبي من القالب الخطي (جدول المواد). قم بإعداد تفاعلين وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لضمان عائد أعلى. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي القياسية القائمة على العمود (جدول المواد). من الممكن أيضا التنقية عن طريق هطول الأمطار. 3. حقن الحمض النووي الريبوزي المرسال على الأقل 1 يوم قبل الحقن ، وجعل أطباق الحقن وألواح 6 بئر المغلفة بالأغاروز.تحضير 200 مل من 1٪ أغاروز في وسط جنين الزرد والميكروويف حتى يذوب الأغاروز تماما. يجب أن يكون أي وسيط جنين قياسي لسمك الزرد مقبولا ؛ ومع ذلك ، استبعد أزرق الميثيلين من وسط الجنين لأنه يمكن أن يؤثر على التصوير النهائي في التطبيقات الأخرى. صب بعناية الأغاروز المنصهر في أطباق بتري بلاستيكية 100 مم × 15 مم. املأ الأطباق في منتصف الطريق. اشطف قالب طبق الحقن بوسط الجنين وضعه برفق على الأغاروز المنصهر ، مع ضمان عدم وجود فقاعات محاصرة بين القالب والأغاروز. استخدم الشريط لعمل علامة تبويب على الجزء الخلفي من القالب لسهولة وضعها واسترجاعها. يجب أن يطفو القالب في الأغاروز المنصهر. إذا غرق القالب ، أخرجه بعناية من الأغاروز المنصهر وكرر الخطوة 3.1.3. بعد أن يصلب الأغاروز ، استخدم علامة التبويب لإزالة القالب برفق. يمكن تسريع ذلك عن طريق وضع الطبق عند 4 درجات مئوية. اصنع ألواح 6 آبار مطلية بالأغاروز إذا كنت تعمل مع أجنة منزوع الأيونات لتجارب التألق المناعي. استخدم ماصة بلاستيكية سعة 10 مل يمكن التخلص منها لنقل ما يكفي من الأغاروز المنصهر لتغطية قاع كل بئر من صفيحة 6 آبار. قم بتخزين أطباق الحقن وأطباق 6 آبار على حرارة 4 درجات مئوية. يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها حتى يجف الأغاروز أو يتلوث (عادة 2-3 أسابيع). قم بإعداد أطراف ماصة زجاجية ملتهبة إذا كنت تعمل مع أجنة منزوع الأيونات لتجارب التألق المناعي. أدخل نهاية الماصة الزجاجية في لهب موقد بنسن وقم بتدويرها باستمرار حتى تصبح الحواف ناعمة. يجب أن تتناسب الأجنة المنزوعة الأيونات بشكل مريح مع نهاية الماصة. لا تسمح للفتحة بالانكماش تحت قطر الجنين. إما شراء أو سحب إبر الحقن المجهري (جدول المواد). من المستحسن أن يكون لديك إبر إضافية متاحة في يوم الحقن في حالة ضرورة الاستبدال. في اليوم السابق للحقن ، قم بإعداد مربي الزرد وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للمعهد (SOPs). الحفاظ على الذكور والإناث منفصلة.قم بتشغيل منظم درجة حرارة صندوق الضوء للحفاظ على 28 درجة مئوية. لضمان بقاء درجة حرارة صندوق الضوء عند 28 درجة مئوية ، راقب درجة الحرارة باستخدام مقياس حرارة بطاقة الذاكرة (جدول المواد). تحضير مزيج (خلطات) حقن mRNA. حقن كميات متساوية من كل بناء. من الضروري تحديد كمية الحقن تجريبيا. أحجام نسخة bOpto-BMP هي كما يلي:Acvr1l-LOV = 2007 نيوكليوتيدات (nt)BMPR1aa-LOV = 1983 ntBMPR2a-LOV = 3409 طن متري لحقن كميات متساوية المولية ، قم بحقن 1.01x أكثر من بنية Acvr1l من BMPR1aa ؛ حقن 1.72x أكثر من بنية BMPR2a من BMPR1aa. أحجام النصوص العقدية هي كما يلي:Acvr1ba-LOV و Acvr2ba-LOV كلاهما 1962 nt. لحقن كميات متساوية المولية ، قم بحقن نفس الكمية من كل بناء. تحضير خلطات الحقن المتساوية المولية ، والجمع بين جميع mRNAs التي تستهدف مسارا واحدا في مزيج حقن واحد. قم بتضمين مادة الفينول الحمراء لتتبع الحقن إذا رغبت في ذلك. بالنسبة للبيانات الموضحة في الشكل 4 ، تم استخدام 15 pg من كل بنية bOpto-Nodal (Acvr1ba-LOV و Acvr2ba-LOV) ، وبالنسبة ل bOpto-BMP 7.8 pg Acvr1l-LOV و BMPR1aa-LOV ، و 13.4 pg BMPR2a-LOV تم استخدامه. يمزج الحقن المخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. بمجرد تحديد التركيز الأمثل لمزيج الحقن ، قم بعمل 5-10 ميكرولتر من القسامات وتخزينها عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. يوم الحقنفي حالة إجراء اختبار التنميط الظاهري (الشكل 3 أ) ، قم بالحقن من خلال المشيم مباشرة في مركز الخلية في مرحلة الخلية الواحدة وفقا ل SOP الخاص بمختبرك. يحمي المشيم الأجنة من الضغوطات البيئية ويحافظ على احتواء الأجنة المحللة. هذا مفيد أثناء التسجيل للقياس الكمي الدقيق للأجنة المحللة (الشكل 4 أ ، ب). في حالة إجراء مقايسة التألق المناعي (الشكل 3 ب) ، ستحتاج الأجنة في النهاية إلى إزالة الأجنة للتصوير (الشكل 4C). لذلك ، حقن مباشرة في مركز خلية الأجنة منزوع الأيون في مرحلة الخلية الواحدة (انظر Rogers et al.55 لبروتوكول إزالة الأجنة). بدلا من ذلك ، يمكن إزالة الأجنة يدويا بعد التثبيت ، ولكن هذا أكثر