犬肠道类器官和Gut-on-a-Chip微流控系统的集成为人类肠道疾病提供了相关的转化模型。提出的协议允许肠道的 3D 形态发生和动态 体外 建模,有助于开发针对狗和人类肠道疾病的有效治疗方法。
犬类肠道在解剖学、微生物学和生理学方面与人类相似,狗自然会发展出与人类相似的自发性肠道疾病。克服了三维 (3D) 类器官在进入肠上皮顶端表面方面的固有局限性,导致了二维 (2D) 单层培养物的产生,其使用来自类器官的细胞暴露可触及的管腔表面。将这些类器官和类器官衍生的单层培养物整合到微流控 Gut-on-a-Chip 系统中,进一步发展了该技术,从而可以开发更具生理相关性的动态 体外 肠道模型。
在这项研究中,我们提出了一种方案,用于使用从受炎症性肠病 (IBD) 影响的狗获得的原代肠道组织样本生成犬肠上皮的 3D 形态发生。我们还概述了使用源自 3D 肠道类器官的细胞生成和维持 2D 单层培养物和肠道芯片系统的方案。本研究中提出的协议是建立专门为犬科动物设计的微流体 Gut-on-a-Chip 系统的基础框架。通过为这种创新方法奠定基础,我们的目标是扩大这些技术在生物医学和转化研究中的应用,与“同一个健康倡议”的原则保持一致。通过利用这种方法,我们可以开发更具生理相关性的 动态体外 模型,用于研究狗和人类的肠道生理学。这对生物医学和制药应用具有重要意义,因为它可以帮助开发更有效的治疗这两种物种的肠道疾病的方法。
肠上皮形态发生主要通过实验动物模型进行研究,这些模型成本高昂、耗时且不能准确代表人类发育过程1.此外,传统的静态 2D 细胞培养模型缺乏模拟 3D 上皮结构的复杂空间组织的能力2。因此,需要一种使用来自人类相关动物模型的肠上皮细胞诱导 体外 3D 形态发生的方案,以推进我们对肠道上皮结构的理解。
伴侣犬的肠道解剖结构和微生物组组成与人类非常相似,因为它们在驯化过程中共享环境和饮食3.除了这种相似性之外,人类和狗都有各种慢性疾病,这些疾病被认为归因于肠道健康。狗和人类一样,可以自发地患上慢性疾病,例如肥胖、认知功能障碍、糖尿病、炎症性肠病 (IBD) 和结直肠腺癌 4,5,6,7,8,9,10。尽管在之前的 Gut-on-a-Chip 研究 2,11,12,13,14 中开发和使用了人类和小鼠上皮细胞,但直到现在还没有使用犬肠上皮细胞。我们的新方法,在具有 3D 上皮形态发生的动态培养系统中利用犬肠道类器官上皮,对犬和人类医学都有重要意义。
肠道类器官培养的最新进展导致了犬肠道类器官培养的建立15.该培养系统涉及在定义的形态原条件下培养肠道干细胞,从而产生具有源自成体干细胞的自我更新特性的 3D 模型16。然而,由于肠腔17 的封闭性,进行转运测定或宿主微生物组共培养会给该 3D 模型带来困难。为了解决这个问题,研究人员生成了一个源自肠道类器官的 2D 单层,允许暴露管腔表面18,19。然而,3D类器官和2D单层都保持在静态条件下,这并不能准确反映肠道微环境的体内生物力学。将患者来源的犬类器官技术与体外 3D 形态发生相结合,为慢性多因素疾病的转化研究提供了机会。这种方法使研究人员能够开发出更有效的治疗方法,使人类和狗都受益,并进一步推进转化研究,与“同一个健康倡议”保持一致,这是一种认识到人类、动物和环境健康相互联系的合作方法。它促进跨学科合作,以应对复杂的健康挑战,为所有人实现最佳健康结果。通过了解人类、动物和生态系统之间的相互依存关系,该倡议旨在减轻新出现的传染病、环境退化和其他共同健康问题带来的风险20,21,22。
该协议概述了在具有基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的多孔膜的Gut-on-a-Chip微设备上培养从患者类器官获得的犬肠上皮细胞的综合方法。通过整合犬肠道类器官和这种 Gut-on-a-Chip 技术来建立 3D 上皮形态发生,使我们能够研究肠道如何发育和维持其细胞组织和干细胞生态位。该平台提供了一个宝贵的机会来研究微生物组群落对肠道健康的影响,并了解这些群落如何产生有助于肠道病理生理学的微生物代谢物14,23。这些进展现在可以扩展到犬肠道样本,为研究人员提供探索肠道微生物组与宿主生理学之间复杂关系的机会。这为获得对肠道病理生理学潜在机制的宝贵见解和了解微生物代谢物在犬类和人类健康以及各种疾病状况中的潜在作用开辟了途径。用于犬类 Gut-on-a-Chip 的方案是可重复的,使其成为比较医学的合适实验模型,因为这种方法可以研究宿主-微生物组相互作用、病原体感染和基于益生菌的狗和人类的治疗效果。
这项研究标志着犬肠道类器官与犬IBD Gut-on-a-Chip模型开发的兼容性的开创性证明。将肠道类器官和类器官衍生的单层培养物整合到微流体系统(即 Gut-on-a-Chip 系统)中进一步发展了该技术,从而能够创建与生理动力学密切相关且更能代表生物条件的 体外 肠道模型。特别是,由于很少有关于在人类中使用 IBD 衍生类器官进行 Gut-on-a-Chip 培养的报道,因此目前使用犬 IBD 衍生的 Gut-on-a-Chip 的研究可能为人类 IBD 的研究提供领先的见解。
在 Gut-on-a-Chip 上成功开发犬肠上皮 3D 形态发生需要仔细注意几个关键步骤。首先,PDMS微流体通道的疏水表面可能会阻碍ECM粘附和随后的细胞附着,因此在ECM包被和细胞接种之前需要PDMS的表面活化(参见方案第1节)。为了实现稳定的单层培养,在细胞附着后去除多余的未附着细胞至关重要(方案步骤4.6-4.7)。此外,动态刺激,如恒定的介质流量和蠕动样的真空运动,对于肠上皮的 3D 形态发生是必要的(方案步骤 5.2)。在芯片上肠道培养的任何步骤中,小心处理对于避免微通道中出现气泡至关重要。