تعقيدا من إزالة الأجنة باستخدام البروناز. استخدم الماصات الزجاجية الملتهبة للتعامل مع الأجنة المفككة (الخطوة 3.1.10). احرص على عدم تعريض الأجنة المنزوعة الأيونات للهواء أو البلاستيك ، مما يؤدي إلى تحلل الأجنة. تعامل مع الأجنة المنزوعة الأيونات بلطف. قم بإعداد طبق إضافي من الأجنة غير المحقونة كبديل لتقييم تقدم المرحلة (انظر الخطوة 4.3.5). تأكد من أن الأجنة الوكيلة هي من نفس مجموعة الأجنة التجريبية ، بحيث تم تخصيب جميع الأجنة في نفس الوقت من نفس الوالدين. هذا مفيد لمقايسة التألق المناعي حيث تكون المرحلة ذات صلة ولكنها غير ضرورية لمقايسة التنميط الظاهري. استخدم الشروط التالية لكل من فحوصات التنميط الظاهري والتألق المناعي: 1) غير محقون ، غير مكشوف ، 2) غير محقون ، معرضون للضوء ، 3) محقونون ، غير مكشوف ، 4) محقون ، معرضون للضوء. حدد ما لا يقل عن 30 جنينا لكل حالة. للحصول على صحة الجنين المثلى ، لا تحتضن أكثر من 30 جنينا لكل بئر في لوحة من 6 آبار. بعد الحقن ، انقل الأجنة إلى أطباق بتري الموسومة أو ألواح 6 آبار مغطاة بالأغاروز (للأجنة المنزوع الأيوان) واحتضانها عند 28 درجة مئوية. الأجنة ليست حساسة للضوء بعد. تعامل مع الأجنة المحقونة كما لو كانت حساسة للضوء بعد 1.5 ساعة من الإخصاب (HPF). 4. تجربة التعرض للضوء ملاحظة: التعرض لضوء ~ 450 نانومتر مع إشعاع 45 واط / م2 ينشط بقوة bOpto-BMP / Nodal بدون سمية ضوئية واضحة (للحصول على معلومات حول مقياس الضوء ، انظر جدول المواد). يمكن ضبط مستوى الإشارات المنشطة بصريا عن طريق تغيير قيم الإشعاع38. ومع ذلك ، يجب تقييم السمية الضوئية عند الإشعاعات الأعلى. خطوة حساسة للوقت. في المرحلة من 4 إلى 16 خلية ، حوالي 1.5 hpf ، قم بإزالة الأجنة غير المخصبة وغير الصحية. إعادة التوزيع إذا لزم الأمر لضمان نفس عدد الأجنة في كل بئر (لا يزيد عن 30).ملاحظة: من المهم تنفيذ هذه الخطوة حول المرحلة المكونة من 4 إلى 16 خلية لأن الأجنة ستصبح حساسة للضوء حيث يتم ترجمة mRNA المحقون إلى بروتين. لم نلاحظ دليلا على أن الأجنة حساسة للضوء بشكل كبير قبل 1.5 hpf. لتقليل التنشيط الضوئي غير المقصود في حالة تقييم الأجنة بعد 1.5 hpf ، استخدم الأضواء الحمراء ، أو قم بتغطية مصادر الضوء – بما في ذلك مراحل المجهر – بورق ترشيح هلام أحمر يمنع الأطوال الموجية الزرقاء الباهتة LOV.تقييم الأجنة باستمرار لضمان توزيعات غير متحيزة بين الظروف والتجارب. بالنسبة لفحص التنميط الظاهري ، استخدم بروتوكول التعرض للضوء التالي لمدة يوم واحد بدءا من 1.5 hpf (الشكل 3A).لف لوحة التحكم غير المكشوفة بورق الألمنيوم. يجب أن تشمل هذه اللوحة كلا من الأجنة غير المحقونة والمحقونة. تأكد من تغطية اللوحة بالكامل واحرص على عدم إدخال الدموع في ورق القصدير. ضع هذه اللوحة على الرف السفلي لصندوق الإضاءة 28 درجة مئوية (الشكل 2 أ). ضع اللوحة المكشوفة على الرف العلوي لصندوق الإضاءة 28 درجة مئوية (الشكل 2 أ). تأكد من وجود الغطاء على الطبق لتجنب تبخر وسط الجنين. قم بتشغيل الضوء الأزرق (إشعاع 45 واط / م2 ينشط الإشارة بقوة). أغلق باب صندوق الضوء لتجنب التعرض غير المقصود لضوء الغرفة. إذا رغبت في ذلك ، قم بتضمين مقياس حرارة بطاقة الذاكرة داخل صندوق الضوء قبل إغلاق الباب. لا تفتح الباب حتى يتم تسجيل النمط الظاهري في يوم واحد بعد الإخصاب (dpf ؛ انظر الخطوة 5.1). بالنسبة لمقايسة التألق المناعي ، قم بتعريض الأجنة للضوء الأزرق لمدة 20 دقيقة بدءا من حوالي 40٪ epiboly56 (~ 6 hpf) والإصلاح فورا بعد التعرض للضوء ، جنبا إلى جنب مع عناصر التحكم غير المكشوفة (الشكل 3B). يؤدي التعرض للضوء الأزرق لمدة 20 دقيقة عند إعادة إنتاج 40٪ إلى تنشيط الإشارات.حوالي 1.5 حصان ، لف بشكل منفصل الأطباق المكشوفة وغير المكشوفة بورق الألمنيوم. تأكد من تغطية الأطباق بالكامل واحرص على عدم إدخال الدموع في ورق القصدير. اترك طبق الوكيل غير ملفوف. ضع الأطباق المغلفة والطبق الوكيل غير المغلف في صندوق الإضاءة 28 درجة مئوية (الشكل 2 أ). لا تقم بتشغيل مؤشر LED بعد. في حالة اختبار أكثر من كمية mRNA واحدة ، للحالة غير المكشوفة ، قم بفرز الأجنة المحقونة بكميات مختلفة في ألواح فردية مغلفة بالأغاروز ذات 6 آبار ، مما سيساعد على تقليل التعرض غير المقصود للضوء أثناء التثبيت اللاحق. أغلق باب صندوق الضوء لتجنب التعرض غير المقصود لضوء الغرفة. تمييع مخزون الفورمالديهايد إلى 4٪ في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و aliquot 1 مل في أنابيب طرد مركزي دقيقة مستديرة القاع سعة 2 مل ، أنبوب واحد لكل حالة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. حوالي 5 hpf ، قم بإزالة الطبق الوكيل الذي يحتوي على أجنة غير محقونة وتقييم مرحلة النمو باستخدام منظار تشريح. يجب أن تعكس مرحلة الأجنة الوكيلة مرحلة الأجنة الحساسة للضوء في الأطباق الملفوفة. قم بإزالة الأطباق المغلفة أيضا ، بحيث تتعرض جميع الأطباق لنفس درجة الحرارة. كرر حتى تصل الأجنة الوكيلة إلى 40٪ epiboly (~ 6 hpf). تطور التطور الجنيني حساس لدرجة الحرارة54. لذلك ، كلما طالت مدة بقاء الأطباق خارج الحاضنة ، كلما استغرقت الأجنة وقتا أطول للوصول إلى 40٪. بمجرد وصول الأجنة الوكيلة إلى 40٪ بشكل epiboly ، قم بفك غلاف الطبق المكشوف وضعه على الرف العلوي لصندوق الضوء (الشكل 2 أ). اترك الطبق (الأطباق) غير المكشوف ملفوفا وضعه على الرف السفلي. قم بتشغيل الضوء الأزرق على الفور ، وأغلق الباب ، واضبط مؤقتا لمدة 20 دقيقة (إشعاع 45 واط / م2 ينشط الإشارة بقوة). للتحضير للتثبيت ، تخلص من أكبر قدر ممكن من ضوء الغرفة (أغلق ستائر النوافذ ، وأطفئ الأنوار العلوية ، وأطفئ الشاشات ، وما إلى ذلك). تأكد من تسمية الأنابيب المحتوية على الفورمالديهايد بشكل مناسب. مباشرة قبل التثبيت ، قم بإزالة الأنابيب المحتوية على الفورمالديهايد من 4 درجات مئوية وضعها بجوار صندوق الضوء. خطوة حساسة للوقت والضوء. كن مستعدا للتحرك بسرعة في نهاية التعرض للضوء لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، افتح باب صندوق الضوء وأزل الطبق غير المكشوف. استخدم طرف ماصة زجاجي ملتهب لنقل الأجنة الحساسة للضوء بسرعة ولكن برفق إلى الأنبوب المقابل المحضر بنسبة 4٪ فورمالديهايد. قلل من وقت نقل الأجنة الحساسة للضوء (<45 ثانية) لتجنب التعرض غير المقصود للضوء. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الماصة. التعرض للهواء سوف يدمر الأجنة منزوع الأيونة. لإخراج الأجنة إلى الفورمالديهايد ، اغمر طرف الماصة الزجاجي في الفورمالديهايد واترك الأجنة تغرق في السائل. قلل من كمية وسط الجنين الذي يتم نقله إلى الفورمالديهايد عن طريق إبقاء الأجنة في نهاية الحافة. بعد نقل الأجنة ، أعد الماصة إلى نفس البئر وماصة لأعلى ولأسفل لإزاحة أي أجنة عالقة. هذا يمنع الأجنة من حالات متعددة ينتهي بها المطاف عن طريق الخطأ في أنبوب واحد. كرر على الفور الخطوات 4.3.11-4.3.13 للأجنة غير المعرضة وغير المحقونة ، تليها الأجنة المكشوفة (المحقونة وغير المحقونة). قم بتخزين الأجنة الثابتة في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. 5. تقييم التجربة تسجيل النمط الظاهري والتصويرعند 1 dpf ، من الناحية المثالية بين 24-32 hpf ، قم بإزالة الأجنة من صندوق الضوء لتقييم الأنماط الظاهرية باستخدام نطاق تشريح وإنشاء نموذج تقييم. هذه هي نقطة النهاية التجريبية. لم يعد التنشيط الضوئي غير المقصود مصدر قلق. سجل الأجنة بينما لا يزال في المشيم لسهولة. استخدم ماصة أو مسبار لتحريك الأجنة من أجل الرؤية من زوايا متعددة.سيتم تهوية الأجنة التي تعاني من إشارات BMP الزائدة بدرجات متفاوتة من الشدة كما هو موضح بالتفصيل في Kishimoto et al. 199746 (الشكل 4 أ ، اللوحة اليسرى). سيكون لدى الأجنة التي تعاني من إشارات عقدية زائدة مجموعة من العيوب التنموية المتعلقة بالأديم المتوسط الزائد (الشكل 4 أ ، اللوحة اليمنى)1،3،47،57،58،59،60. غالبا ما يكون لديهم تحلل بمقدار 1 dpf. سجل كل جنين في جميع الظروف (الشكل 4 ب). الحصول على صورة عامة لجميع الأجنة في كل بئر. إذا رغبت في ذلك ، ديكوريتات وصور الأجنة التمثيلية الفردية في ميثيل سلولوز (الشكل 4 أ). تلطيخ وتصوير التألق المناعيبعد احتضان الأجنة في 4٪ فورمالديهايد عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، قم بإزالة الفورمالديهايد واغسل 3-5x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x مع Tween20 (PBST). إزالة PBST وإضافة 100 ٪ الميثانول. أغلق الأنابيب واقلبها برفق لخلط PBST المتبقي والميثانول. اغسل 2x بالميثانول واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل حتى سنوات. للاطلاع على بروتوكول التألق المناعي pSmad1/5/9 (BMP)، انظر Rogers et al.38. للاطلاع على بروتوكول التألق المناعي pSmad2/3 (العقدي)، انظر فان بوكستل وآخرون 17 وروجرز وآخرون 47. صورة الأجنة الملطخة بالمناعة ، باستخدام مجهر قادر على التقسيم البصري (على سبيل المثال ، مجهر متحد البؤر أو ورقة ضوئية). تجنب التشبع وحافظ على ظروف تصوير متطابقة بين جميع العينات الملطخة بنفس الجسم المضاد. الصورة في غضون 5 أيام من الانتهاء من تلطيخ التألق المناعي لأن التألق قد يتلاشى بمرور الوقت.