如果在Gut-on-a-Chip中遇到不良的细胞接种,可能是由于细胞数量少或细胞附着不良。为了解决细胞数量低的问题,重要的是通过观察它们在基质胶中的生长来检查准备好的肠道类器官的健康状况。细胞解离后可通过台盼蓝染色来评估细胞活力,以确保不超过 20% 的细胞死亡。如果活细胞数量不足,可以尝试优化类器官培养基条件。另一种可能性是类器官解离不完全,导致过量大于 70 μm 的细胞团块被过滤器捕获。为了解决这个问题,一种选择是延长细胞解离期间的移液时间。或者,15 mL 锥形管可以每分钟轻轻搅拌一次,同时用胰蛋白酶样蛋白酶处理。电池与芯片上的附着不良可能是由于 ECM 涂层不当造成的。在涂布过程中,建议仔细检查是否存在气泡,并根据需要轻轻添加更多涂布溶液来防止气泡的形成。细胞过度拥挤和无法洗掉未附着的细胞会导致初始单层不足。在这种情况下,在推动注射器柱塞时可以施加轻微的脉冲。这些故障排除步骤有助于识别和解决 Gut-on-a-Chip 培养过程中的问题。
虽然这种Gut-on-a-Chip平台能够创建起伏的3D上皮层,但我们认识到需要额外的生物学复杂性来完全复制肠道微环境。考虑上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用、用于 3D 再生的 ECM 沉积以及建立合适干细胞生态位的隐窝绒毛特征的存在至关重要。基质细胞,如成纤维细胞,在ECM蛋白的产生和肠道形态发生的调节中起着至关重要的作用34,35,36。在该模型中加入间充质细胞有可能增强形态发生和细胞附着效率。内皮层包括毛细血管系统和淋巴管,在控制分子转运和免疫细胞募集方面起着至关重要的作用37,38。患者来源的免疫细胞的加入对于肠道疾病建模至关重要,因为它可以证明先天免疫和适应性免疫之间的相互作用以及组织特异性免疫的建立39。在Gut-on-a-Chip上完成3D形态发生后,可以将类器官培养基修饰为类器官分化培养基。这可能是诱导额外细胞分化的可行方法,具体取决于实验目标。
由于需要较长的工作距离,因此对3D微架构进行 原位 成像具有挑战性,而长距离物镜可以克服这一点。此外,逐层的微纳加工和键合方法使得很难进入上层进行SEM检查。对于当前的 Gut-on-a-Chip 设计,每个 Gut-on-a-Chip 微器件需要一个注射泵,占用 CO2 培养箱空间并防止大规模实验。需要创新来提高用户友好型平台和高通量筛选的可扩展性。
这些目前的方案允许在体外自发开发 3D 上皮层,超越了传统 3D 类器官、2D 单层和静态微器件培养系统的局限性。这种动态的体外肠道微环境可以通过引入不同细胞类型的共培养来控制。先前的研究已经探索了操纵肠道芯片微环境的方法,包括共培养肠道微生物组14,23 和外周单核细胞30。这种重构的微环境具有许多潜在的应用,包括药物测试、基础机制研究和疾病建模。重建的微环境具有广泛的应用潜力,例如药物测试23,40,41和疾病建模12,13,14,30,以及肠道形态发生的基本机制研究42。可以通过收集上清液以评估代谢物43,通过收集细胞进行基因组检查2,32,或通过使用活细胞染料或固定物目视检查细胞以进行随后的免疫荧光成像23,44来进行各种测定。
本研究提出了一种可重复的方案,用于在 Gut-on-a-Chip 平台中开发犬肠上皮层的 3D 形态发生。由此产生的 3D 上皮结构提供了更逼真的肠道微环境表示,这在各种生物医学研究中具有巨大的应用潜力。通过利用这种肠道结构,我们可以进行更多的转化研究,并有可能产生有希望的结果。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 WSU 小动物内科服务(Jillian Haines 博士、Sarah Guess 博士、Shelley Ensign LVT 博士)和 WSU VTH 临床研究协调员 Valorie Wiss 在病例招募和公民科学家(患者捐赠者)样本采集方面的支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院(K01OD030515和R21OD031903到YMA)主任办公室和日本科学促进会青年研究人员海外挑战计划(202280196到I.N.)的部分支持。 图 1A 和 图 3A 是使用 BioRender.com 创建的。
Organoid basal medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
Organoids and organoid medium | |||
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
[Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
Reagents | |||
4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
Materials and Equipment | |||
24-well culture plates | Corning | 3524 | |
87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
Software | |||
LAS X imaging software | Leica microsystems |