Representative Results

الهدف من تجربتي التحكم الموصوفتين هنا هو تحديد ما إذا كان bOpto-BMP / Nodal ينشط مساراته الخاصة استجابة للتعرض للضوء الأزرق دون التأثير على الإشارات في غياب الضوء ، كما هو متوقع. استخدم عناصر التحكم هذه لإنشاء سير العمل التجريبي المناسب في مختبرك قبل تطبيق bOpto-BMP / Nodal على أسئلة البحث التي تهمك. يمكن إكمال فحص التنميط الظاهري في يومين فقط ويوفر مؤشرا مفيدا لنشاط الإشارات والسمية الضوئية (الشكل 3 أ). يجب على الأجنة المحقونة والمعرضة للضوء الأزرق أن تقوم بنسخ إشارات BMP الزائدة (ventralization46; الشكل 4 أ ، اللوحة اليسرى) أو الإشارات العقدية (عيوب النمو المتعلقة بالأديم المتوسطالإضافي 1،3،47،57،58،59،60 (الشكل 4 أ ، اللوحة اليمنى)). إذا تم حقنها ، فإن الأجنة المعرضة للضوء تكون aphenotypic ، اختبر جودة mRNA وفكر في حقن المزيد ، وتحقق مرة أخرى من استراتيجية التعرض للضوء لضمان التعرض المستمر للضوء الساطع (~ 450 نانومتر ضوء مع إشعاع 45 واط / م2 يجب أن ينشط الإشارات بقوة). في المقابل ، يجب أن تبدو الأجنة المحقونة وغير المعرضة متطابقة مع الأشقاء غير المحقونين. إذا تم حقنها ، فإن الأجنة غير المعرضة تظهر أنماطا ظاهرية ، قلل من كمية حقن mRNA وأعد تقييم الإعداد التجريبي لضمان حماية الأجنة غير المعرضة من التعرض للضوء. توضح البيانات الموضحة في الشكل 4 ب نتائج تجارب التنميط الظاهري النموذجية بكميات مناسبة من mRNA وظروف التعرض: نشاط الإشارات القوي واضح في الأجنة المحقونة والمعرضة للضوء ، مع وجود جزء صغير فقط من الأجنة المحقونة وغير المعرضة التي تظهر أنماطا ظاهرية. يوفر اختبار التنميط الظاهري أيضا فرصة لتقييم السمية الضوئية. إذا كانت السمية الضوئية ضئيلة ، فيجب أن تظهر الأجنة غير المحقونة والمعرضة للضوء من النوع البري ، على غرار الأجنة غير المحقونة وغير المعرضة. إذا كانت الأجنة غير المحقونة والمعرضة للضوء بها عيوب ، ولكن ليس الأجنة غير المحقونة وغير المعرضة ، ففكر في تقليل إشعاع الضوء. يعمل الإشعاع البالغ 45 واط / م2 على تنشيط الإشارات بقوة دون سمية ضوئية واضحة. لا تظهر البيانات الموضحة في الشكل 4 ب أي اختلافات مقلقة بين الأجنة غير المحقونة والمعرضة للضوء وغير المحقونة وغير المعرضة ، مما يشير إلى سمية ضوئية ضئيلة. على الرغم من أن مقايسات التألق المناعي تتطلب المزيد من الوقت والجهد (~ 1 أسبوع) مقارنة بمقايسة التنميط الظاهري (2 أيام) ، فإن تلطيخ التألق المناعي يوفر قراءة مباشرة لنشاط مسار الإشارات وقد يكشف عن تغييرات طفيفة في الإشارات قد لا تنعكس بواسطة التشكل الإجمالي. يعد التألق المناعي مهما بشكل خاص لتقييم الاستجابات ل bOpto-Nodal ، لأن الإشارات العقدية الزائدة غالبا ما تؤدي إلى تحلل الأجنة بمقدار 1 dpf – والتي يمكن أن يكون لها العديد من الأسباب – على عكس الأنماط الظاهرية البطنية المحددة المميزة لإشارات BMP الزائدة46 (الشكل 4 أ). يجب أن تظهر الأجنة المحقونة والمعرضة للضوء الأزرق زيادة موحدة في فسفرة Smad1/5/9 أو Smad2/3 مقارنة بالأجنة غير المحقونة والمعرضة للضوء. إذا لم يتم زيادة المستويات ، أو زيادتها بشكل ضعيف فقط ، فاختبر جودة mRNA وفكر في حقن المزيد ، وتحقق مرة أخرى من استراتيجية التعرض للضوء. يجب أن يؤدي التعرض لمدة 20 دقيقة للضوء الأزرق مع إشعاع 45 واط / م2 حوالي 40٪ من epiboly إلى تنشيط الإشارات بقوة. إذا كان تلطيخ pSmad غير منتظم ، فحاول حقن mRNA في وسط الخلية (بدلا من صفار البيض) ، مما قد يؤدي إلى توزيع mRNA أكثر اتساقا. يجب أن تحتوي الأجنة المحقونة وغير المعرضة على مستويات pSmad مماثلة للأجنة غير المحقونة. من الناحية القصصية ، لاحظنا تسرب فسفرة Smad مع bOpto-Nodal من bOpto-BMP. إذا زادت مستويات pSmad في الأجنة المحقونة وغير المعرضة ، قلل من كمية حقن mRNA. بالإضافة إلى ذلك ، أعد تقييم الإعداد التجريبي للتأكد من 1) عدم تعرض الأجنة غير المعرضة للضوء عن غير قصد ، و 2) التعرض للضوء أثناء التثبيت هو الحد الأدنى. أثناء خطوة التثبيت ، من الأهمية بمكان عدم السماح بمرور أكثر من 45 ثانية بين الإزالة من صندوق الضوء والغمر في الفورمالديهايد. بالإضافة إلى ذلك ، خلال هذه الخطوة ، قلل من التعرض لضوء الغرفة وأشعة الشمس عن طريق إغلاق ستائر النوافذ أو إيقاف تشغيل مصادر الضوء الأبيض أو استخدام الأضواء الحمراء أو تغطية مصادر الضوء الأبيض بورق ترشيح جل مانع للضوء الأزرق (جدول المواد). توضح البيانات الواردة في الشكل 4C نتائج تجارب تلطيخ التألق المناعي النموذجية بكميات مناسبة من mRNA وظروف التعرض للضوء: مستويات pSmad متشابهة في الأجنة غير المحقونة وغير المعرضة ، في حين أن الأجنة المحقونة والمعرضة للضوء تظهر مستويات أعلى من فسفرة Smad. الشكل 1: استراتيجية تنشيط الإشارات العقدية bOpto-BMP . (أ) يتم تنشيط مسار إشارات BMP الداخلي عن طريق ربط الربيطة BMP ، مما يؤدي إلى تكوين مركب مستقبلات من النوع الأول / الثاني ، وفسفرة Smad1/5/9 ، والتعبير عن الجينات المستهدفة BMP. تعرف مستقبلات النوع الأول BMPR1aa و Acvr1l أيضا باسم Alk3 و Alk8 ، على التوالي. BMPR2a هو مستقبل من النوع الثاني. (ب) بنى بوتو-BMP38. يتم دمج مجالات الكيناز المفترضة من BMPR1aa و Acvr1l إلى LOV. يحتوي اندماج BMPR2a-LOV على مجال كيناز مفترض ومجال مستقبلات C-terminal (CTD). جميع عمليات الاندماج تستهدف الغشاء مع شكل myristoylation (Myr). يتم فصل المجالات بواسطة روابط جليكاين سيرين (GS). يتم وضع علامة على التركيبات في CTD بعلامة HA epitope. تم العثور على هذا المزيج من ثلاثة بنيات لتنشيط إشارات BMP على النحو الأمثل. (ج) تنشيط إشارات BMP بوساطة bOpto-BMP. عند تعرضها للضوء الأزرق ، تتلاشى مجالات LOV ، والتي يعتقد أنها تؤدي إلى تكوين معقد وتنشيط الإشارات. (د) يتم تنشيط مسار الإشارات العقدية الداخلية عن طريق ربط الرباط العقدي ، مما يؤدي إلى تكوين مركب مستقبلات من النوع الأول / الثاني ، وفسفرة Smad2/3 ، والتعبير عن الجينات المستهدفة العقدية. يعرف مستقبل النوع الأول Acvr1ba والمستقبل من النوع الثاني Acvr2ba أيضا باسم Acvr1b و Acvr2b ، على التوالي. (ه) البنيات العقدية39. يتم دمج مجالات الكيناز المفترضة من Acvr1ba و Acvr2ba إلى LOV. جميع عمليات الاندماج تستهدف الغشاء مع شكل myristoylation (Myr). يتم فصل النطاقات بواسطة روابط GS. يتم وضع علامة على التركيبات في CTD بعلامة HA epitope. (F) تنشيط الإشارات العقدية بوساطة العقدية. عند تعرضها للضوء الأزرق ، تتلاشى مجالات LOV ، والتي يعتقد أنها تؤدي إلى تكوين معقد وتنشيط الإشارات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: صندوق ضوء يتم التحكم في درجة حرارته لتجارب علم البصريات الوراثي . (أ) يتم تركيب مصباح صفيحة دقيقة LED على الجزء العلوي من الحاضنة باستخدام حامل LED مصمم خصيصا. تتعرض أجنة الزرد في صفيحة من 6 آبار على الرف الأول للضوء من خلال ثقب محفور في الجزء العلوي من الحاضنة. يحتوي الرف السفلي على مجموعة ثانية من أجنة التحكم غير المكشوفة في صفيحة 6 آبار ملفوفة بورق الألمنيوم. باب الحاضنة مبطن بتجريد الطقس لمنع التعرض غير المقصود لضوء الغرفة أو أشعة الشمس. (ب) تفاصيل الإجراء لإنشاء ثقب في الحاضنة باستخدام مثقاب الخطوة. يحتوي نموذج الحاضنة المستخدم هنا على لوحة داخلية تتطلب حفر ثقب ثان أكبر (جدول المواد). (ج) تفاصيل حامل LED المخصص المصمم لنظام إضاءة ثلاثي الأطوال الموجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: سير عمل تجربة bOpto-BMP / العقدي. مقايسة النمط الظاهري وتلطيخ التألق المناعي pSmad لاختبار نشاط bOpto-BMP / العقدي. يتم حقن الأجنة بالحمض النووي الريبوزي المرسال في مرحلة الخلية الواحدة ونقلها إلى صندوق ضوئي في موعد لا يتجاوز 1.5 ساعة بعد الإخصاب (hpf). أ: مقايسة النمط الظاهري. يتم تربية الأجنة المحقونة والأشقاء غير المحقونين في الظلام أو يتعرضون لضوء أزرق موحد يبدأ من 1.5 hpf حتى يوم واحد بعد الإخصاب (dpf). يمكن تقييم نشاط الإشارات البصرية الجينية عن طريق تسجيل الأجنة للأنماط الظاهرية المتوافقة مع نشاط المسار الزائد. ب: تلطيخ التألق المناعي pSmad. يتم تربية الأجنة المحقونة والأشقاء غير المحقونين في الظلام حتى 40٪ epiboly (~ 6 hpf). ثم يتعرض نصف الأجنة المحقونة ونصف الأجنة غير المحقونة لضوء أزرق موحد لمدة 20 دقيقة. بعد التعرض ، يتم تثبيت جميع الأجنة وتعريضها لتلطيخ التألق المناعي ل pSmad. تعكس المستويات المرتفعة من pSmad1/5/9 أو pSmad2/3 التنشيط البصري الجيني لإشارات BMP أو Nodal ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تقييم استجابات الإشارات المنشطة بالضوء في أجنة الزرد. تم حقن أجنة الزرد في مرحلة الخلية الواحدة بترميز mRNA bOpto-BMP / Nodal. (أ) تربى الأجنة في الظلام أو تعرضت لضوء أزرق منتظم بدءا من 1.5 ساعة بعد الإخصاب (hpf). تم تسجيل الأنماط الظاهرية في 1 يوم بعد الإخصاب (dpf). الأنماط الظاهرية التمثيلية موضحة. تؤدي إشارات BMP الزائدة إلى التنفيس (اللوحة اليسرى) ، بينما تسبب الإشارات العقدية الزائدة عيوبا في النمو مرتبطة بالأديم المتوسط الإضافي (اللوحة اليمنى). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) تكميم النمط الظاهري. تم تربية الأجنة المحقونة والأشقاء غير المحقونين في الظلام بدءا من 1.5 hpf (المصباح الأسود). تعرض نصف الأجنة المحقونة ونصف الأجنة غير المحقونة لضوء أزرق موحد (لمبة زرقاء). (ج) تم تربية الأجنة المحقونة والأشقاء غير المحقونين في الظلام بدءا من 1.5 hpf (المصباح الأسود). عند 40٪ epiboly (~ 6 hpf) ، تعرض نصف الأجنة المحقونة ونصف الأجنة غير المحقونة لضوء أزرق موحد (لمبة زرقاء). بعد 20 دقيقة ، تم تثبيت جميع الأجنة وتعريضها للتلطيخ المناعي إما ل Smad1/5/9 المفسفر أو Smad2/3. تشير شدة pSmad الأعلى إلى زيادة إشارات BMP / Nodal ، على التوالي. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الملف التكميلي 1: التجميع الكامل لصندوق الضوء. ملف PDF ثلاثي الأبعاد يعرض عرضا ثلاثي الأبعاد لتجميع صندوق الإضاءة الكامل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 2: انفجر صندوق الضوء المنظر. ملف PDF ثلاثي الأبعاد يعرض عرضا ثلاثي الأبعاد لتجميع صندوق الضوء المنفجر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 3: حشية خفيفة كبيرة. ملف رسم CAD (. DWG) لتصنيع حشية الضوء الكبيرة لحامل LED باستخدام قاطع ليزر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 4: حشية خفيفة صغيرة. ملف رسم CAD (. DWG) لتصنيع حشية الضوء الصغيرة لحامل LED باستخدام قاطع ليزر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 5: قاعدة منصة أكريليك. ملف رسم CAD (. DWG) لتصنيع قاعدة منصة الأكريليك حامل LED باستخدام قاطع ليزر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 6: عمودي منصة أكريليك. ملف رسم CAD (. تنسيق DWG) لتصنيع منصة الأكريليك لحامل LED عموديا باستخدام قاطع ليزر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 7: دعامة أكريليك على اليسار. ملف رسم CAD (. تنسيق DWG) لتصنيع الدعامة اليسرى اليسرى لحامل LED باستخدام قاطع ليزر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الملف التكميلي 8: حق دعم الأكريليك. ملف رسم CAD (. DWG format) لتصنيع الدعم الأيمن لحامل LED الأكريليك باستخدام قاطع الليزر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

حقن mRNA هو الاستراتيجية الحالية لتوصيل bOpto-BMP / Nodal إلى أجنة الزرد. هذه الطريقة لها العديد من العيوب. أولا ، تختلف الكمية المناسبة من mRNA بين المختبرات. يجب أن تكون الكمية المستخدمة كافية لتنشيط الإشارات بقوة مع التعرض للضوء ، ولكن دون تنشيط مظلم غير مقصود. من الجيد اختبار عدة كميات للعثور على مستويات mRNA المثلى ، وبمجرد إنشائها ، قم بإنشاء حصص من مزيج رئيسي لإدخال نفس الكمية من mRNA بشكل متكرر. ثانيا ، قد يؤدي التوزيع غير المتكافئ للحمض النووي الريبوزي المرسال المحقون إلى تنشيط إشارات غير متساو. يعتقد أن الحقن في مركز الخلية (وليس صفار البيض) يعزز حتى توزيع mRNA. أخيرا ، نظرا لأن حقن mRNA يتحلل بمرور الوقت ، فقد لا يكون هذا النهج مناسبا للتجارب على الأجنة الأكبر سنا. في المستقبل ، يمكن معالجة هذه المشاكل عن طريق خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر في كل مكان عن bOpto-BMP / Nodal مع محفز للأم أو محفز للدواء. على الرغم من أن العمل مع أسماك الزرد البالغة التي يحتمل أن تكون حساسة للضوء قد يمثل تحديا في هذا السياق ، فقد تم تطوير الزرد61،62 و Drosophila22،34،35،63 من الجينات المحورة التي تؤوي أدوات علم البصريات الوراثية.

يعد تجنب التنشيط الضوئي غير المقصود تحديا عاما باستخدام أدوات علم البصريات الوراثية. للتبسيط، تعامل مع الأجنة المحقونة التي يزيد وزنها عن 1.5 hpf على أنها حساسة للضوء. غالبا ما يمكن تجنب التعرض غير المقصود للضوء ببساطة عن طريق لف الأطباق أو الأطباق بورق الألمنيوم. ومع ذلك ، بالنسبة للتجارب التي تتطلب مراقبة بصرية للأجنة الحية التي يزيد عمرها عن 1.5 hpf ، من الممكن استخدام مصادر الضوء الأحمر أو تغطية مصادر الضوء الأبيض بورق ترشيح هلام غير مكلف يمنع الأطوال الموجية ل LOV-dimerizing (جدول المواد).

تم تصميم صندوق الضوء الموصوف هنا لتطبيقات محددة تتطلب تحكما دقيقا في مستويات إشعاع الضوء وديناميكياته وأطوال موجاته (الشكل 2). تشمل المزايا الأخرى لصندوق الإضاءة هذا التعرض المنتظم للضوء ، وتسخين العينة غير المقصود الذي لا يكاد يذكر ، ومساحة واسعة لألواح متعددة من 6 آبار ، ومصادر ضوء طويلة العمر ومميزة طيفيا. ومع ذلك ، قد تكون استراتيجيات التعرض للضوء المختلفة مفضلة اعتمادا على تطبيق البحث. طورت العديد من المختبرات أنظمة تعرض موحدة للضوء أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة مع آثار أقدام أصغر ، بما في ذلك حاضنات التبطين بشرائط LED ، أو تعليق لوحات LED فوق العينات ، أو دمج مصابيح LED في أغطية أطباق الثقافة32،38،39،40،64،65،66. الأهم من ذلك ، أن صندوق الضوء المستخدم في هذا البروتوكول لا يسمح للمستخدمين بتنظيم الآبار الفردية بشكل مستقل (على عكس Bugaj et al.52) أو توفير التحكم المكاني في التعرض للضوء. تم إثبات التنشيط البصري الوراثي الموضعي مكانيا باستخدام bOpto-BMP38 و bOpto-Nodal39 باستخدام الليزر في أنظمة SPIM أو أنظمة متحدة البؤر ، على التوالي ، كما تم تحقيقه مع العديد من الاستراتيجيات الوراثية البصرية الأخرى في مجموعة متنوعة من الأنظمة النموذجية (تمت مناقشته في Rogers and Müller12). حققت بعض الأساليب دقة مكانية دون خلوية29،30،31. على الرغم من أن تنفيذ أنظمة التعرض للضوء الموضعية مكانيا يقع خارج نطاق هذا البروتوكول ، إلا أن تجارب التنشيط المكاني باستخدام bOpto-BMP / Nodal ممكنة نظريا باستخدام معدات متخصصة مثل أجهزة المرآة الدقيقة الرقمية أو طرق التقنيع. يتم تشجيع القراء على استكشاف الأدبيات الواسعة حول صناديق الضوء DIY للتجارب البصرية الوراثية قبل الالتزام باستراتيجية التعرض للضوء (انظر على سبيل المثال ، Gerhardt et al.51 و Bugaj et al.52 و Kumar and Khammash 53 والمزيد في https://www.optobase.org/materials/).

غالبا ما توفر الاستراتيجيات الوراثية البصرية الجزيئية درجة أعلى من التحكم الزماني المكاني في العمليات البيولوجية مقارنة بالنهج التاريخية مثل الطفرات والتعبير الجيني خارج الرحم والبروتينات المؤتلفة والأدوية. يمكن للقراء المهتمين بفوائد مناهج علم البصريات الوراثي استكشاف الأدوات المنشورة الأخرى المتاحة في الزرد والكائنات الحية الأخرى. وتشمل هذه الأدوات لمعالجة مسارات الإشارات الإضافية 32،65،67،68 ، وتنظيم التعبير الجيني 61،64،66،69،70،71 ، وتغيير توطين البروتين31،72 ، وتنشيط موت الخلايا المبرمج 62. يتم فهرسة هذه الأدوات وغيرها الكثير بشكل ملائم في OptoBase ، وهو مورد ويب منسق لنهج علم البصريات الجزيئي28. بالنسبة لأولئك الذين ألهموا لإنشاء أدوات وراثية بصرية جديدة ، يتميز المورد أيضا بأوصاف مفيدة للبروتينات المستجيبة للضوء التي تم استخدامها في مجموعة واسعة من الاستراتيجيات ، بما في ذلك البروتينات المستجيبة للضوء التي تستجيب للأطوال الموجية الخضراء والحمراء والقريبة من الأشعة تحت الحمراء. نحن متحمسون للمجتمع العلمي لتحقيق الإمكانات الكاملة للنهج البصرية الجزيئية.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا البروتوكول من قبل البرنامج الداخلي NICHD إلى KWR (ZIA HD009002-01). نشكر جيف فاريل ومختبره على ملاحظاتهم المضيئة ، وويل أندرسون على الدعم الفني الممتاز ، وليان إيانوتشي على اختبار الإجهاد للبروتوكول وقياس الإشعاع ، ومنشأة الزرد المشتركة التابعة للمعاهد الوطنية للصحة على عملهم الشاق في الحفاظ على صحة الزرد.

Materials

Building a light box & Light exposure protocol
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw McMaster-Carr 99663A222 1.4.5
Digital Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D 1.7
4
Incubator (142 liters) Boekel Scientific 139400 1.3.1
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Incubator_panel 1.4.4
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit CO-Z SDB0001TA 1.3.2
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone McMaster-Carr 5812T12 1.4.3
1.4.4
LED microplate illuminator Prizmatix NA 1.1
1.4.3
M3 10mm Cube Standoff Newark Eletronics 005.60.533 1.4.1
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw McMaster-Carr 91801A156 1.4.1
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw McMaster-Carr 91801A305 1.4.3
Memory card thermometer Fisherbrand 15-081-111 1.9
3.2.1
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) ThorLabs S170C 1.7
4
Red gel filter paper #E106 Rosco / B&H Foto & Electronics 110084014805-E106 4.2.1
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Side_bracket 1.4.2
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) Custom part / Piedmont Plastics Vertical_bracket 1.4.1
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk McMaster-Carr 8694K12 1.8
Generating mRNA
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit Omega D6293-02 2.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) Thermo Scientific K0503 2.2
Microsample incubator (Hybex) SciGene 1057-30-0 2
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) SciGene 1057-34-0 2
Nanodrop One Spectrophotometer Thermo Scientific ND-ONE-W 2.4
NotI-HF restriction enzyme New England Biolabs (NEB) R3189L 2.1
pCS2-Opto-Alk3 Addgene 207614 2
pCS2-Opto-Alk8 Addgene 207615 2
pCS2-Opto-BMPR2a Addgene 207616 2
RNeasy Mini Kit (250 rxns) Qiagen 74106 2.3
Injecting mRNA
Agarose (UltraPure) Invitrogen / Thermo Fisher 16500500 3.1.1
250 ml glass beakers Fisherbrand FB100250 3.3.2
6-well dishes (case of 50) Falcon 08 772 1B 3.1.6
B-8A ball joint Narishige B-8A 3.3
Back pressure unit (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) BPU 3.3
Foot switch (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) FWS 3.3
GJ-1 magnetic stand Narishige GJ-1 3.3
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) World Precision Instruments 1B100F-4 3.1.11
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) Pyrex 08-748A 3.3.2
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) Kimble-Chase 63A53WT 3.1.9
Injection dish molds Adaptive Science Tools tu1 3.1.3
IP iron plate Narishige IP 3.3
M-152 micromanipulator Narishige M-152 3.3
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) MIMPH-MPIP-Kit 3.3
Micrometers Meiji Techno America MA285 3.3
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) Applied Scientific Instrumentation (ASI) MPPI-3 3.3
Needle puller World Precision Instruments PUL-1000 3.1.11
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) Falcon 08-757-100D 3.1.2
Pipettor (10 ml, green) Bel-Art F37898-0000 3.3
Pronase Roche 11459643001 3.3.2
Squeeze bottles (500 ml) Nalgene / Thermo Scientific 2402-0500 3.3
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jones, W. D., Mullins, M. C. Cell signaling pathways controlling an axis organizing center in the zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 150, 149-209 (2022).
  2. Hill, C. S. Establishment and interpretation of NODAL and BMP signaling gradients in early vertebrate development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 311-340 (2022).
  3. Zinski, J., Tajer, B., Mullins, M. C. TGF-β Family Signaling in Early Vertebrate Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a033274 (2018).
  4. Shore, E. M., Kaplan, F. S. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nature Reviews. Rheumatology. 6 (9), 518-527 (2010).
  5. Hebron, K. E., Hernandez, E. R., Yohe, M. E. The RASopathies: from pathogenetics to therapeutics. Disease Models & Mechanisms. 15 (2), dmm049107 (2022).
  6. Grant, M. G., Patterson, V. L., Grimes, D. T., Burdine, R. D. Modeling Syndromic Congenital Heart Defects in Zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 124, 1-40 (2017).
  7. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/beta-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  8. Farahani, P. E., Reed, E. H., Underhill, E. J., Aoki, K., Toettcher, J. E. Signaling, Deconstructed: Using Optogenetics to Dissect and Direct Information Flow in Biological Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 61-87 (2021).
  9. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  10. Wibisana, J. N., Okada, M. Encoding and decoding NF-kappaB nuclear dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 77, 102103 (2022).
  11. Friedel, L., Loewer, A. The guardian’s choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. TheFEBS Journal. 289 (1), 40-52 (2022).
  12. Rogers, K. W., Müller, P. Optogenetic approaches to investigate spatiotemporal signaling during development. Current Topics in Developmental Biology. 137, 37-77 (2020).
  13. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics. Current Opinion in Biotechnology. 52, 42-48 (2018).
  14. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 341-372 (2022).
  15. Li, P., Elowitz, M. B. Communication codes in developmental signaling pathways. Development. 146 (12), dev170977 (2019).
  16. Tucker, J. A., Mintzer, K. A., Mullins, M. C. The BMP signaling gradient patterns dorsoventral tissues in a temporally progressive manner along the anteroposterior axis. Developmental Cell. 14 (1), 108-119 (2008).
  17. van Boxtel, A. L., et al. A temporal window for signal activation dictates the dimensions of a Nodal signaling domain. Developmental Cell. 35 (2), 175-185 (2015).
  18. Sorre, B., Warmflash, A., Brivanlou, A. H., Siggia, E. D. Encoding of temporal signals by the TGF-β pathway and implications for embryonic patterning. Developmental Cell. 30 (3), 334-342 (2014).
  19. Economou, A. D., Hill, C. S. Temporal dynamics in the formation and interpretation of Nodal and BMP morphogen gradients. Current Topics in Developmental Biology. 137, 363-389 (2020).
  20. Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
  21. Barkai, N., Shilo, B. Z. Robust generation and decoding of morphogen gradients. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a001990 (2009).
  22. Johnson, H. E., Djabrayan, N. J. V., Shvartsman, S. Y., Toettcher, J. E. Optogenetic Rescue of a Patterning Mutant. Current Biology. 30 (17), 3414-3424 (2020).
  23. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342 (6163), 1203-1208 (2013).
  24. Lin, B., et al. Synthetic spatially graded Rac activation drives cell polarization and movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), E3668-E3677 (2012).
  25. Cui, K. W., et al. Spatially controlled stem cell differentiation via morphogen gradients: A comparison of static and dynamic microfluidic platforms. Journal of Vacuum Science & Technology. A, Vaccum, Surfaces, and Films. 38 (3), 033205 (2020).
  26. Faden, F., Mielke, S., Lange, D., Dissmeyer, N. Generic tools for conditionally altering protein abundance and phenotypes on demand. Biological Chemistry. 395 (7-8), 737-762 (2014).
  27. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 401-406 (2008).
  28. Kolar, K., Knobloch, C., Stork, H., Znidaric, M., Weber, W. OptoBase: A web platform for molecular optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (7), 1825-1828 (2018).
  29. Benedetti, L., et al. Light-activated protein interaction with high spatial subcellular confinement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), E2238-E2245 (2018).
  30. Krueger, D., De Renzis, S. Optogenetic Methods to Control Tissue Mechanics in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 2540, 269-283 (2022).
  31. Buckley, C. E. Optogenetic Control of Subcellular Protein Location and Signaling in Vertebrate Embryos. Methods in Molecular Biology. 1920, 143-162 (2019).
  32. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of non-canonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. 8, e42093 (2019).
  33. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  34. Huang, A., Amourda, C., Zhang, S., Tolwinski, N. S., Saunders, T. E. Decoding temporal interpretation of the morphogen Bicoid in the early Drosophila embryo. Elife. 6, e26258 (2017).
  35. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling dynamics control cell fate in the early Drosophila embryo. Developmental Cell. 48 (3), 361.e3-370.e3 (2019).
  36. Aoki, K., et al. Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation. Molecular Cell. 52 (4), 529-540 (2013).
  37. Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Research. , (2017).
  38. Rogers, K. W., ElGamacy, M., Jordan, B. M., Müller, P. Optogenetic investigation of BMP target gene expression diversity. Elife. 9, e58641 (2020).
  39. Sako, K., et al. Optogenetic control of Nodal signaling reveals a temporal pattern of Nodal signaling regulating cell fate specification during gastrulation. Cell Reports. 16 (3), 866-877 (2016).
  40. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. The EMBO Journal. 33 (15), 1713-1726 (2014).
  41. Crossman, S. H., Janovjak, H. Light-activated receptor tyrosine kinases: Designs and applications. Current Opinion in Pharmacology. 63, 102197 (2022).
  42. Kainrath, S., Janovjak, H. Design and Application of Light-Regulated Receptor Tyrosine Kinases. Methods in Molecular Biology. 2173, 233-246 (2020).
  43. Takahashi, F., et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19625-19630 (2007).
  44. Toyooka, T., Hisatomi, O., Takahashi, F., Kataoka, H., Terazima, M. Photoreactions of aureochrome-1. Biophysical Journal. 100 (11), 2801-2809 (2011).
  45. Vopalensky, P., Pralow, S., Vastenhouw, N. L. Reduced expression of the Nodal co-receptor Oep causes loss of mesendodermal competence in zebrafish. Development. 145 (5), dev.158832 (2018).
  46. Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M., Schulte-Merker, S. The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development. 124 (22), 4457-4466 (1997).
  47. Rogers, K. W., et al. Nodal patterning without Lefty inhibitory feedback is functional but fragile. Elife. 6, e28785 (2017).
  48. Dubrulle, J., et al. Response to Nodal morphogen gradient is determined by the kinetics of target gene induction. Elife. 4, e05042 (2015).
  49. Harvey, S. A., Smith, J. C. Visualisation and quantification of morphogen gradient formation in the zebrafish. PLoS Biology. 7 (5), e1000101 (2009).
  50. Zinski, J., Tuazon, F., Huang, Y., Mullins, M., Umulis, D. Imaging and Quantification of P-Smad1/5 in Zebrafish Blastula and Gastrula Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 135-154 (2019).
  51. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 624, 197-226 (2019).
  52. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  53. Kumar, S., Khammash, M. Platforms for Optogenetic Stimulation and Feedback Control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 918917 (2022).
  54. Urushibata, H., et al. Control of Developmental Speed in Zebrafish Embryos Using Different Incubation Temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  55. Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments. (95), e52266 (2015).
  56. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  57. Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
  58. Shimizu, T., et al. Cooperative roles of Bozozok/Dharma and Nodal-related proteins in the formation of the dorsal organizer in zebrafish. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 293-303 (2000).
  59. Rebagliati, M. R., Toyama, R., Fricke, C., Haffter, P., Dawid, I. B. Zebrafish nodal-related genes are implicated in axial patterning and establishing left-right asymmetry. Biologia do Desenvolvimento. 199 (2), 261-272 (1998).
  60. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  61. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An Improved Optogenetic Expression System for Zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  62. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), dev183640 (2020).
  63. Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
  64. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  65. Patel, A. L., et al. Optimizing photoswitchable MEK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25756-25763 (2019).
  66. LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. Journal of Visualized Experiments. (174), e62818 (2021).
  67. Kainrath, S., Stadler, M., Reichhart, E., Distel, M., Janovjak, H. Green-light-induced inactivation of receptor signaling using cobalamin-binding domains. Angewandte Chemie. 56 (16), 4608-4611 (2017).
  68. Benman, W., et al. Temperature-responsive optogenetic probes of cell signaling. Nat Chem Biol. 18 (2), 152-160 (2022).
  69. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
  70. Putri, R. R., Chen, L. Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system. Gene. 677, 273-279 (2018).
  71. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  72. Buckley, C. E., et al. Reversible optogenetic control of subcellular protein localization in a live vertebrate embryo. Developmental Cell. 36 (1), 117-126 (2016).

Tags

OptogeneticsZebrafishEmbryoSignalingBMPNodalLight-oxygen-voltage Sensing (LOV) DomainBOpto-BMPBOpto-NodalDevelopmentBody PlanSpatiotemporal Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Saul, A. J., Rogers, C. E., Garmendia-Cedillos, M., Pohida, T., Rogers, K. W. Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (200), e65733, doi:10.3791/65733 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image